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FGFR3在大鼠肾纤维化过程中的作用及机制研究

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FGFR3在大鼠肾纤维化过程中的作用及机制研究

作者：曾慧勤郑州大学

学位级别：硕士

目的肾纤维化是多种病因所致慢性肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的最后共同通路,病理特点主要是细胞外基质沉积、胶原纤维增多、肾小球硬化、肾间质纤维化等。肾间质纤维化程度很大程度上可反映肾功能恶化情况。成纤维细胞生长因子(Fib... 详细信息

目的肾纤维化是多种病因所致慢性肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的最后共同通路,病理特点主要是细胞外基质沉积、胶原纤维增多、肾小球硬化、肾间质纤维化等。肾间质纤维化程度很大程度上可反映肾功能恶化情况。成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)在纤维化过程中扮演着重要作用,它的激活与肾纤维化密切相关,既往研究表明,FGF可通过结合成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor,FGFR),激活一系列信号传导通路,从而发挥其生物学效应。本研究通过检测FGFR3、转化生长因子-β1(TGF-β1)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(erk1/2)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(p-erk1/2)在大鼠肾纤维化组织中的表达情况,探讨其与肾脏病理损害的联系,进一步明确FGFR3在肾纤维化发生发展中的作用及机制,为临床防治肾纤维化提供新的方向和理论依据。方法1.建立单侧输尿管结扎(UUO)模型,本实验采用4-6周SD大鼠42只,假手术组(n=21)只,模型组(n=21)只,行左侧输尿管结扎术建立UUO模型组,假手术组同模型组按同样方法打开腹腔,分离输尿管,不做任何处理,于建模后第7d、14d、21d后分批(每组7只)处死大鼠,比较大鼠的纤维化肾脏组织与配对正常肾脏组织。2.取假手术组和模型组第7d、14d、21d福尔马林浸泡肾脏组织分别行HE染色及Masson染色,观察肾脏组织病理变化及纤维化程度,同时行成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、转化生长因子β1(TGF-β1)免疫组化染色观察其表达情况。3.取假手术组和模型组每批新鲜冰冻标本,采用RT-pCR检测第7d、14d、21d各组FGFR3、TGF-β1表达情况,采用western-blot检测第7d、14d、21d各组FGFR3、TGF-β1、erk1/2、p-erk1/2表达情况。4.应用SpSS21.0对结果进行数据分析,定量数据采用均数±标准差(x±s)表示,方差齐者采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD方法,变量间的相关性采用spearman相关系数分析,ppppperk1/2、p-erk1/2蛋白的表达:使用灰度软件扫描分析可发现在肾纤维化形成过程中,FGFR3、TGF-β1、p-erk1/2蛋白表达整体呈逐渐上升趋势,erk1/2无明显变化趋势,FGFR3、TGF-β1、erk1/2、p-erk1/2在模型组各组的表达与假手术组相比差异均有统计学意义(各指标F值依次为15.65、17.38、75.80、41.38,pp-erk1/2在模型组各组之间的蛋白表达差异均有统计学意义(perk1/2在模型组第7天与第14天的表达差异有统计学意义(pp=1.000>0.05)。4.肾组织FGFR3、TGF-β1、p-erk1/2蛋白的相关性分析:肾纤维化过程中,肾组织中FGFR3与TGF-β1呈正相关(r=0.878,p=0.000p-erk1/2呈显著正相关(r=0.521,p=0.004p-erk1/2也呈显著正相关(r=0.582,p=0.001<0.05)。结论***3、TGF-β1在肾纤维化发生发展过程

关键词：肾纤维化 FGFR3 TGF-β1 p-erk1/2

EphrinB2在大鼠前脑短暂缺血再灌注损伤中对海马锥体神经元的作用及机制探讨

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EphrinB2在大鼠前脑短暂缺血再灌注损伤中对海马锥体神经元的作用...

