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芜菁花叶病毒长春分离物p3基因的克隆、序列分析及p3蛋白抗血清的制备

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植物病理学报 2015年第6期45卷 585-591页

作者：张雅琦祝富祥王凤婷潘洪玉李向东刘金亮吉林大学植物科学学院长春130062 山东农业大学植物保护学院泰安271018

用RT-pCR方法从长春感染芜菁花叶病毒（ Turnip mosaic virus,TuMV）的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的p3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明,本研究所获得的10个TuMV分离物p3基因含1 065个核苷酸,其序列一致率为98.8%～99.6%,与G... 详细信息

用RT-pCR方法从长春感染芜菁花叶病毒（ Turnip mosaic virus,TuMV）的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的p3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明,本研究所获得的10个TuMV分离物p3基因含1 065个核苷酸,其序列一致率为98.8%～99.6%,与GenBank中其他15个TuMV分离物核苷酸一致率为80.9%～99.4%。根据p3基因核苷酸序列构建的系统进化树显示：25个TuMV分离物可分为4个组,本研究得到的10个TuMV分离物均属于basal-BR组。将TuMV JCR06分离物p3基因N端663 bp片段克隆至原核表达载体pET-28a（＋）,并在大肠杆菌BL21（DE3） pLysS中表达出分子量约为28 kDa的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了p3蛋白的特异性抗血清。以TuMV侵染的萝卜为抗原,间接ELISA测定抗血清的效价为1∶2 048。Western blotting分析表明,制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。

关键词：芜菁花叶病毒 p3基因序列分析原核表达抗血清制备

芜菁花叶病毒萝卜与甘蓝分离物p3基因的克隆与序列分析

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江西农业大学学报 2012年第2期34卷 264-269,293页

作者：叶艳英曾钢闫晓红马荣才吴才君姚磊江西农业大学农学院江西南昌330045 北京市农林科学院农业生物技术研究中心北京100097 福建农林大学植物保护学院福建福州350002 内蒙古农业大学生态环境学院内蒙古呼和浩特010018 北京市农业局北京100029

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)危害范围广,变异快,对其序列进行分析,能对病毒的演变与进化有深入的了解,为抗病育种打下基础。p3蛋白是TuMV高度容易变异的蛋白之一,包含一个对Brassica属和Raphanus属不同宿主侵染能力的决定因... 详细信息

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)危害范围广,变异快,对其序列进行分析,能对病毒的演变与进化有深入的了解,为抗病育种打下基础。p3蛋白是TuMV高度容易变异的蛋白之一,包含一个对Brassica属和Raphanus属不同宿主侵染能力的决定因子,决定了宿主范围。笔者分别从北京感病的萝卜和甘蓝上分离得到4个TuMV分离物BJ-R01和BJ-B01、BJ-B02、BJB03。利用RT-pCR克隆了这4个分离物的p3基因,测定了它们的核苷酸序列,并进行了序列分析。结果表明,4个分离物的p3基因均为1 065个碱基,编码355个氨基酸。4个分离物p3基因的同源性较高,核苷酸序列同源性在92.6%～99.3%,氨基酸同源性在93.5%～99.7%。根据系统进化树分析,4个TuMV分离物均属于world-B组。经对宿主的致病性鉴定,4个TuMV分离物均为BR致病型。4个TuMV分离物对Brassica属植物均表现出强致病性,但对Raphanus属植物致病性显现出明显的差异。

关键词：芜菁花叶病毒 p3基因克隆序列分析

RSV四川分离物p3基因原核表达及其影响本氏烟内源基因表达研究

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RSV四川分离物p3基因原核表达及其影响本氏烟内源基因表达研究

作者：郑桂贤西南大学

学位级别：硕士

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起水稻条纹叶枯病,在我国江苏、浙江和云南等省份的水稻种植区普遍发生,导致水稻40-50%的减产。RSV造成水稻叶片出现条纹症状,严重时发生心叶枯死和分蘖减少,RSV是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表成... 详细信息

