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C末端缺失的GATA4通过增强AKT/FOxO的表达促进心肌细胞凋亡

C末端缺失的GATA4通过增强AKT/FOXO的表达促进心肌细胞凋亡

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作者：陈欣欣南京医科大学

学位级别：硕士

目的:GATA4是参与心脏发育的重要转录因子。本课题组前期在室间隔缺损(ventricular septal defect,VsD)患者心肌组织中发现了一种特殊类型的GATA4突变(p.s335x),此突变可使终止密码子提前产生,导致GATA4的C末端缺失。为进一步了解p.s335... 详细信息

目的:GATA4是参与心脏发育的重要转录因子。本课题组前期在室间隔缺损(ventricular septal defect,VsD)患者心肌组织中发现了一种特殊类型的GATA4突变(p.s335x),此突变可使终止密码子提前产生,导致GATA4的C末端缺失。为进一步了解p.s335x突变对心肌细胞的作用及其机制,我们使用体外培养的大鼠心肌细胞株H9C2,转染野生型GATA4(pcDNA6-GATA4-WT,WT)及突变型GATA4p.s335x(pcDNA6-GATA4-MU,MU)载体,验证转染效率后,考察GATA4 p.s335x对H9C2细胞凋亡的影响及经典凋亡通路AKT/FOxO/Bcl-2的参与作用。在此基础上,我们进一步筛选了除经典Bcl-2凋亡途径之外,GATA4 p.s335x对其他凋亡相关的下游分子/信号通路的调控作用。方法:大鼠心肌细胞H9C2体外培养,转染WT、MU及对照(pcDNA6,EV)载体,通过收集转染后H9C2细胞的RNA和总蛋白,分别使用Real-Time pCR和Western blot验证细胞中GATA4 mRNA和蛋白表达,鉴定转染成功。进一步使用TUNEL法检测细胞凋亡;通过Real-Time pCR和Western blot分别测定经典凋亡通路AKT/FOxO/Bcl-2相关因子的mRNA表达、蛋白表达及关键酶的磷酸化水平;以pCR Array技术筛选新的凋亡信号通路。结果:Real-Time pCR结果证实,WT和MU组GATA4 mRNA表达显著升高;Western blot结果显示:WT和MU组GATA4蛋白表达显著增多,且较之WT组,MU组GATA4蛋白分子量较低(WT组:50KDa,MU组:40KDa);上述结果提示GATA4WT和MU转染成功。TUNEL结果表明,未加TNF时转染MU的H9C2细胞比转染WT的H9C2细胞内可见更明显的凋亡,加入TNF(100ng/ml)后,MU与EV组凋亡明显高于WT组,提示GATA4 WT对凋亡具有一定抑制作用,该作用在GATA4 MU条件下被反转。Western blot结果显示:MU组中调促进凋亡信号GsK3β,p-GsK3 β,FOx03、BAx表达上调,抑制凋亡信号AKT、p-AKT、Bcl-2表达降低;而Real-Time pCR结果显示上述因子的mRNA表达没有差异。pCR Array筛选出下列基因表达在MU组中升高:Tp53、Tp53bp2、Bcl-10、Casp3、Gadd45 α、Jun、Mapk14、Mapk8、pdgfra、pdk2、pdpk1、Tsc1,Casp7、Ltbr、Mapk8ip1、Tnfsf10、pdk1、pik3r1。结论:GATA4 p.s335x不具备野生型GATA4抑制细胞凋亡的功能;该现象可能与经典的AKT/FOxO/Bcl-2途径有关;此外,C末端缺失的GATA4 p.s335x还可能作用于非典型凋亡途径,包括:p53/Tnfsf10、MApK/Gadd45α、JNK/c-jun、pDK1/pKC/Bcl10/caspase7 等。

关键词： GATA4 p.s335x 凋亡 H9C2 Bcl-2 pCR Array

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