作者：王晔山西医科大学

学位级别：硕士

目的:海马CA1区锥体神经元对于缺血性损伤特别敏感,并且在短暂前脑缺血后呈现迟发性死亡,而CA3和齿状回神经元则基本不受影响。在缺血再灌注过程,诱导产生了包括兴奋性神经毒、氧化应激、炎症等各种损伤反应。在缺血后极短的时间内,由... 详细信息

目的:海马CA1区锥体神经元对于缺血性损伤特别敏感,并且在短暂前脑缺血后呈现迟发性死亡,而CA3和齿状回神经元则基本不受影响。在缺血再灌注过程,诱导产生了包括兴奋性神经毒、氧化应激、炎症等各种损伤反应。在缺血后极短的时间内,由于能量供应急剧减少,引起离子浓度的改变,以及细胞外谷氨酸及其它神经递质浓度的改变,这些因素启动了细胞死亡过程。但是如果缺血过程较为短暂,则细胞死亡主要表现为迟发性的神经元死亡。然而这种脑缺血后神经元迟发性死亡的机制尚未阐明。ephrinB2是Eph-ephrin受体配体系统的重要成员,生理状态下,ephrinB2在海马的CA1区锥体神经元的含量丰富,而在CA3区的神经元上含量较少,约为CA1区锥体神经元含量的1/10。ephrinB2与谷氨酸受体中的NMDA受体的功能活动有十分密切的关系。而NMDA受体的过度激活或者不受调控的活化在脑中风,脑创伤,正中颞叶性癫痫,帕金森,亨廷顿氏症以及阿尔兹海默病等许多急性和慢性的中枢神经系统病症中通过介导兴奋性神经毒性效应导致神经元死亡。然而,有关ephrinB2是否参与脑缺血再灌注损伤以及其作用机制如何,尚未见报道。 MApK信号转导通路通过不同的途径参与神经元的增殖、死亡等过程,其中报道较多的是细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, erk1/2),它通过对靶蛋白如ephrinB2或其他下游信号分子的磷酸化,广泛参与了神经元存活和凋亡的调控过程,包括在缺血/再灌注损伤后神经元存活与死亡的调控。有报道显示erk1/2的活化参与了脑缺血损伤,其磷酸化水平在脑缺血后增加,但也有报道p-erk1/2在脑缺血再灌注后发挥了神经保护作用。因此目前关于erk1/2在缺血损伤中的作用仍有争议。综上,本研究利用四血管夹闭短暂前脑缺血再灌注模型,免疫印迹技术、caspase-3、TUNEL细胞凋亡检测技术及在体给药技术,观察短暂前脑缺血后,成年大鼠海马锥体神经元p-erk1/2、ephrinB2、NMDA受体等蛋白的表达变化,以观察ephrinB2在缺血再灌注损伤中的作用及可能机制。进而探讨脑缺血再灌注后海马CA1区锥体神经元发生迟发性死亡的机制以及产生海马CA1区和CA3区神经元损伤差异的原因。方法: 1、短暂前脑缺血再灌注模型的建立采用改良的pulsinelli四血管夹闭方法进行短暂前脑缺血(15 min)。手术前禁食过夜以恒定血糖水平。大鼠以水合氯醛麻醉(40 mg/100g,i.p.),颈部正中切口,分离双侧颈总动脉。然后将大鼠固定于定位仪上,电凝双侧翼小孔内的椎动脉,夜间禁食。以此方法制备的大鼠没有明显的脑损害,行为也如常。次日,用动脉夹夹闭完全清醒的大鼠双侧颈总动脉15 min造成严重短暂前脑缺血。大鼠在30～60 s内昏迷,翻正反射消失,双侧瞳孔放大,且观察眼球看到红色有明显变浅,痛反射消失,能自主呼吸。脑缺血15 min后解除动脉夹,恢复脑血流。具有这些症状的大鼠分别存活6 h、24 h或48h后进行相关实验。缺血后出现惊厥的大鼠予以排除,实验中保持大鼠体温37.0℃。给药组在灼闭椎动脉前先固定于大鼠立体定位仪上,头部正中切口,分离至颅骨,确定前囟点,以据前囟点向后0.8 mm,旁移1.3 mm,距颅骨面向下4.05 mm定位侧脑室,给予U0126 1ug(5ul),之后手术及缺血方法同单纯缺血再灌注组。 2、实验分组 (1)对照组(n=6);(2)缺血再灌注后6 h组、24 h组、48 h组(n = 6);(3)U0126+缺血再灌注后6 h组、24 h组、48 h组(n = 6);3、检测方法 (1) TUNEL染色检测对照组、缺血再灌注组及提前给予erk特异性抑制剂U0126缺血再灌注组的细胞凋亡检测。 (2) Caspase-3酶活性的检测对照组、缺血再灌注组及提前给予erk特异性抑制剂U0126缺血再灌注组的Caspase-3酶活性检测。 (3) Western-blot对照组、缺血再灌注组及提前给予erk特异性抑制剂U0126缺血再灌注组的ephrinB2、p-erk1/2以及NMDA受体等磷酸化水平检测。 4、统计学处理采用SpSS15.0统计软件分析数据。数据以均数±标准差(x±s)表示,成组设计的多个样本均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),方差齐者组间比较用LSD检验,方差不齐者组间比较用Games-Howell检验,检验水准α=0.05, ppase-3活性于缺血再灌注24 h达到高峰,48 h出现略微下降,而CA3区的神

