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p27kip1基因对食管癌细胞DNA复制及蛋白质合成的影响

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中国病理生理杂志 2004年第1期20卷 100-102页

作者：童强王小虎谢国建吴清明郧阳医学院附属太和医院消化内科湖北十堰442000

目的 :研究p2 7kip1基因对人食管癌细胞EC -970 6的DNA复制及蛋白质合成的影响。方法 :重组体腺病毒Ad -p2 7kip1转染EC -970 6细胞 ,采用细胞生长计数、[3H] -TdR、[3H] -Leucine掺入法、流式细胞术 ,研究其对食管癌细胞DNA复制及蛋白... 详细信息

目的 :研究p2 7kip1基因对人食管癌细胞EC -970 6的DNA复制及蛋白质合成的影响。方法 :重组体腺病毒Ad -p2 7kip1转染EC -970 6细胞 ,采用细胞生长计数、[3H] -TdR、[3H] -Leucine掺入法、流式细胞术 ,研究其对食管癌细胞DNA复制及蛋白合成的影响。结果 :Ad -p2 7kip1组细胞生长明显受抑 ,[3H] -TdR和 [3H ] -Leucine掺入量均明显减少 ,与对照组比较p p2 7可有效抑制食管癌细胞的增殖活性 ,这与其抑制食管癌细胞DNA复制及蛋白质合成有关。

关键词： p27kip1基因食管肿瘤 DNA复制蛋白质合成癌细胞 EC-9706细胞

p27kip1基因在红系发育过程中的功能研究

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p27kip1基因在红系发育过程中的功能研究

作者：徐凯凯郑州大学

学位级别：硕士

目的红细胞是血液的重要组成成分,其主要功能就是通过血液循环来运输氧气到达机体的各个部位,以促进机体的正常运行。但研究证实人成熟红细胞的寿命只有120天左右,为了维持机体内红细胞数量的稳定,成年骨髓中每秒需产生约200万个红细胞... 详细信息

目的红细胞是血液的重要组成成分,其主要功能就是通过血液循环来运输氧气到达机体的各个部位,以促进机体的正常运行。但研究证实人成熟红细胞的寿命只有120天左右,为了维持机体内红细胞数量的稳定,成年骨髓中每秒需产生约200万个红细胞,此过程就被称为红系发育。它是从最初的造血干细胞开始,依次经历红系早期分化、红系终末分化以及脱核成熟等三个大阶段,才形成了功能齐全的成熟红细胞。这是一个受到多种机制严格调控的复杂过程,一旦某个发育过程紊乱就会引起相应血液疾病的发生,在对这些血液疾病的研究中,发现诸如真性红细胞增多症等多种血液病病人中,p27kip1(以下简写为“p27”)基因一般都会发生突变,导致其表达量下调,且目前已有多篇文献报道该基因与红系相关血液病有密切联系。因此,在红系发育过程中研究p27基因具有十分重要的实际意义。方法首先运用生物信息学方法对p27及其家族进行基因结构、蛋白结构及表达情况和进化关系等分析。成功构建p27敲低载体并用RT-q pCR来检测其表达,以验证敲低效率。运用血细胞计数法、联苯胺染色法、流式细胞术等方法来检测敲低p27基因后对K562、HEL和CD34+细胞的增殖、分化、凋亡、周期及脱核的影响。结果首先通过生物信息学分析发现,p27基因及其家族成员的进化树共存在6大分支,不同分支的成员之间进化距离差异较小,而成支的成员几乎为同一类型物种;氨基酸序列比对Identity值为40%-60%,说明动物中序列的保守性明显高于植物;最后在结构上都含有多个保守性较高的功能结构域。此外,外周血RNA-Seq数据显示p27基因在早期分化阶段表达量较低,而在红系终末分化阶段表达显著升高。在p27基因敲低后,与对照组相比,实验组K562和HEL细胞连续4天的培养中,细胞生长明显加快,细胞分化则显著减慢,而细胞凋亡无变化。进一步由外周血经磁珠分选得到CD34+细胞,在21天的连续培养中,p27基因敲低也轻微加快了细胞生长,在第6-7天的红系早期分化检测中,CD34+CD36-的BFU-E和CD34-CD36+的CFU-E没有明显变化,在第9-15天的红系终末分化检测中,实验组细胞Band 3和α4 integrin表达减少,此外第14-20天的Syto16染色中阳性细胞也逐渐减少,第14-16天的MGG染色中发现有核畸形细胞出现。结论首先p27及其家族成员广泛存在于动植物中,在动物中保守性更高。其功能结构域在进化上也极为保守。RNA-Seq数据显示p27基因红系终末分化阶段高表达。然后在K562和HEL细胞系中,敲低p27基因会促进细胞生长,抑制细胞分化,促进细胞周期进程,而细胞凋亡无显著性变化。最后在CD34+细胞中,敲低p27基因对细胞生长有轻微促进,对红系早期分化无影响,但对红系终末分化有明显抑制,另外对脱核也有明显抑制且会出现核畸形现象。

