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萝卜细胞质雄性不育的分子鉴定及orf138/orfB基因序列差异性分析

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西南农业学报 2017年第6期30卷 1262-1267页

作者：李晓梅柴靓杨峰冉茂林四川省农业科学院水稻高粱研究所四川德阳618000 四川省农业科学院作物研究所四川成都610066 蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室四川成都610066

【目的】本研究旨在了解萝卜雄性不育细胞质的分子特征。【方法】以8份萝卜细胞质雄性不育系及其保持系、5份不育材料及6个萝卜品种为试材,利用线粒体基因orf138及orf B为分子标记,设计特异引物对材料进行扩增,并对扩增产物进行测序分... 详细信息

【目的】本研究旨在了解萝卜雄性不育细胞质的分子特征。【方法】以8份萝卜细胞质雄性不育系及其保持系、5份不育材料及6个萝卜品种为试材,利用线粒体基因orf138及orf B为分子标记,设计特异引物对材料进行扩增,并对扩增产物进行测序分析。【结果】8份萝卜细胞质雄性不育系、5份不育材料及5个萝卜品种检测到含有orf138特异片段,为Ogura胞质类型,不育系相应保持系则未检测到特异片段;对扩增产物测序发现所有Ogura胞质材料可分为2种类型,Type A和Type H;27份材料orf B特异扩增后,其产物按编码区核苷酸序列的差异可分为2个类型,Ogura胞质中序列一致,普通胞质中序列一致。【结论】由此可见,orf138与orf B基因在Ogura胞质与普遍胞质间均差异明显,可利用orf138的有无及orf B基因的核苷酸序列差异进行胞质类型鉴定。

关键词：萝卜(Raphanus sativus L.) 雄性不育细胞质分子鉴定 orf138 orf B

油菜orf224和orf138基因的过表达分析

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油菜orf224和orf138基因的过表达分析

作者：秦宗平南京农业大学

学位级别：硕士

油菜是我国主要的油料经济作物,杂种优势利用是提高油菜产量的重要途径。细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)在作物杂种优势利用中具有重要的地位,能够显著提高和改善农业生产。甘蓝型油菜Polima CMS和Ogura CMS是油菜杂... 详细信息