关键词： ephrinB2 NMDA受体 p-erk1/2 U0126 脑缺血大鼠

平喘Ⅰ号对急发期哮喘大鼠肺组织erk的影响

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平喘Ⅰ号对急发期哮喘大鼠肺组织ERK的影响

作者：王一轩黑龙江中医药大学

学位级别：硕士

目的：通过观察“平喘Ⅰ号”对哮喘大鼠肺组织erk表达及活化的影响,探讨其对支气管哮喘的作用机制。方法：健康Wistar大鼠60只,随机分成6组：正常对照组,哮喘模型组,地塞米松组,中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组。利用卵蛋白... 详细信息

目的：通过观察“平喘Ⅰ号”对哮喘大鼠肺组织erk表达及活化的影响,探讨其对支气管哮喘的作用机制。方法：健康Wistar大鼠60只,随机分成6组：正常对照组,哮喘模型组,地塞米松组,中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组。利用卵蛋白加氢氧化铝的方法,复制哮喘大鼠模型。各组大鼠均经末次激发24h后处死。取左肺在矢状面取材,按常规方法作病理切片及HE染色。光镜下观测病理学变化。取左肺组织固定于4%多聚甲醛中,采用免疫组化方法(pV二步法)检测erk1/2,用美国Universal Imaging porporation的图像分析系统,每个时间点选取3张,每张切片随机选取5个视野,应用Meta Morph软件分析阳性细胞的光密度,观察免疫组化法检测肺组织中p-erk1/2的含量。结果：光镜标本制作,正常对照组大鼠肺组织切片HE染色镜下观察显示：支气管周围、血管周围均未见炎细胞,未见支气管管壁、面积增大,未见气道重塑现象。模型组大鼠肺组织：支气管上皮不完整,杯状细胞增多,气道上皮细胞脱落,黏膜下水肿,黏液腺增多,气道壁平滑肌增厚,气道壁及气道和血管周围可见炎细胞浸润,主要为淋巴细胞和嗜酸粒细胞,支气管平滑肌细胞增生肥大,支气管管壁面积增大,粘液栓堵塞,管腔狭窄。各治疗组：支气管黏膜增生程度不等,黏液分泌亢进,支气管周围可见不同程度的淋巴细胞及嗜酸性粒细胞浸润,部分支气管出现水肿现象,但较模型组轻。经组间比较：中、高剂量组与地塞米松组的病理改变程度相当,低剂量则较上三组程度严重。经过图像分析软件处理后发现模型组大鼠气道壁厚度明显增加,气道平滑肌细胞增生明显。将气道平滑肌厚度,气道壁厚度,支气管平滑肌细胞数,均进行标准化处理后观察比较,发现模型组各相应指标均显著高于对照组。模型组及各治疗组erk在细支气管平滑肌上均呈阳性表达,气道平滑肌上erk的平均吸光度值均明显高于正常对照组,各治疗组间与模型组比较中,模型组的表达明显高于各治疗组(perk表达上与地塞米松组无差异(p>0.05);而低剂量组则强于高、中剂量组(ppp-erk1/2含量明显增高;地塞米松组与模型组相比：p-erk1/2的含量明显下降;中药低剂量组与地塞米松松-组相比：p-erk1/2的含量较高;中药中剂量组和高剂量组,与地塞米松组相比：p-erk1/2的含量无明显差异;中药中、高剂量组与中药低剂量组相比：p-erk1/2的含量较低;中药高剂量组与中药中剂量组相比：p-erk1/2的含量相当。结论：1.平喘Ⅰ号可以抑制哮喘大鼠气道重塑2.平喘Ⅰ号可以抑制erk在气管平滑肌上的表达及活化