关键词： p27kip1基因红系发育生物信息学分析 RNAi

KiSS-1和p27kip1基因共转染骨肉瘤MG-63细胞体外的实验研究

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KiSS-1和P27kip1基因共转染骨肉瘤MG-63细胞体外的实验研究

作者：白国昌福建医科大学

学位级别：硕士

[目的]: 构建能在真核细胞内高效表达KiSS-1和p27基因的共表达质粒pIRES- KiSS-1- p27,纯化能同时分别稳定表达KiSS-1基因、p27基因、KiSS-1和p27基因的骨肉瘤MG-63细胞株,分别从mRNA和蛋白质水平检测各细胞组中KiSS-1和p27基因的表达水... 详细信息

[目的]: 构建能在真核细胞内高效表达KiSS-1和p27基因的共表达质粒pIRES- KiSS-1- p27,纯化能同时分别稳定表达KiSS-1基因、p27基因、KiSS-1和p27基因的骨肉瘤MG-63细胞株,分别从mRNA和蛋白质水平检测各细胞组中KiSS-1和p27基因的表达水平,并研究共表达腺病毒载体介导的KiSS-1和p27基因体外转染骨肉瘤MG63细胞后,对细胞生长增殖及细胞周期的影响。为进一步应用该共表达载体对骨肉瘤进行基因治疗的研究提供实验依据。 [方法]: 1、KiSS-1、p27基因共表达载体的构建和测序鉴定。 2、阳离子脂质体法介导KiSS-1基因和p27基因分别或共转染骨肉瘤MG-63细胞,并通过G418筛选获得相应的细胞组。 3、通过RT-pCR和Western blot法分别检测转染前后各组骨肉瘤MG63细胞KiSS-1和p27基因转录和蛋白水平表达的变化情况。 4、细胞增殖实验检测转染后各组骨肉瘤MG63细胞生长增殖能力变化。 5、流式细胞仪检测转染前后各组骨肉瘤MG63细胞周期的变化。 [结果]: 1、KiSS-1、p27共表达载体的构建:胎盘组织中抽提总RNA并通过RT-pCR分别获得各目的基因的ORF,将目的基因通过酶切、连接导入共表达载体pIRES中,送测序结果无误。 2、阳性脂质体法分别介导pIRES-KiSS-1、pIRES-p27、pIRES- KiSS-1- p27转染骨肉瘤MG-63细胞株,经G418抗性筛选。获得稳定表达KiSS-1、p27及KiSS-1和p27的骨肉瘤MG-63细胞组。 3、转染前后各骨肉瘤MG63细胞组的KiSS-1基因、p27基因转录及蛋白表达水平有明显差异。 4、共表达KiSS-1和p27基因的骨肉瘤MG63细胞较表达KiSS-1或p27基因的骨肉瘤MG63细胞出现生长增殖能力降低,并出现细胞周期明显阻滞于G1/S期。与空载体组比,pIRES-p27MG63细胞和pIRES-KiSS-1MG63细胞均出现明显生长增殖能力降低,其细胞周期分别明显受阻滞于G1/S期和G2/M期。 [结论]: 1、利用脂质体将KiSS-1基因和p27基因转染到骨肉瘤MG63细胞是可行有效、稳定的。 2、pIRES-KiSS-1- p27能够介导目的基因在骨肉瘤MG63细胞内稳定、有效地表达。 3、与单基因转染后的骨肉瘤MG63细胞相比,双基因共表达转染后的骨肉瘤MG63细胞增殖能力受到更明显的抑制。 4、联合KiSS-1基因、p27基因治疗骨肉瘤可能成为骨肉瘤基因治疗的一种比较有效的方法。同时,为进一步联合KiSS-1基因和p27基因治疗骨肉瘤提供了实验基础。