油菜是我国主要的油料经济作物,杂种优势利用是提高油菜产量的重要途径。细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)在作物杂种优势利用中具有重要的地位,能够显著提高和改善农业生产。甘蓝型油菜Polima CMS和Ogura CMS是油菜杂种优势利用的两种重要不育系,对推动油菜产业的发展作出了不可磨灭的贡献,因此探究甘蓝型油菜Polima CMS和Ogura CMS花粉败育现象发生的机理具有极其重要的意义。orf224和orf138分别是甘蓝型油菜Polima CMS和Ogura CMS的线粒体基因,都被前人通过原核表达验证过对大肠杆菌具有毒性,且都被普遍认为是CMS基因。然而,orf224和orf138的功能都缺乏直接植物转基因实验证据。本文通过亚细胞定位分析、遗传转化分析、互作蛋白筛选以及转录组分析等方法分别对orf224和orf138的功能进行了初步的分析。主要结果如下:1.油菜Polima细胞质基因orf224的过表达分析(1)orf224基因的克隆及其蛋白定位分析:从甘蓝型油菜Polima CMS材料中克隆得到orf224基因。该基因序列全长675 bp,无内含子,编码224个氨基酸。该基因编码的蛋白具有两个跨膜结构域,并包含YMF19保守结构域,属于线粒体内膜蛋白。将orf224与GFP融合,在烟草表皮细胞中瞬时表达。结果表明,orf224蛋白在烟草表皮细胞中定位于线粒体。(2)orf224基因的遗传转化分析:利用CaMV35S启动子构建了pCAMBIA3301-orf224过表达载体,并通过农杆菌介导的浸花法遗传转化甘蓝型油菜中双11,获得4个转基因株系。转基因株系花粉染色后出现部分花粉败育,败育率为26.28%;转基因系株高降低,角粒数以及全株角果数减少。这说明orf224编码产物能够抑制油菜细胞生长,导致花粉败育,是雄性不育基因。同时,相对表达量检测结果表明转基因系的orf224基因表达量显著低于Polima CMS。说明转基因系花粉不能全部败育是由orf224基因表达量不足所致。(3)orf224互作蛋白筛选:利用pGBKT7载体构建pGBKT7-orf224重组载体,将其作为蛋白“诱饵”与甘蓝型油菜中双11的cDNA酵母双杂交表达文库进行互作蛋白的筛选。在大量固体筛选培养基中筛选到8个互作蛋白,其中2个线粒体蛋白BnFIS1B和BnHP30-2参与细胞凋亡过程,可能是不育性调控相关蛋白,因此对这2个蛋白进一步作了蛋白互作验证实验。结果表明,这2个蛋白都能与orf224在酵母体系中互作。(4)转录组分析:利用pCAMBIA3301-orf224转基因系和甘蓝型油菜中双11花蕾作转录组分析,共鉴定到1717个基因上调,1144个基因下调。对差异基因进行富集分析结果表明,差异基因在植物激素信号转导通路、能量代谢通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及错配修复等通路富集。因此,通过orf224基因的过表达等实验,说明orf224是Polima雄性不育基因。2.油菜Ogura细胞质基因orf138的过表达分析(1)orf138基因的克隆及其蛋白定位分析:从甘蓝型油菜Ogura CMS材料中克隆得到orf138基因。该基因序列全长417 bp,无内含子,编码138个氨基酸。构建好的pBin GFP4-orf138融合表达载体,转化农杆菌并注射至烟草叶片表皮细胞,观察其瞬时表达情况。结果显示,荧光信号出现在线粒体中,说明orf138蛋白在烟草表皮细胞线粒体中表达。(2)orf138基因的遗传转化分析:利用CaMV35S启动子构建了pCAMBIA3301-orf138过表达载体,并遗传转化甘蓝型油菜中双11,获得3个转基因株系。转基因系苗期叶色较浅,花粉染色后出现部分花粉败育,败育率为28.61%;转基因系株高降低,角粒数以及全株角果数减少。这表明orf138编码产物能够抑制油菜细胞生长,导致花粉败育,是雄性不育基因。同时,相对表达量检测结果表明转基因系的orf138基因表达量显著低于Ogura CMS。说明转基因系花粉不能全部败育是由orf138基因表达量不足所致。(3)orf138互作蛋白筛选:利用pGBKT7载体构建pGBKT7-orf138重组载体,将其作为“诱饵”与甘蓝型油菜中双11的cDNA酵母双杂交表达文库进行互作蛋白的筛选。在大量固体筛选培养基中筛选到9个互作蛋白,其中BnCSN5A参与生物体内多个调控过程,可能与不育有关。(4)转录组分析:利用pCAMBIA3301-orf138转基因系和甘蓝型油菜中双11花蕾作转录组分析,共鉴定到2416个基因上调,1766个基因下调。对差异基因进行富集分析,结果发现,差异基因在蔗糖与淀

关键词：甘蓝型油菜 CMS orf224 orf138

甘蓝OguCMS相关不育基因orf138互作蛋白筛选及其功能的研究

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甘蓝OguCMS相关不育基因orf138互作蛋白筛选及其功能的研究

作者：胡轼林甘肃农业大学

学位级别：硕士

在本实验室克隆了甘蓝OguCMS相关基因orf138的基础上,利用酵母双杂交技术构建了orf138全长、上游结构域142、下游结构域43138的酵母诱饵载体pGBKT7-1138、pGBK T7-43138、pGBKT7-142。通过转化酵母菌Y2HGold验证其自激活及毒性作用,mat... 详细信息

在本实验室克隆了甘蓝OguCMS相关基因orf138的基础上,利用酵母双杂交技术构建了orf138全长、上游结构域142、下游结构域43138的酵母诱饵载体pGBKT7-1138、pGBK T7-43138、pGBKT7-142。通过转化酵母菌Y2HGold验证其自激活及毒性作用,mating法筛选实验室前期构建的甘蓝花蕾酵母双杂交cDN A文库,从甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库中成功获取了与诱饵蛋白质相互作用的蛋白,并通过双分子荧光互补技术进一步验证了orf138与筛库所得到的候选基因乙烯应答转录因子RAP2-12的互作,其研究结论如下:1.以甘蓝OguCMS不育系花蕾c DNA为模板,克隆了orf138基因,并通过对orf138的结构域分析,亚克隆了上游N端结构域142、下游C端结构域43138,并成功构建了酵母诱饵载体pGBKT7-1138、pGBKT7-43138、pGBKT7-142,将其成功的转入酵母菌Y2HGold中并进行了诱饵载体自激活及毒性作用检测。证明其没有自激活作用且对酵母菌Y2HGold没有毒性,可以用于甘蓝cDNA文库的筛选。2.利用mating法从甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库中成功获取了与pGBK T7-1138、pGBKT7-43138、pGBK T7-142诱饵蛋白质相互作用的蛋白;pGBK T7-1138筛选到4个有匹配结果的候选蛋白基因;pGBKT7-142筛选到7个有匹配结果的候选蛋白基因;pGBKT7-43138筛选到3个有匹配结果的候选蛋白基因。3.根据mating法筛库所得到的阳性候选克隆,提取与诱饵互作的单一cDNA文库质粒,通过共转化验证试验确定了orf138与甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库中筛选到的ADP核糖基化因子、CHCH家族类Cox19蛋白、乙烯应答转录因子RAP2-12、谷胱甘肽S转移酶DHAR1的互作,并初步验证了与orf138全长发生互作的结构域位点,最后通过生物信息学手段分析推测出各自的功能。4.成功构建了pSPYNE-1138、pSPYNE-142、pSPYNE-43138和pSPYCE-1138D植物双分子荧光互补表达载体,双分子荧光互补实验结果表明:orf138与乙烯应答转录因子RAP2-12互作,其可能互作的结构域是142跨膜蛋白,为甘蓝OguCMS相关基因orf138功能机制的研究提供了新的线索。