关键词：支气管哮喘气道重塑平喘I号 erk p-erk1/2

神经调节素1β改善慢性有机磷中毒大鼠认知障碍的作用机制

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神经调节素1β改善慢性有机磷中毒大鼠认知障碍的作用机制

作者：荣丽霞青岛大学

学位级别：硕士

目的：观察神经调节素1β (Neuregulin1β, NRG1β)对慢性有机磷中毒大鼠erk1/2磷酸化(p-erk1/2)活化水平的影响,探索其改善慢性有机磷中毒认知障碍的作用机制。方法：应用Y型电迷宫筛选有学习记忆能力的大鼠49,随机挑选15只作为对照组... 详细信息

目的：观察神经调节素1β (Neuregulin1β, NRG1β)对慢性有机磷中毒大鼠erk1/2磷酸化(p-erk1/2)活化水平的影响,探索其改善慢性有机磷中毒认知障碍的作用机制。方法：应用Y型电迷宫筛选有学习记忆能力的大鼠49,随机挑选15只作为对照组,其余34只大鼠给予氧乐果5mg/kg皮下注射,连续染毒4周建立慢性有机磷中毒认知障碍模型,将造模成功的29只大鼠随机分为模型组14只和治疗组15只。造模成功后第1天及第8天,治疗组大鼠分别经左、右侧侧脑室注射给予NRG1β干预治疗,对照组和模型组则同步给予等体积的pBS。Y型电迷宫检测大鼠的学习、记忆能力;HE染色观察海马组织的形态学变化;透射电镜观察海马组织超微结构;免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测p-erk1/2及erk1/2在海马组织内的分布和表达水平。结果：Y型电迷宫结果显示,染毒大鼠(模型组和治疗组)学习记忆能力较对照组明显降低,经NRG1β干预治疗后较模型组明显提高;模型组大鼠海马组织损伤明显,erk1/2磷酸化活化(p-erk1/2)水平明显下降;NRG1β治疗后海马组织损伤较模型组轻微,erk1/2磷酸化活化水平升高;各组erk1/2蛋白总表达水平无明显差异。结论：NRG-1β可以提高慢性有机磷中毒大鼠海马组织内erk1/2磷酸化活化水平,对慢性有机磷中毒认知障碍有一定的改善作用。

关键词： NRG1β 慢性有机磷认知障碍 p-erk1/2

三七皂苷对缺血损伤骨髓间充质干细胞的保护作用

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三七皂苷对缺血损伤骨髓间充质干细胞的保护作用

作者：王越浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的观察体外条件下凝血酶对大鼠骨髓间充质干细胞的损伤作用、细胞碱性磷酸酶活性的变化以及细胞内erk1/2、p-erk1/2蛋白的表达的影响,同时采用三七皂苷进行干预,判断三七皂苷干预是否能够对凝血酶损伤的骨髓间充质干细胞有保护作用。... 详细信息

目的观察体外条件下凝血酶对大鼠骨髓间充质干细胞的损伤作用、细胞碱性磷酸酶活性的变化以及细胞内erk1/2、p-erk1/2蛋白的表达的影响,同时采用三七皂苷进行干预,判断三七皂苷干预是否能够对凝血酶损伤的骨髓间充质干细胞有保护作用。方法首先通过全骨髓培养法培养正常SD大鼠的骨髓间充质干细胞并进行传代、纯化及鉴定。通过MTT法确定凝血酶对细胞损伤的时间及浓度后,取生长良好的第3～8代骨髓间充质干细胞,随机分为6组,分别为pNS200组(三七皂苷200 μg/ml +凝血酶 12.5U/ml)、pNS100 组(三七皂苷 100μg/ml +凝血酶12.5U/ml)、pNS50 组(三七皂苷 50μg/ml+凝血酶 12.5U/ml)、pNS25 组(三七皂苷25μg/ml+凝血酶12.5U/ml)、损伤对照组组(凝血酶12.5U/ml)及正常对照组。6个组在相同条件下培养4小时后,测定其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALp)活性,Western blotting 法检测细胞 erk1/2、p-erk1/2 蛋白的表达。结果1.损伤对照组细胞ALp活性较正常对照组显著下降,有显著统计学意义;药物干预组ALp活性较正常对照组活性下降,有显著统计学意义;药物干预组细胞ALp活性均高于损伤对照组,有统计学意义。药物干预组之间ALp活性未见明显差异。2.6个实验组erk1/2蛋白表达水平差异无统计学意义。损伤对照组p-erk1/2较正常对照组显著下降,有显著统计学意义;各个pNS干预组细胞p-erk1/2均高于损伤对照组,差异具有统计学意义。pNS25组和pNS50组p-erk1/2明显高于正常组。结论一定浓度的凝血酶可以损伤骨髓间充质干细胞,导致骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性下降,p-erk1/2表达降低。三七皂苷对凝血酶损伤骨髓间充质干细胞及其碱性磷酸酶活性有保护作用,可上调其p-erk1/2蛋白的表达。三七皂苷对凝血酶损伤骨髓间充质干细胞的保护作用可能是通过活化erk信号通路实现。