关键词：骨肉瘤 KiSS-1基因 p27kip1基因基因重组 pIRES 腺病毒载体联合基因治疗

p21Waf1-p27kip1基因联合转染对乳腺癌细胞增殖和中心体复制的影响

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P21Waf1-p27Kip1基因联合转染对乳腺癌细胞增殖和中心体复制的影响

作者：姜丹丹青岛大学

学位级别：硕士

[目的]探讨外源性p21Waf1-p27kip1基因联合转染对人乳腺癌细胞细胞增殖及中心体复制的影响和意义。[方法]应用脂质体介导法分别将构建的pIRES-p21Waf1、pIRES-p27kip1、pIRES-p21Waf1-p27kip1真核表达载体,转染入常规培养的人乳腺癌细胞... 详细信息

[目的]探讨外源性p21Waf1-p27kip1基因联合转染对人乳腺癌细胞细胞增殖及中心体复制的影响和意义。[方法]应用脂质体介导法分别将构建的pIRES-p21Waf1、pIRES-p27kip1、pIRES-p21Waf1-p27kip1真核表达载体,转染入常规培养的人乳腺癌细胞系MCF-7,未转染组、转染空质粒组细胞做对照,Western免疫印迹法验证转染前后p21Waf1、p27kip1基因蛋白表达情况;MTT法绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期DNA分布变化;免疫荧光技术检测转染前后中心体复制的变化情况。[结果]Western免疫印迹法证实p21Waf1、p27kip1、p21Waf1-p27kip1基因转染24h后,其蛋白表达量明显增多(pp27±1.74)%,对照组则为(47.28±2.25)%、(33.52±1.97)%,中心体复制异常的乳腺癌细胞数较转染前(13.47±0.33)%明显减少：(5.07±0.38)%,(6.28±0.35)%,(3.47±0.23)%,两两比较差异显著(pp21Waf1和p27kip1基因转染可抑制人乳腺癌细胞的增殖及中心体的异常复制,二者联合转染时效果显著。提示,乳腺癌的发生、发展是多基因、多因素共同参与的过程,p21Waf1和p27kip1在调控细胞增殖及中心体复制方面具有协同作用,对于p21Waf1、p27kip1基因失活、低表达或不表达的乳腺癌,联合转染外源性p21Waf1、p27kip1基因不失为一种有效的治疗手段。

关键词：乳腺癌中心体细胞增殖 p21Waf1基因 p27kip1基因

腺病毒介导的p27kip1基因转移对食管癌细胞及裸鼠移植瘤生长的抑制作用

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郧阳医学院学报 2004年第5期23卷 257-261,269,F002页

作者：吴清明张卫国童强李胜保王小虎谢国建郧阳医学院附属太和医院消化内科湖北十堰442000

目的 :研究p2 7kip1基因转移对食管癌的体内、外抑制作用 ,并探讨其抑癌机制。方法 :①构建携带人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒 (Ad p2 7kip1) ;②将Ad p2 7kip1转染人食管癌细胞Eca970 6 ,MTT法、3 H TdR和3 H Leucine掺入试验检测对细胞... 详细信息

