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生物工程
1 篇
医学
1 篇
药学(可授医学、理...
主题
3 篇
orf60
1 篇
苜蓿丫纹夜蛾核多...
1 篇
蛋白质相互作用
1 篇
原核表达
1 篇
red重组系统
1 篇
亚细胞定位
1 篇
vp39
1 篇
bmnpv
1 篇
基因敲除
机构
2 篇
江苏大学
1 篇
华南师范大学
1 篇
中山大学
作者
1 篇
陈克平
1 篇
李玲玲
1 篇
姚勤
1 篇
庞义
1 篇
王强
1 篇
郭忠建
1 篇
王海燕
1 篇
李朝飞
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杨凯
1 篇
周水娟
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"主题词=orf60"
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利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒
orf60
基因
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生物工程学报
2007年 第5期23卷 801-805页
作者:
王强
郭忠建
姚勤
王海燕
陈克平
江苏大学生命科学研究院
镇江212013
用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV
orf60
基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于B...
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用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。
关键词:
Red重组系统
orf60
基因敲除
来源:
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BmNPV
orf60
与病毒其他蛋白相互作用的研究
BmNPV ORF60与病毒其他蛋白相互作用的研究
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引用
作者:
周水娟
江苏大学
学位级别:硕士
家蚕核型多角体病毒(Bomori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是一种杆状且特异性感染家蚕的病原,其基因组为双链环状DNA,序列全长128,413个核苷酸,编码136个开放阅读框(open reading frames,
orf
s)。随着杆状病毒基因组测序的完成以及BmNPV...
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家蚕核型多角体病毒(Bomori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是一种杆状且特异性感染家蚕的病原,其基因组为双链环状DNA,序列全长128,413个核苷酸,编码136个开放阅读框(open reading frames,orfs)。随着杆状病毒基因组测序的完成以及BmNPV研究的深入,众多BmNPV基因的功能逐渐被发现。orf60是BmNPV中的一种晚期基因,大小为807 bp,其表达的orf60蛋白理论大小约为31.0 kDa。本课题组前期研究发现orf60定位于细胞核和细胞质中,当orf60缺失后,病毒毒力下降且ODV粒子的囊膜发生变化。然而,orf60的其他信息并不清楚。本课题主要通过构建相关重组病毒对orf60与其他病毒蛋白的相互作用进行研究,探索orf60在病毒结构及感染中的作用。主要结果如下:***60的表达与分布(1)利用相关生物在线软件预测orf60的基本特性,结果显示orf60主要表现为亲水性,二级结构预测orf60具有9个α螺旋和10个β折叠。构建orf60的瞬时表达载体和重组病毒,Western blot结果发现,orf60蛋白在病毒感染和瞬时表达状态下蛋白谱带存在差异。(2)激光共聚焦显微镜观察和核质分离实验研究其亚细胞定位,结果显示orf60在瞬时表达时主要分布在细胞核中,病毒感染时分布在细胞核和细胞质,且orf60的四条谱带在核质中的分布不同。2.质谱鉴定与orf60相结合的蛋白用重组病毒vorf60-eGFP感染BmN细胞,进行免疫共沉淀分析,利用质谱技术对可能与orf60结合的蛋白进行鉴定,共得到18种病毒蛋白质和139种宿主蛋白质。结合相关文献的发现,在18种病毒蛋白中,有7种属于结构蛋白,参与病毒粒子囊膜或核衣壳的形成;其他11种在病毒基因复制、转录调控、宿主感染等方面发挥作用。139种宿主蛋白可根据功能分成19大类,包括细胞周期调控、各种物质的运输和代谢、翻译及核糖体结构和生物发生、细胞各种膜结构的生物发生、转录、翻译后修饰、信号转导、胞内转运分泌和囊泡运输、防御机制、细胞骨架等。通过质谱鉴定出的病毒蛋白和宿主蛋白有助于了解orf60的功能,相关研究有待进一步探索。3.与orf60相互作用的蛋白的验证根据质谱分析结果,选取肽段数量及覆盖率较高的5种病毒蛋白,即39K、LEF3、LEF6、VP39和ODV-E25,研究这些蛋白与orf60之间的相互作用。Co-IP后Western blot分析显示LEF3和VP39可与orf60结合。通过反向Co-IP以及双分子荧光互补实验进一步证明orf60与VP39相互作用,并且二者之间的相互作用发生在细胞核中。进一步构建orf60的截短突变体对orf60与VP39的相互作用区域进行研究,发现相互作用的区域为orf60的第239-268位氨基酸。目前,对BmNPV orf60蛋白的研究甚少。本论文对orf60的表达与分布进行分析,并且通过质谱结合免疫共沉淀、双分子荧光互补技术验证了 orf60与VP39的相互作用,得出orf60与VP39的相互作用区域为orf60的aa 239-268。这些结果为后期对orf60蛋白的功能及其在感染中的作用研究奠定了基础。
关键词:
BmNPV
orf60
蛋白质相互作用
VP39
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杆状病毒Ac
60
基因的原核表达与亚细胞定位研究
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微生物学杂志
2009年 第4期29卷 20-23页
作者:
李玲玲
李朝飞
庞义
杨凯
中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室
广东广州510275
华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室
广东广州510631
用PCR方法从AcMNPV基因组中扩增到
orf60
基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建pET-Ac
60
质粒,再将该质粒转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为16 ku的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗...
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用PCR方法从AcMNPV基因组中扩增到orf60基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建pET-Ac60质粒,再将该质粒转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为16 ku的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞(Sf9)中orf60基因的表达,结果显示:在感染后的细胞中有2条分子量分别约为33 ku和17 ku蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应。间接免疫荧光分析发现:在病毒感染的晚期,Ac60蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中。
关键词:
苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒
orf60
原核表达
亚细胞定位
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