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起水稻条纹叶枯病,在我国江苏、浙江和云南等省份的水稻种植区普遍发生,导致水稻40-50%的减产。RSV造成水稻叶片出现条纹症状,严重时发生心叶枯死和分蘖减少,RSV是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表成员,为负义链RNA病毒,其基因组由4条单链RNA组成,采用双义编码策略,编码7个不重叠的阅读框。RSV RNA3编码的p3蛋白是RNA沉默抑制子,在病毒侵染中起重要作用。目前有关p3基因的变异及其在植物中的作用是有关RSV的研究热点,但其具体作用及其机制仍不清楚。为深入探讨RSV p3基因的变异并获得其抗血清,本研究采用RT-pCR技术克隆了四川省RSV分离物的p3基因,利用MEGA 5.0构建其发育进化树,进行系统进化分析;将其该基因克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组质粒pET-32a/p3转化大肠杆菌BL21pLysS,经IpTG诱导后纯化蛋白,免疫家兔获得其多克隆抗体,效价为1:2000。结果表明,本研究从四川省会东县水稻种植区采集了13份表现条纹、黄化和卷曲症状的水稻病叶,利用RSV Cp的单克隆抗体对其进行了斑点免疫ELISA(Dot-ELISE)检测,结果从13份样品中有9份样品检测到RSV。提取阳性样品总RNA,利用RSV p3基因特异性引物经RT-pCR扩增获得636nt的片段。系统进化分析显示四川分离物Huid04(KX611339)与云南分离物KunM08(JQ927423)和DaL08(JQ927420)的核苷酸相似性最高,分别为96.86%和97.01%,具有较近的亲缘关系。本实验室前期研究发现转p3水稻对稻瘟病(rice blast disease,Magnaporthe oryzae)和水稻白叶枯病(bacterial blight,Xanthomonas oryzae)有一定的抗性;RSV侵染转p3本氏烟时,与野生型相比转基因本氏烟中病毒积累量更少,几乎没有病毒症状。为了探究p3基因在本氏烟植株体内的功能,本研究以转p3本氏烟和野生型本氏烟为材料,采用Trizol法提取本氏烟的总RNA,进行转录组测序。结果p3基因在本氏烟中表达后一共有2533个差异表达基因(筛选条件,以茄科为参考基因组p值≤0.05并且差异倍数|log2Foldchange|≥1),其中有597个基因上调的,有1936个基因下调。这些差异基因聚合于43个GO功能大类和59条KEGG通路,其中主要的通路是核糖体(ko03010),光合作用(ko00195),光合作用天线蛋白(ko00196)和碳代谢(ko01200),这4条通路中每个通路都有超过80个的差异表达基因聚集。在转录组测序结果中选择了12个差异表达基因进行RT-qpCR验证转录组结果,验证结果与转录测序结果相一致。在上述4个关键通路和差异倍数大于2的差异表达的基因中,筛选后得到了10个与核染色体、抗性基因、光合作用途径和能量代谢途径等预测功能有关的基因。为明确p3本氏烟转录组中的候选差异表达基因的功能,我们利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术和马铃薯X病毒(potato virus X,pVX)介导的基因过表达技术来验证基因对症状形成的作用。结果发现TRV介导组蛋白相关基因(***-2,***-3,***-5)的沉默会引起叶片皱缩畸形或褪绿,而这些基因造成的症状具有不同程度的皱缩或褪绿。无论是过表达还是沉默分析与热激转录因子相关的基因(***),结果均表明该基因与褪绿或绿斑驳症状形成相关。TRV介导能量代谢有关的基因(***-2和***-2)的沉默之后分别出现不同程度的新叶卷曲、畸形和黄脉。TRV介导抗性基因(***-2)的沉默,引起了严重的新叶卷曲和畸形。沉默光合作用系统Ⅰ的组成装备相关基因(***-2和***-4),病毒症状与对照无明显差异。过表达硫氰酸酶相关基因(***-2)后,植株叶片表现出绿斑驳症状。综上所述,本研究在四川省会东县发现疑似感染RSV的水稻,结果发现RSV在四川会东县水稻上发生危害;对RSV四川分离物p3进行了进化分析发现,其与云南分离物的亲缘关系较近;对RSV四川分离物p3进行原核表达,制备了可检测p3蛋白的多克隆抗体;对转p3本氏烟进行转录组分析,结果发现p3基因表达影响了本氏烟内源基因表达;对10个差异基因进行沉默和过表达分析,结果发现这些基因影响本氏烟的正常生长。