目的 :研究p2 7kip1基因转移对食管癌的体内、外抑制作用 ,并探讨其抑癌机制。方法 :①构建携带人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒 (Ad p2 7kip1) ;②将Ad p2 7kip1转染人食管癌细胞Eca970 6 ,MTT法、3 H TdR和3 H Leucine掺入试验检测对细胞增殖的影响 ,流式细胞仪 (FCM)、DNA片段分析检测对细胞周期和凋亡的影响 ,TRAppCR -ELISA法检测端粒酶活性 ,免疫细胞化学法及Westernblotting法检测p2 7kip1和Survivin的表达 ;③Ad p2 7kip1直接注射入人食管癌裸鼠移植瘤中 ,观测抑瘤效应 ,并检测p2 7kip1和Survivin的表达。结果 :①Ad p2 7kip1转染食管癌细胞后 ,细胞增殖明显受抑制 ,G0 /G1期细胞比例增加 ,并出现明显的亚二倍体凋亡峰和特征性的凋亡梯状条带 ,细胞端粒酶活性降低 ,p2 7kip1表达增强 ,Survivin表达降低 ;②采用p2 7kip1基因治疗 ,食管癌裸鼠移植瘤生长明显受抑制 ,肿瘤生长抑制率达 6 4 .1% ,移植瘤中p2 7kip1表达增强 ,Survivin表达降低。结论 :p2 7kip1基因转移对食管癌具有较显著的体内、外抑制作用 ,其机制是增强p2 7kip1表达、抑制Survivin表达 ,使细胞产生G1期阻滞 ,抑制端粒酶活性 ,并诱导凋亡 ,表明该基因疗法是食管癌治疗的新途径。

关键词： p27kip1基因裸鼠移植瘤 Survivin表达食管癌细胞治疗抑制作用转移 DNA片段分析转染二倍体

5-Aza-CdR对胃癌细胞系p27kip1基因异常甲基化的影响

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实用药物与临床 2011年第2期14卷 101-103页

作者：王贺玲张建李岩王学清沈阳市第一人民医院消化内科沈阳110041 中国医科大学附属盛京医院消化内科沈阳110004

目的探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌细胞系SGC7901的p27kip1基因异常甲基化及表达的影响。方法选择不同浓度的5-Aza-CdR处理体外培养的SGC7901细胞后,用MSp法检测用药前后细胞中p27kip1基因的甲基化状态;RT-pCR法检测用药前... 详细信息

目的探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌细胞系SGC7901的p27kip1基因异常甲基化及表达的影响。方法选择不同浓度的5-Aza-CdR处理体外培养的SGC7901细胞后,用MSp法检测用药前后细胞中p27kip1基因的甲基化状态;RT-pCR法检测用药前后细胞中p27kip1的mRNA及蛋白表达的变化。结果 p27kip1基因的甲基化状态得到了逆转,p27kip1基因的mRNA和蛋白表达得到增加。结论 SGC7901细胞中p27kip1基因的表达情况与其甲基化状态的改变有关。

关键词： 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 p27kip1基因胃癌甲基化

Jab1和p27^(kip1)基因在喉鳞状细胞癌组织和喉癌Hep-2细胞中的表达及意义

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2012年第6期26卷 252-255,259页

作者：李发萍曹华吴玉瑛广东省人民医院(广东省医学科学院)耳鼻咽喉科广州510080 郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉科

目的:探讨Jab1和p27kip1基因在喉鳞状细胞癌组织和喉癌Hep-2细胞中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学方法检测50例喉鳞状细胞癌组织和10例癌旁正常组织中Jab1和p27kip1的表达。采用人工合成Jab1siRNAⅡ用脂质体2000包裹后转染Hep-2细... 详细信息