关键词：三七皂苷大鼠骨髓间充质干细胞凝血酶碱性磷酸酶 erk1/2 p-erk1/2

CGRp对血管平滑肌细胞增殖及CDK2和Cyclin E表达的影响

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CGRP对血管平滑肌细胞增殖及CDK2和Cyclin E表达的影响

作者：邓水秀南华大学

学位级别：硕士

目的:观察降钙素基因相关肽(CGRp)对胎牛血清(FBS)刺激的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响,并探索此作用与细胞外信号调节激酶(erk1/2)和细胞周期调节蛋白CDK2、CyclinE的关系。方法:组织贴块法体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,取其... 详细信息

目的:观察降钙素基因相关肽(CGRp)对胎牛血清(FBS)刺激的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响,并探索此作用与细胞外信号调节激酶(erk1/2)和细胞周期调节蛋白CDK2、CyclinE的关系。方法:组织贴块法体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,取其第3 10代用于实验。静止期细胞用不同浓度CGRp处理30 min后再加以血清刺激细胞24 h,噻唑蓝比色法(MTT)观察CGRp对VSMCs增殖的浓度效应;取最适浓度的CGRp预孵育VSMCs 30min后,加入10%FBS(12 h、24 h、48 h),MTT观察CGRp对血清诱导大鼠VSMCs增殖的影响;流式细胞仪(FCM)观察分析VSMCs细胞周期分布特征的改变;Western blot检测细胞内p-erk1/2、CDK2和CyclinE的表达。结果: MTT法显示CGRp(0.1 100 nmol·L-1)能浓度依赖性地抑制大鼠VSMCs的增殖,10 nmol·L-1CGRp预孵育VSMCs 30min后,能降低10%FBS诱导的大鼠VSMCs的生存率;流式细胞仪分析10 nmol·L-1 CGRp预孵育后能降低血清诱导的细胞S期细胞百分比,升高G1期细胞百分比,降低细胞增殖指数(pI);Western blot检测结果显示,10 nmol·L-1CGRp干预下能抑制血清刺激的大鼠VSMCs内p-erk1/2、CDK2和CyclinE的表达;50 nmol·L-1CGRp8-37(CGRp受体拮抗剂)能部分减弱CGRp的抑制作用。结论: CGRp能抑制血清诱导大鼠VSMCs的增殖,其机制可能是通过抑制细胞erk1/2信号通路,下调细胞周期调节蛋白CDK2和CyclinE的表达,阻滞细胞周期由G1期进入S期而发挥作用

关键词：血管平滑肌细胞 CGRp 增殖 p-erk1/2 CDK2 CyclinE

睾酮对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

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睾酮对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

作者：孙丽娜郑州大学

学位级别：硕士

背景心肌重构是心脏对各种刺激产生的适应性增生,也是冠心病、高血压、心力衰竭等多种心脏疾病发展至终末期的共同病理改变。表现为心肌细胞肥大、凋亡,心肌成纤维细胞增殖、胶原增加,基质蛋白聚集等。心肌重构不仅表现为心脏结构的重构... 详细信息

