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棉花学报 2022年第4期34卷 350-360页

作者：韩阳臧榕张梦陈亮亮张学贤郭立平戚廷香唐会妮王海林乔秀琴邢朝柱张艳吴建勇河北农业大学/棉花生物学国家重点实验室河北基地河北保定071001 中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室河南安阳455000

【目的】探究哈克尼西棉不育胞质(CMS-D2)和三裂棉不育胞质(CMS-D8)对ATP和H_(2)O_(2)含量的影响。【方法】选用CMS-D2和CMS-D8两套“三系”(不育系、保持系及其恢复系)材料,测定其不同发育时期的叶片和花蕾中ATP和H_(2)O_(2)含量;并结... 详细信息

【目的】探究哈克尼西棉不育胞质(CMS-D2)和三裂棉不育胞质(CMS-D8)对ATP和H_(2)O_(2)含量的影响。【方法】选用CMS-D2和CMS-D8两套“三系”(不育系、保持系及其恢复系)材料,测定其不同发育时期的叶片和花蕾中ATP和H_(2)O_(2)含量;并结合已有研究测定候选不育基因orf610a超表达拟南芥植株中ATP和H_(2)O_(2)含量;通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析ATP合成相关基因在不育系、保持系以及转基因拟南芥花蕾中的表达量。【结果】与其保持系和恢复系相比,CMS-D2不育系叶片在蕾期和铃期均表现为ATP含量极显著降低、H_(2)O_(2)含量极显著升高;CMS-D8不育系叶片在蕾期表现为ATP含量极显著降低、H_(2)O_(2)含量极显著升高,在铃期表现为ATP含量极显著升高;CMS-D2不育系3 mm、4 mm花蕾中ATP含量极显著降低,4 mm花蕾中H_(2)O_(2)含量极显著上升;CMS-D8不育系5 mm、6 mm花蕾中ATP含量极显著降低。与其保持系相比,CMS-D2和CMS-D8不育系花蕾中,多个ATP合成相关基因的表达量极显著降低。与野生型材料相比,orf610a超表达拟南芥角果和花蕾中的H_(2)O_(2)含量显著升高,ATP含量极显著降低,且大多数ATP合成相关基因均极显著下调表达。【结论】不育胞质会对棉花不同发育时期的叶片和花蕾中ATP和H_(2)O_(2)含量产生一定的影响,二者动态平衡的破坏可能会影响花粉的正常发育。

关键词：棉花细胞质雄性不育 ATP含量 H2O2含量 orf610a

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棉花雄性不育胞质对ATP合成和活性氧产生的影响

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作者：韩阳河北农业大学

学位级别：硕士

“三系”法杂交制种在棉花中是比较理想的制种方式,含哈克尼西棉不育胞质的CMS-D2不育系和含三裂棉不育胞质的CMS-D8不育系是目前“三系”法制种中主要的两个不育系材料。但是两个材料败育过程中生理变化以及败育的分子机制尚不清晰。... 详细信息

“三系”法杂交制种在棉花中是比较理想的制种方式,含哈克尼西棉不育胞质的CMS-D2不育系和含三裂棉不育胞质的CMS-D8不育系是目前“三系”法制种中主要的两个不育系材料。但是两个材料败育过程中生理变化以及败育的分子机制尚不清晰。因此本研究选用CMS-D2和CMS-D8两套三系材料,系统测定其不同发育时期叶片和花蕾中ATP和H2O2含量,并对不育候选基因orf610a进行功能验证和花粉败育分子机制初探。本研究从生理指标和分子水平明确了两种不育系的败育时期,为深入揭示两种胞质不育系花粉败育的不同调控机制提供了思路,同时对推动棉花“三系”生产具有重要实践意义。主要研究结果如下:1.测定棉花CMS-D2和CMS-D8两套三系材料不同发育时期叶片ATP和H2O2含量,结果显示:CMS-D2不育系在蕾期和铃期叶片中ATP含量极显著低于保持系和恢复系,H2O2含量极显著高于保持系和恢复系;CMS-D8不育系在蕾期叶片ATP含量极显著低于保持系和恢复系,H2O2含量极显著高于保持系和恢复系,在铃期ATP含量升高,极显著高于保持系和恢复系,H2O2含量差异不显著。两种不育胞质对叶片ATP含量的影响,在蕾期呈相反趋势。2.为了解花粉败育过程中ATP和H2O2二者所扮演的角色,测定棉花CMS-D2和CMS-D8两套三系材料花药发育不同时期花蕾中ATP和H2O2含量,结果显示:CMS-D2不育系花蕾中ATP含量从3 mm长度花蕾开始就不再上升,极显著低于保持系和恢复系,不育系H2O2含量在3 mm花蕾与保持系和恢复系差异不显著,在4 mm花蕾极显著高于保持系和恢复系,保持系和恢复系之间差异不显著;CMS-D8不育系花蕾中ATP含量从5mm开始不再上升,极显著低于保持系和恢复系。说明CMS-D2和CMS-D8两种不育胞质的不育系败育时期不同,CMS-D2不育系败育时期早于CMS-D8不育系。3.为了进一步探究不育系花粉败育过程中导致花蕾中能量降低的原因,在两个不育系材料关键败育期花蕾中检测氧化磷酸化通路各复合体组装相关基因的表达,发现CMS-D2中相比于保持系,与复合体Ⅰ组装相关基因nad1、nad4、nad5、nad7,与复合体Ⅴ组装相关基因atp6在不育系中均极显著下调;CMS-D8中相比于保持系,与复合体Ⅰ组装相关基因nad1、nad4、nad5、nad7,与复合体Ⅲ组装相关基因cob,与复合体Ⅳ组装相关基因cox2、cox3,与复合体Ⅴ组装相关基因atp6在不育系中均极显著下调。说明两个不育系在关键败育时期,氧化磷酸化通路各复合体组装相关基因表达下调,导致能量合成减少。4.对不育强候选基因orf610a进行功能验证,发现过表达该基因对酵母细胞具有毒性,影响酵母的生长,并且使酵母ATP含量降低,ROS水平升高。拟南芥遗传转化试验发现该转orf610a基因的拟南芥花蕾和角果中ATP含量极显著降低,H2O2含量极显著升高;并且各复合体相关基因在转基因拟南芥花蕾中均极显著下调。酵母双杂试验发现orf610a和正常的atp1基因均不与挑选的复合体V组装相关基因atp2、atp3、atp4、atp6、atp8、atp9互作。综上所述,CMS-D2和CMS-D8不育胞质对不同发育时期的叶片和花蕾中ATP和H2O2含量均具有一定的影响,两种胞质不育系花粉败育主要与ATP合成与H2O2产生之间的不平衡有关。研究结果为深入揭示两种胞质不育系花粉败育的调控机制提供了思路。