目的:探讨Jab1和p27kip1基因在喉鳞状细胞癌组织和喉癌Hep-2细胞中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学方法检测50例喉鳞状细胞癌组织和10例癌旁正常组织中Jab1和p27kip1的表达。采用人工合成Jab1siRNAⅡ用脂质体2000包裹后转染Hep-2细胞,用RT-pCR方法分析转染后喉癌细胞中Jab1和p27kip1基因的表达情况。结果:Jab1和p27kip1蛋白的阳性表达定位为细胞核中,Jab1在人喉鳞状细胞癌组织中高表达,正常喉黏膜中不表达或弱表达;p27kip1在人喉癌组织中弱表达,正常喉黏膜中强表达;两者呈负相关。Jab1siRNAⅡ可降低Jab1mRNA表达,并且随着时间的延长,Jab1mRNAⅡ在Hep-2细胞中的表达逐渐减弱,而p27kip1 mRNA的表达则无明显变化。结论:Jab1在人喉鳞状细胞癌组织中表达增强,正常喉黏膜中不表达或弱表达;p27kip1则正好相反。两者在喉癌中的表达呈负相关。Jab1siRNAⅡ可以特异性降低Jab1mRNA在喉癌Hep-2细胞中的表达,为进一步研究Jab1基因在喉癌中的作用奠定了基础。

关键词：喉鳞状细胞癌 Jab1基因 p27kip1基因 RNA干扰 Hep-2细胞 RT-pCR

p14^(ARF)和p27^(kip1)基因甲基化与鼻咽癌的临床相关性研究

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中国卫生检验杂志 2013年第12期23卷 2573-2575,2618页

作者：王克义倪海峰朱华怀磊冷建杭杭州市第一人民医院中心实验室浙江杭州310006 杭州市第一人民医院耳鼻咽喉科浙江杭州310006

目的探讨鼻咽癌组织中p14ARF和p27kip 1基因启动子区甲基化状态在鼻咽癌早期分子诊断和治疗中的作用。方法应用甲基化特异性pCR方法对65例鼻咽癌组织(鼻咽癌组)和30例正常鼻咽上皮组织(对照组)中的p14ARF和p27kip 1基因启动子区甲基化... 详细信息

目的探讨鼻咽癌组织中p14ARF和p27kip 1基因启动子区甲基化状态在鼻咽癌早期分子诊断和治疗中的作用。方法应用甲基化特异性pCR方法对65例鼻咽癌组织(鼻咽癌组)和30例正常鼻咽上皮组织(对照组)中的p14ARF和p27kip 1基因启动子区甲基化状态进行检测。结果鼻咽癌组中p14ARF和p27kip 1基因启动子区甲基化阳性率分别为18.5%(12/65)和61.5%(40/65),两者总检出率为67.7%(44/65);而对照组中均未检测到p14ARF和p27kip 1基因启动子区甲基化;鼻咽癌组中p14ARF和p27kip 1基因启动子区甲基化与其临床分期和病理特征均无明显相关性(p>0.05)。同时,p14ARF基因甲基化和p27kip 1基因甲基化无明显相关性(r=0.05,p>0.05)。结论 p14ARF和p27kip 1基因甲基化可能是鼻咽癌早期分子事件,可作为鼻咽癌发生的早期诊断指标及甲基化基因治疗的靶点。

关键词：鼻咽癌 p14ARF基因 p27kip1基因甲基化

子宫内膜癌组织中基因p16和p27kip1的表达及其临床意义

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肿瘤研究与临床 2006年第12期18卷 834-835页

作者：徐锦屏张芸浙江省台州市中心医院病理科广东省佛山妇儿医院病理科

目的研究p16,p27kip1在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化技术对65例子宫内膜癌组织进行表达检测,结合临床病理学指标进行分析。结果p16,p27kip1在65例子宫内膜癌组织的阳性表达率分别是47.7%和41.5%。p16,p27kip1... 详细信息

目的研究p16,p27kip1在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化技术对65例子宫内膜癌组织进行表达检测,结合临床病理学指标进行分析。结果p16,p27kip1在65例子宫内膜癌组织的阳性表达率分别是47.7%和41.5%。p16,p27kip1在65例子宫内膜癌组织的阳性表达率均与组织学分级密切相关,在组织分化好者阳性表达率显著高于组织分化差者(均pp16,p27kip1在子宫内膜癌的发生、发展中起着重要的调控作用。p16和p27kip1的缺失表达与子宫内膜癌的生物学行为密切相关,对判断子宫内膜癌的预后和指导临床治疗均有重要意义。

关键词：子宫内膜癌 p16基因 p27kip1基因