背景心肌重构是心脏对各种刺激产生的适应性增生,也是冠心病、高血压、心力衰竭等多种心脏疾病发展至终末期的共同病理改变。表现为心肌细胞肥大、凋亡,心肌成纤维细胞增殖、胶原增加,基质蛋白聚集等。心肌重构不仅表现为心脏结构的重构,还包括电重构。早期重构可代偿心脏功能,增强心脏的收缩能力,维持心脏正常的射血量,但随着压力负荷、容量负荷的增加及神经体液因素的参与,心肌重构逐渐发展为失代偿期,最终导致心力衰竭、心律失常,甚至猝死。心肌重构的主要表现是心肌纤维化,心肌纤维化即心肌成纤维细胞过度增殖,胶原合成增加等。心肌纤维化可导致心肌僵硬度增加,顺应性降低,心脏的收缩舒张功能受限,是独立的心血管疾病危险因素。因此,有效的治疗心肌纤维化对冠心病、高血压、心力衰竭、心律失常等疾病将产生有益的影响。睾酮是人体内重要的雄性激素,在维持人体的正常生理功能方面,特别是男性的生长发育、性欲、体力、免疫功能等方面发挥重要作用,还可维持骨密度及强度,另外对身体的许多系统及功能也会产生影响,如脂代谢、糖代谢、炎症反应、血细胞的生成等。生理水平的睾酮对心血管系统也有保护作用,如调节血脂、减轻动脉粥样硬化、抗炎、扩张血管、保护Ang II诱导的血管重塑等。但是人体内的睾酮水平,特别是有生物学效应的睾酮随着年龄的增长而逐渐下降,睾酮水平的降低严重影响着人体的健康,如肌力下降,性欲减低,情绪障碍,代谢综合征等,并且心血管系统疾病及呼吸系统疾病发生的风险也将增加。睾酮药物替代治疗对男性性腺机能减退的患者有积极的治疗作用,如增强肌力,提高性欲,降低体脂水平,增加体质量。同时发现,生理剂量的睾酮药物可降低心血管疾病的危险因素,如改善血脂代谢,扩张冠脉。而睾酮是否对心肌纤维化有影响,其具体机制是什么?国内及国外学者却很少研究到。目的观察睾酮(testosterone,T)对血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)诱导的新生乳鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CF)增殖和胶原合成的影响,并进一步探讨其机制。方法分离、培养CF,然后将其分为四组:对照组(无血清DMEM培养液培养)、Ang II组(含10-6mol·L-1Ang II的无血清DMEM培养液培养)、睾酮组(含30nmol·L-1睾酮的无血清DMEM培养液培养)、睾酮+Ang II组(含30nmol·L-1睾酮和10-6mol·L-1 Ang II的无血清DMEM培养液培养),分别培养24h,应用流式细胞技术检测细胞周期分布,VG染色法检测胶原含量,免疫细胞化学法观察磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-erk1/2)的表达。结果*** II组S期细胞比例、胶原含量和p-erk1/2表达水平较对照组明显增加;2.睾酮组细胞周期分布、胶原含量与对照组无统计学差异,而p-erk1/2表达较对照组升高;3.睾酮+Ang II组S期细胞比例、胶原含量和p-erk1/2表达水平较Ang II组明显降低。(S期细胞比例:FAng II=30.403,F睾酮=5.812,F交互=18.073,p10.365,F睾酮=4.533,F交互=42.049,pp-erk1/2表达水平:FAng II=174.762,F睾酮=184.828,F交互=152.240,perk1/2的活化,抑制Ang II诱导的CF的过度增殖和胶原合成。

关键词：睾酮血管紧张素II 心肌成纤维细胞增殖胶原 p-erk1/2 乳鼠

醛固酮降低心衰大鼠减压神经ENaC的机制研究

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醛固酮降低心衰大鼠减压神经ENaC的机制研究

作者：于淑萍郑州大学

学位级别：硕士

背景介绍减压反射对心血管活动起重要的调节作用。心力衰竭(Heart Failure,HF)患者和HF动物模型的减压反射敏感性明显降低,扰乱自主神经平衡,导致交感神经兴奋性增加,而副交感神经活动下降,从而使发病率和死亡率均增加。研究HF降低减压... 详细信息