关键词：棉花细胞质雄性不育 ATP含量 H2O2含量 orf610a

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棉花CMS-D2不育基因的鉴定及功能分析

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作者：张永杰郑州大学

学位级别：硕士

“三系”配套是棉花生产实践中理想的杂交制种方式,利用含哈克尼西棉不育胞质(CMS-D2)的陆地棉“三系”系统进行杂交制种是棉花杂种优势利用的主要途径之一。但是其不育基因至今仍未被鉴定和验证,其败育分子机制也尚不清楚。因此,本研... 详细信息

“三系”配套是棉花生产实践中理想的杂交制种方式,利用含哈克尼西棉不育胞质(CMS-D2)的陆地棉“三系”系统进行杂交制种是棉花杂种优势利用的主要途径之一。但是其不育基因至今仍未被鉴定和验证,其败育分子机制也尚不清楚。因此,本研究首先通过对CMS-D2不育系ZBA进行线粒体基因组测序和组装,并与保持系线粒体参考基因组2074B比较分析,旨在筛选和鉴定ZBA中候选不育基因,并进行初步功能验证。该研究为棉花细胞质雄性不育及其育性恢复分子机理解析奠定基础,同时对推动棉花“三系”应用具有重要实践意义。主要研究结果如下:1.不育系线粒体基因组测序和组装通过对不育系ZBA线粒体基因组进行Illumina和Pac Bio测序联合分析,获得ZBA线粒体基因组完整序列,并组装成1个634,036 bp单环状分子。通过orf从头预测,在ZBA中鉴定出194个orfs、36个蛋白质编码基因、6个r RNA和24个t RNA。与保持系2704B线粒体基因组比对分析,在ZBA线粒体基因组中鉴定了650个单核苷酸多态性(SNPs),其中有20个SNPs位于8个基因编码区,包括11个非同义突变和9个同义突变;共鉴定了93个插入和缺失(In Dels)均位于基因非编码区域,包括56个插入和37个缺失。这些结果为棉花线粒体基因组研究提供丰富的数据资源。2.候选不育基因的鉴定通过生物信息学方法,在ZBA线粒体基因组中鉴定出6个候选嵌合orfs(orf186a-2、orf142a、orf116a、orf175a、orf280a和orf610a),其中orf610a序列差异最大,全长1833 bp,由已知基因atp1 5’端部分序列(1-1348 bp)和未知来源的3’端序列485 bp组成,编码一个具有跨膜结构域和嵌合结构特征的假定蛋白。利用RT-PCR和q RT-PCR分析了6个候选orfs在“三系”及F中的表达模式。结果显示orf610a在含不育胞质的材料中,特别是不育系ZBA中特异高表达,在保持系ZB中几乎不表达,并在不育系ZBA各个组织器官中组成性表达。因此,将orf610a作为CMS候选基因进行进一步功能验证。3.候选不育基因orf610a功能验证对orf610a全长进行基因克隆,同时构建带有拟南芥线粒体定位信号的PCAM2300-MTS-orf610a过表达载体。拟南芥遗传转化结果显示:MTS-orf610a的过表达导致生殖器官发生改变,包括拟南芥角果变短、花丝变短、花粉变少和部分出现雄性不育。不育系ZBA和保持系ZB花蕾转录组数据显示与保持系ZB相比,不育系ZBA中活性氧(ROS)合成相关基因表达上调,清除ROS相关基因表达下调,三磷酸腺苷(ATP)合成相关基因表达下调。***610a质核互作分子机制为了解其核质互作机制,将orf610a作为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛库实验,共筛选到112个候选互作蛋白。KEGG和GO富集分析发现大多数基因被富集到花粉发育代谢通路和生物过程等通路中。点对点验证进一步证实orf610a与核编码蛋白RD22存在互作关系,并且互作关键区域依赖于跨膜区域。q RT-PCR显示RD22与orf610a具有相似的共表达模式,这暗示核编码基因RD22可能是orf610a正调控因子。

关键词：哈克尼西棉胞质不育系线粒体基因组 orf610a ATP 活性氧

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