关键词：水稻条纹病毒 p3基因抗体制备转录组测序基因表达

O型口蹄疫病毒疫苗株p3基因的克隆与序列分析

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O型口蹄疫病毒疫苗株P3基因的克隆与序列分析

作者：张晓凤内蒙古农业大学

学位级别：硕士

本试验从口蹄疫病毒疫苗株FMDV/O/NMxw/10/99和FMDV/O/NMzg/7/99乳鼠传代毒中提取病毒RNA,采用RT-pCR法分段扩增口蹄疫病毒的3ABC和3D-3,UTR基因片段,然后进行克隆和测序。用DNAStar软件对测定的核苷酸序列进行拼接,获得包含p3区全部基... 详细信息

本试验从口蹄疫病毒疫苗株FMDV/O/NMxw/10/99和FMDV/O/NMzg/7/99乳鼠传代毒中提取病毒RNA,采用RT-pCR法分段扩增口蹄疫病毒的3ABC和3D-3,UTR基因片段,然后进行克隆和测序。用DNAStar软件对测定的核苷酸序列进行拼接,获得包含p3区全部基因的序列,O/NMxw/10/99、O/NMzg/7/99毒株p3区基因全长均为2691nt,编码897aa。3A、3B、3C和3D基因分别含有429、213、639、1410nt,分别编码143、71、213及470aa。两毒株3A基因在276～305位缺少30nt,10个氨基酸。在3D编码区末端有整个ORF的终止密码子TAA。O/NMxw/10/99、O/NMzg/7/99 p3编码区核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.4%、97.3%。NMxw/10/99、NMzg/7/99与参考序列Chu-pei、Yunlin/97 p3编码区核苷酸和氨基酸同源性分别在94.8%～96.2%、97.3%～98.2%,与参考序列SAR/2000、JpN/2000、Tibet/CHA/99、TAW/99 B0V、AKS58、Asia1/YNBS/58、C3/Argentina/85和A12/119/Kent/UK/32 p3编码区核苷酸同源性在84.7%～86.9%之间,氨基酸同源性在92.0%～93.9%之间。在各基因中,3A基因突变率最高。3B、3C和3D基因突变率低,序列比较保守,这与各自的功能有一定的关系。p3编码区内A-G和C-T的转换率较高,是点突变的热点核苷酸,是影响氨基酸稳定因素之一。

关键词：口蹄疫病毒 p3基因克隆序列分析

六安地区高粱花叶病毒p3基因的克隆和序列测定

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皖西学院学报 2006年第2期22卷 62-65页

作者：余茂耘韦传宝皖西学院化学与生命科学系安徽六安237012

从六安产甘蔗病叶中提取总RNA,逆转录获得甘蔗花叶病毒(Sorghun mosaic virus,SrMV)基因组cDNA。设计p3基因特异引物,通过pCR扩增p3基因,并将p3基因cDNA克隆、测序。

关键词：高粱花叶病毒 p3基因克隆序列

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒Gp3基因的重组伪狂犬病病毒的构建

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中国生物化学与分子生物学报 2003年第3期19卷 391-395页

作者：钱平李祥敏陈焕春金梅林何启盖华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉430070

Based on the nucleotide sequence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (pRRSV) CH 1a strain, a pair of primers was designed. The Gp3 gene of pRRSV HB 1 strain was cloned by RT pCR. The sequences analysis showed that the Gp3 genes of HB 1 and CH 1a strain had 91% and 89% homology, at the levels of the nucleotide and amino acid, respectively. The Gp3 gene was digested by Bam HⅠ and Eco RⅠ, and the fragment was inserted into the same sites of the universal vector ppgG uni. A recombinant virus transfer vector ppgG Gp3 expressing pRRSV Gp3 gene was constructed. The transfer vector ppgG Gp3 digested by Kpn Ⅰ was co transfected pK 15 cells with the pRV TK -/gG -/LacZ + genomic DNA digested by Eco RⅠ using liposome method. The recombinant virus was purified by the phage test and pCR amplification. The expression of Gp3 gene was indicated by Western blot analysis using anti sera. A recombinant pRV virus expressing pRRSV Gp3 gene was obtained. The recombinant virus is very useful in the research of the genetic engineering vaccine against pseudorabies virus and pRRS virus.