背景介绍减压反射对心血管活动起重要的调节作用。心力衰竭(Heart Failure,HF)患者和HF动物模型的减压反射敏感性明显降低,扰乱自主神经平衡,导致交感神经兴奋性增加,而副交感神经活动下降,从而使发病率和死亡率均增加。研究HF降低减压反射的机制对预防HF引起的猝死有重要的临床意义。有文献报道减压反射的传入神经敏感性和兴奋性降低导致了减压反射敏感性降低,但传入神经对血压变化敏感性降低的机制目前仍不清楚。位于减压神经末梢的机械敏感性离子通道epithelial sodium channel(ENa C)感受主动脉弓处血管扩张,引起减压神经兴奋,从而传递血压变化的信息。ENa C水平受泛素连接酶Nedd4-2的负调控。以往的研究发现,升高体内醛固酮水平可降低减压神经中ENa C通道的表达,同时降低减压反射的敏感性。而HF患者和HF动物模型都表现出醛固酮水平升高,减压反射功能降低。目的本实验通过结扎SD大鼠冠状动脉左前降支制作HF大鼠模型,观察其醛固酮水平和减压反射敏感性的变化,检测结状神经节中ENa C、p-erk1/2表达的变化,以及Nedd4-2与ENa C结合的变化,探讨HF降低ENa C的机制。方法1.采用结扎冠状动脉左前降支的方法,制作HF大鼠模型。模型制备6-8周后进行实验。2.健康雄性SD大鼠随机分为4组:(1)正常对照组(Ctrl,n=6)(2)假手术组(sham,n=6)(3)心衰组(HF,n=6)(4)心衰加螺内酯组(HF+SpI,n=6)。3.血压和心率的测量:麻醉后,股动脉插管技术测量血压和心率。4.动脉压力反射敏感性的测量:静脉注射硝普钠(SNp)和苯肾上腺素(pE)分别诱导升压反射和降压反射,将反射前后收缩压变化值与心动周期变化值之比(ΔSBp/ΔCC)作为升压反射敏感性(BRS-SNp)和降压反射敏感性(BRS-pE)的指标。5.测量血浆醛固酮浓度:取新鲜的大鼠动脉血,用大鼠醛固酮试剂盒测定大鼠血浆中醛固酮的浓度。6.采用HE染色、天狼猩红染色和Masson三色染色技术检测大鼠心脏的组织学变化。7.采用免疫组织化学技术检测结状神经节(nodose ganglion,NG)中ENa C-β、ENa C-γ、p-erk1/2的表达,并使用Co-Ip技术检测Nedd4-2与ENa C结合的变化。8.统计学处理:实验数据以均值±标准差(Mean±SEM)表示,使用Graph pad prism5.0统计软件,采用单因素方差分析或双因素方差分析和t检验,p﹤0.05为差异有统计学意义。结果1.大鼠心脏组织病理学检查表明,常规HE染色可见冠状动脉结扎后大鼠左心室前壁心肌梗死部位室壁变薄,心肌组织疏松,心肌细胞核消失以及大量炎症细胞浸润。天狼猩红和Masson三色染色进一步证实心肌梗死部位的成纤维化。2.模型制造8周后,测得大鼠体内的醛固酮浓度Ctrl组为362.4+26.01pg/ml,sham组为358.8+29.17 pg/ml,HF组为626.2+52.47 pg/ml,HF+SpI组为600.7+47.88 pg/ml。HF组和HF+SpI组醛固酮浓度明显高于Ctrl组(p25 ms/mm Hg,sham组为1.065+0.008 ms/mm Hg,HF组为0.405+0.013ms/mm Hg,HF+SpI组为0.593+0.037 ms/mm Hg。HF组和HF+SpI组BRS明显低于Ctrl组和sham组(ppI可以减弱HF对BRS的影响,使之显著升高(p207+0.217和0.6922+0.0363,sham组分别为1.329+0.165和0.7659+0.0352,两组间无显著差异(p>0.05);HF组分别为0.3309+0.121和0.2822+0.025,比Ctrl组明显减少(ppI组分别为0.736+0.0424和0.3848+0.008,也比Ctrl组ENa C表达减少。表明HF导致ENa C表达量降低。HF+SpI组与HF组相比ENa C蛋白表达量升高(ppI能改善HF引起的ENa C变化,但是不能使其恢复至正常。***-Ip检测Nedd4-2与β/γENa C间的结合,各条带灰度值结果为:以Nedd4-2抗体沉淀蛋白,β/γENa C抗体做western blot,Ctrl组分别为

关键词：醛固酮心力衰竭结状神经节压力反射敏感性 Nedd4-2与ENaC结合 p-erk1/2

汉黄芩素对人肺鳞癌细胞QG56的增殖抑制和诱导凋亡作用

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汉黄芩素对人肺鳞癌细胞QG56的增殖抑制和诱导凋亡作用

作者：申改玲大连医科大学

学位级别：硕士

目的：肺癌是目前发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，非小细胞肺癌约占肺癌的85%，超过50%的非小细胞肺癌患者在诊断时已处于晚期或已经发生了转移。尽管由于新的细胞毒性药物和生物学在癌症治疗中的发展，癌症治疗有了多种选择，肺癌患者... 详细信息

