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gsk3β在乳腺癌细胞系中的表达及其与p38MApK相关性的研究

GSK3β在乳腺癌细胞系中的表达及其与P38MAPK相关性的研究

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作者：徐曼中国医科大学

学位级别：硕士

前言gsk3β是糖原合成激酶3(glycogen synthesis kinase, gsk-3)的亚型之一。近年来越来越多的研究证实,gsk3β不仅仅参与糖原代谢过程,它更是一个多功能激酶,在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化、细胞运动以及肿瘤发生等方面都扮演了重要... 详细信息

前言gsk3β是糖原合成激酶3(glycogen synthesis kinase, gsk-3)的亚型之一。近年来越来越多的研究证实,gsk3β不仅仅参与糖原代谢过程,它更是一个多功能激酶,在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化、细胞运动以及肿瘤发生等方面都扮演了重要角色。近来研究发现,gsk3β在乳腺癌的发生发展过程中起到了重要作用,并参与了乳腺癌细胞生长和细胞凋亡信号通路调控。但是,gsk3β是否参与了乳腺癌细胞的转移仍然是个有待于研究的问题。p38MApK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MApK)家族的重要成员。最近,p38MApK信号通路因以正性调节的方式参与肿瘤的侵袭转移过程而倍受关注。为此,本研究检测了p-p38, p-gsk3βser9, gsk3β在乳腺癌细胞系中的表达情况,并进一步研究gsk3β在乳腺癌侵袭中的作用以及gsk3β和p38MApK通路的关系,为乳腺癌治疗提供相应的理论依据。材料与方法1、材料(1)细胞系人乳腺癌细胞系MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435s,原购自北京协和基础医学院细胞中心,本实验由中国医科大学已有的细胞复苏而得。(2)主要试剂鼠抗人p-p38抗体购自Cell signaling公司。兔抗人gsk3β抗体购自Bioworld公司。兔抗人p-gsk3pser9抗体购自Santa公司。p38MApK特异性抑制剂SB203580购自美国Calbiochem公司。gsk3p特异性抑制剂SB216763购自Cayman公司。Transwell小室(孔径8um)购自Corning公司。2、方法(1) Western印迹法收集细胞加入RIpA buffer裂解液,超声处理,高速低温离心提取总蛋白,用Bradford法进行蛋白浓度测定。SDS-pAGE电泳,转印,封闭后加相应一抗、二抗。ECL发光,观察拍照,进行灰度值测定。(2)免疫荧光染色取对数生长细胞接种到孔板中。固定、TritonX-100处理、封闭后加相应一抗、二抗,复染细胞核,荧光显微镜观察拍照。(3) Transwell实验Transwell小室接种细胞后培养,擦去上室内细胞后固定,染色,观察拍照,进行细胞计数。3、统计学分析应用SpSS13.0统计软件行数据处理：采用t检验分析Western Blot图像灰度值、Transwell穿膜细胞数,用LSD-t检验对各样本均数行两两比较,pp-p38、p-gsk3βser9, gsk3β在乳腺癌细胞系中的表达(1)Western印迹法检测,在三种乳腺癌细胞系MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435s中,p-gsk3βser9和p-p38的表达呈递增趋势,gsk3β表达无明显差别。(2)选取p-p38, p-gsk3βser9均高表达的高侵袭高转移细胞系MDA-MB-435s,免疫荧光定位显示：p-p38在MDA-MB-435s中主要表达在细胞核,细胞浆中仅有微弱的表达;而p-gsk3pser9在MDA-MB-435s中主要表达在细胞浆,细胞核中仅有微弱的表达。2、gsk3β抑制剂LiCL和SB216763作用MDA-MB-435s细胞系24h后p-gsk3βser9和gsk3β变化(1) Western印迹法检测显示：LiCL和SB216763均可上调p-gsk3βser9表达水平,gsk3p无明显变化。(2)免疫荧光定位显示：SB216763作用MDA-MB-435s细胞系24h后p-gsk3βser9胞浆表达减少,核表达增多。(3)Transwell实验显示：SB216763能浓度依赖性地增加乳腺癌细胞MDA-MB-435s的侵袭转移潜能。3、p38MApK抑制剂SB203580对gsk3β活性的影响Western印迹法检测显示,SB203580浓度性依赖性的地下调MDA-MB-435s中p-p38, p-gsk3βser9蛋白的表达,但不影响gsk3β蛋白的表达。讨论gsk3β是一个多功能的蛋白激酶,它在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化和细胞运动等方面发挥重要作用。gsk3β的活性主要通过3种不同方式共同调节：(1)不同位点的磷酸化状态调节gsk3β活性。在N端丝氨酸9(ser9)处磷酸化可降低gsk3β活性,而在酪氨酸216(Tyr216)处磷酸化则可增强它的活性;(2)细胞内定位调控G

关键词： p-p38 p-gsk3βser9 gsk3β 乳腺癌转移

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