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 p3基因伪狂犬病病毒疫苗

不同寄主来源的马铃薯Y病毒群体遗传结构的比较分析

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遗传 2015年第3期37卷 292-301页

作者：常飞邹文超高芳銮沈建国詹家绥福建省植物病毒学重点实验室福建农林大学植物病毒研究所福州350002 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心福州350001

文章以马铃薯Y病毒（potato virus Y,pVY）p3和pipo基因为分子标记,比较分析烟草和马铃薯两个寄主的pVY遗传多样性和群体分化,并评估突变、选择、基因流等遗传力所起的作用。通过p3和pipo基因计算获得的烟草和马铃薯群体分化指数FST分别... 详细信息

文章以马铃薯Y病毒（potato virus Y,pVY）p3和pipo基因为分子标记,比较分析烟草和马铃薯两个寄主的pVY遗传多样性和群体分化,并评估突变、选择、基因流等遗传力所起的作用。通过p3和pipo基因计算获得的烟草和马铃薯群体分化指数FST分别为0.116和0.120,且统计检验差异显著,表明烟草和马铃薯寄主的pVY之间中度分化。变异分析结果显示,烟草分离物p3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为85.2%~100%和76.5%~100%,而马铃薯分离物的p3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为95.7%~100%和93.0%~100%,表明烟草pVY变异程度高于马铃薯。同时,p3基因内检测到大量的净化选择位点,表明该基因大部分位点的变异为有害突变,在进化过程中被剔除。此外,p3基因内还检测到两个显著正向选择位点,表明这两个位点的变异为有益突变,有利于病毒的生存竞争。在pipo基因中未检测到显著的选择位点,表明该基因上的变异基本不受自然选择影响。通过p3和pipo基因计算烟草和马铃薯群体间的基因流Nm值分别为1.91和1.83,表明这两个群体间存在较强的基因交流。以上结果表明,来源于烟草和马铃薯寄主的pVY遗传差异显著,突变、自然选择以及基因流都影响两者的遗传多样性及遗传分化程度。

关键词：马铃薯Y病毒 p3基因 pipo基因遗传变异

O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒双重荧光定量RT-pCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2024年第6期46卷 601-607页

作者：张展陈信全冯国金黄慧贤利光辉江门海关技术中心广东江门529000 汕头海关技术中心广东汕头515000

为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O Vp2基因序列和SVV p3基因序列,采用primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定... 详细信息

为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O Vp2基因序列和SVV p3基因序列,采用primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定量RT-pCR方法。利用该方法检测临床常见猪病毒,结果显示可同时检测出FMDV-O和SVV核酸,且与猪水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(pRRSV)、猪细小病毒(ppV)、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)、A-1型口蹄疫病毒(FMDVA-1)核酸均无交叉反应,并可检测到FMDV-O panAsia株、cathay株、Ind-2001株和Mya-98株等主要流行株,特异性强;该方法对含FMDV-O和SVV拼接质粒标准品的最低检测限为7.17×10^(2)拷贝/μL,敏感性高;利用该方法检测了同一时间和不同时间提取的3种不同浓度的质粒标准品,结果显示批内和批间重复性试验Ct值的变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验所建立的方法对30份临床样品进行检测,结果与各病毒单一荧光定量RT-pCR检测结果一致。本研究建立的FMDV-O和SVV双重荧光定量RT-pCR方法能够快速准确的鉴别检测FMDV-O和SVV,为口岸检疫的快速通关提供了技术手段。

关键词： O型口蹄疫病毒塞内卡病毒双重RT-qpCR方法 p3基因 Vp2基因