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中国药物化学杂志 2015年第4期25卷 306-312页

作者：肖云方浩山东大学药学院山东济南250012

p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MApKs)级联是细胞内重要的信号转导系统。研究表明,p38 MApK通路与炎症反应的发生存在密切关系,是炎症等慢性疾病治疗的重要靶标。近十几年来已有多种化学结构类型的p38α抑... 详细信息

p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MApKs)级联是细胞内重要的信号转导系统。研究表明,p38 MApK通路与炎症反应的发生存在密切关系,是炎症等慢性疾病治疗的重要靶标。近十几年来已有多种化学结构类型的p38α抑制剂被报道,部分活性化合物已进入临床试验研究。本文针对小分子p38 MApK抑制剂的结构特点、药理活性及相关临床评价研究进行综述。

关键词： p38丝裂原活化蛋白激酶 p38α抑制剂炎症

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p38α旁路活化抑制肽关键氨基酸的确定和抑制肽的优化

p38α旁路活化抑制肽关键氨基酸的确定和抑制肽的优化

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作者：裴钰君北京中医药大学

学位级别：硕士

目的：急性心肌梗塞是由于冠状动脉血栓形成后导致的组织缺血而引起。冠状动脉的再灌注对于恢复心肌功能非常重要,但刚开始恢复血液再灌注后,不但未减轻反而加重缺血所引起的细胞功能代谢障碍及结构破坏,因而将这种血液再灌注后缺血性... 详细信息

目的：急性心肌梗塞是由于冠状动脉血栓形成后导致的组织缺血而引起。冠状动脉的再灌注对于恢复心肌功能非常重要,但刚开始恢复血液再灌注后,不但未减轻反而加重缺血所引起的细胞功能代谢障碍及结构破坏,因而将这种血液再灌注后缺血性损伤加重的现象称为缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤。I/R将会带来一些不良效应,例如氧化应激,细胞内钙超载等,这些不良反应会导致心肌细胞凋亡。研究表明,在缺血再灌注过程中TAB1与p38α相互作用以及TAB1介导的p38α旁路活化在其中起关键作用。我们之前的工作通过靶向TAB1/p38α设计了一种具有细胞膜渗透性的拮抗肽pT5,并通过体内体外实验证明pT5能够选择性的抑制TAB1/p38a的相互作用,从而在大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中减轻心肌的再灌注损伤。目前,能够有效降低心肌缺血再灌注损伤的干预策略和治疗药物还非常有限。我们之前工作所设计的pT5拮抗肽有望成为相关药物的先导化合物。然而,pT5中发挥拮抗p38α旁路活化作用的关键氨基酸还是未知的。寻找pT5拮抗肽中相应的关键位点将有助于获得更精确的结构信息并对多肽进行优化,从而为心肌再灌注损伤防治药物提供先导结构。本课题是在原有拮抗肽pT5的基础上,根据pT5和p38α的空间结构,利用距离几何学、计算机图形学技术合理判别pT5与p38α相互识别的关键位置,设计出一系列pT5的突变体,并对各突变体的p38α拮抗功能进行生物学评价。方法：1.理论推测关键位点并合成突变体多肽选择距离几何学、计算机图形学技术合理判别pT5与p38a相互识别的关键位置,将第1-15个氨基酸分段做丙氨酸替换,得到6条序列。将这6条序列委托公司进行合成,得到6条纯度在95%以上的多肽。另外,设计15个氨基酸长度的对照肽,对照肽不对p38a/TAB1相互作用产生任何影响2. GST-pull down确定关键氨基酸取一定比例的GST-TAB 1和His-p38a,溶解于Tris缓冲液中,向里面加入丙氨酸替换后的pT5突变体,进行GST-pull down实验。以对照肽为阴性对照,以pT5为阳性对照,根据不同的pT5突变体对TAB1和p38α结合能力影响的强弱来确定拮抗肽中的关键氨基酸。3.体外激酶活性分析验证肽的活性取一定比例的GST-TAB 1、His-p38a和ATp,溶于激酶缓冲液中,向其中加入上述丙氨酸替换后的pT5突变体,进行体外激酶活性分析实验。以对照肽为阴性对照,以pT5为阳性对照,根据不同的p38α拮抗肽突变体对TAB1介导的p38α磷酸化能力的影响来验证肽的活性,通过其对p38α磷酸化能力影响的强弱来验证拮抗肽中的关键氨基酸。结果与讨论：利用计算机辅助分子对接、力学优化获得了p38a与pT5相互作用的复合物结构。通过距离几何学、计算机图形学技术从理论上确定了p38a与pT5相互作用的关键区域,从理论上预测了pT5中的关键氨基酸残基为Thr11和Asp12。根据预测,设计了六个pT5的突变体,进行体外生物学功能的验证。实验结果表明,pT5-5突变体失去阻断TAB1/p38a相互作用,p38a不能自我磷酸化。此外,各突变体对p38α经典活化途径中MKK6/p38a的相互作用没有影响,证实了Thr11和Asp12是pT5的关键氨基酸。意外的是我们在此过程中同时还获得两个拮抗作用更强的多肽pT5-2和pT5-4,这两个突变体展现出对TAB1/p38a相互作用更强的阻断效应及对p38α自我磷酸化的抑制。找到该拮抗肽的关键氨基酸为将来获得结构和功能更加优化的防治心肌缺血再灌注损伤的抑制肽奠定了基础。

关键词：关键位点 p38α抑制剂缺血再灌注损伤

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