目的：肺癌是目前发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，非小细胞肺癌约占肺癌的85%，超过50%的非小细胞肺癌患者在诊断时已处于晚期或已经发生了转移。尽管由于新的细胞毒性药物和生物学在癌症治疗中的发展，癌症治疗有了多种选择，肺癌患者5年平均生存率仍然只有约15%，因此，寻求提高患者生存率的新方法亟待解决。为了降低癌症患者死亡率，我们更加关注癌症的预防、早期发现、有效治疗等健康措施。越来越多的研究显示，大量的天然化合物已作为抗氧化剂、癌症预防和治疗药物。在癌症的临床治疗中，有许多处方药是从天然植物中提取的。汉黄芩素为唇形科植物黄芩的主要活性成分之一，属于酚类抗氧化剂，是黄酮类化合物中的一种，具有较强的抗炎、抗氧化活性，近年来的研究发现，汉黄芩素有明显的抗肿瘤作用。本文旨在研究汉黄芩素对人肺鳞癌QG56细胞增殖与凋亡的影响，探讨其对磷酸化胞外信号调节激酶（p-erk1/2）的调控作用，进而探讨其可能通过的相关信号传导通路，为以p-erk为靶点的药物的研究提供理论依据。方法：用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定不同浓度汉黄芩素分别作用于肺鳞癌QG56细胞24、48和72小时后的细胞增殖活性，在相差倒置显微镜下观察细胞形态学变化，流式细胞仪AnnexinV-pI双标记法检测不同浓度汉黄芩素作用于肺鳞癌QG56细胞48小时后细胞凋亡情况，荧光显微镜下观察细胞凋亡形态并收集药物处理后的QG56细胞，通过Western blot法检测磷酸化胞外信号调节激酶（p-erk1/2）在各药物处理组和对照组细胞中的蛋白表达。结果：汉黄芩素（wogonin）可显著抑制肺鳞癌QG56细胞的生长，抑制率与药物浓度和作用时间成正相关，即汉黄芩素抑制细胞增殖作用呈浓度与时间依赖性，MTT结果显示各浓度组汉黄芩素对QG56细胞增殖有明显抑制作用，12.5μM汉黄芩素处理24h的抑制率为17.27%，当汉黄芩素浓度达到160μM时，对QG56的抑制率接近40.55%，分别用25、50、100和160μmol/L汉黄芩素处理24小时后三次实验测得各组抑制率分别为（20.51±1.32）%、（29.55±1.02）%、（32.56±0.51）%和（40.18±0.37）%，而24、48、72小时的半数抑制浓度（IC50值）分别为（63.45±7.02）μM、（52.60±8.09）和（38.37±7.82）μM。流式细胞仪AnnexinV-FITC/pI双标法检测证实了汉黄芩素能诱导QG56细胞凋亡,分别用25、50、100、160μmol/L汉黄芩素处理QG56细胞48小时后，凋亡率分别为20.79%、37.28%、50.88%和65.56%，当汉黄芩素浓度达到160μmol/L时，QG56细胞的最大凋亡率达到65.62%。倒置显微镜下观察，加药前，细胞贴壁良好，呈多边形，大小适中，核仁清晰，细胞连接成片，加药后细胞形态不规则、贴壁不佳、染色质浓缩、细胞突起消失。流式细胞术检测细胞凋亡：结果显示，细胞凋亡率随汉黄芩素浓度增加而增加，说明汉黄芩素可以明显诱导QG56细胞凋亡。荧光显微镜下观察，早期凋亡细胞呈绿色荧光，晚期凋亡呈红色荧光，Western blot检测磷酸化胞外信号调节激酶（p-erk1/2）蛋白表达随药物浓度增大而明显下调，而阴性对照组p-erk1/2蛋白水平无明显变化。表明汉黄芩素可以诱导肺癌细胞凋亡，RAF-MApK-erk可能是其作用的信号通路。结论：（1）随着汉黄芩素浓度的增加，QG56细胞的生长抑制率明显升高，说明汉黄芩素具有抑制人肺癌QG56细胞生长增殖的作用。（2）随着汉黄芩素浓度的增加，QG56细胞的凋亡率也明显增加，提示汉黄芩素具有诱导QG56细胞凋亡的作用。（3）随着汉黄芩素浓度的增加p-erk1/2的表达下降，提示其作用机制可能与抑制以p-erk1/2为关键分子的信号传导通路有关，汉黄芩素有望作为新的抗癌药物应用于临床。

关键词：汉黄芩素肺鳞癌增殖凋亡 p-erk1/2