关键词：甘蓝OguCMS 酵母双杂交 orf138 cDNA文库 BIFC

甘蓝细胞质雄性不育相关基因orf138的分子特性分析

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中国农学通报 2012年第4期28卷 104-109页

作者：朱琴康宗利简元才丁云花康俊根沈阳农业大学生物科学与技术学院沈阳110866 北京市农林科学院蔬菜研究中心北京100097

以甘蓝Ogura细胞质雄性不育系为材料,找出能够有效鉴定由orf138导致的甘蓝CMS的标记,并明确此基因在甘蓝OguCMS基因组中的位置。根据萝卜CMS相关基因orf138的序列信息,设计特异引物,并在甘蓝不同类型不育系和保持系中鉴定PCR产物的稳定... 详细信息

以甘蓝Ogura细胞质雄性不育系为材料,找出能够有效鉴定由orf138导致的甘蓝CMS的标记,并明确此基因在甘蓝OguCMS基因组中的位置。根据萝卜CMS相关基因orf138的序列信息,设计特异引物,并在甘蓝不同类型不育系和保持系中鉴定PCR产物的稳定性。随后利用Tail-PCR技术,扩增获得此基因的侧翼序列并进行了生物信息学分析。根据orf138的全长序列设计引物Bo138300BF/R,在甘蓝不育型材料中,能够稳定扩增出300bp左右的单一条带,而在其他细胞质不育类型和可育材料中均未扩出条带,经多次验证结果稳定可靠。甘蓝中orf138的上下游侧翼序列有效碱基1789bp,通过生物信息学分析,获得包括起始密码和终止密码的orf138的完整序列共417bp。同源性比对结果显示:与甘蓝型油菜、白菜和萝卜的orf138片段具有高度保守性。分析侧翼序列表明甘蓝orf138的3’端是由orf83、trnfM、orf125等基因片段构成的一个复杂序列。获得了甘蓝OguCMS特异的分子鉴定标记,明确了orf138在甘蓝线粒体中的位置,以上结果为甘蓝雄性不育的进一步研究奠定良好的基础。

关键词：甘蓝雄性不育 orf138 Tail-PCR技术

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一种紫色大白菜细胞质不育系的分子鉴定

华北农学报 2009年第3期24卷 174-178页

作者：张德双陈斌张凤兰余阳俊赵岫云于拴仓徐家炳北京蔬菜研究中心北京100097

为了获得紫色大白菜细胞质不育系的特异序列,鉴定该不育系所属的不育类型,应用设计的orf138上、下游引物PCR扩增6份材料:紫色大白菜CMS不育系,保持系07-721,杂交F1,3个回交BC1单株BC1-1、BC1-2和BC1-3。对获得的差异片段进行克隆、测序... 详细信息

为了获得紫色大白菜细胞质不育系的特异序列,鉴定该不育系所属的不育类型,应用设计的orf138上、下游引物PCR扩增6份材料:紫色大白菜CMS不育系,保持系07-721,杂交F1,3个回交BC1单株BC1-1、BC1-2和BC1-3。对获得的差异片段进行克隆、测序,同源性比较。结果表明,在紫色大白菜CMS不育系、杂交F1、3个回交BC1单株上均扩增到309 bp的特异产物,而保持系07-721没有扩增产物。测序和同源性比对结果表明,紫色大白菜CMS的orf138与萝卜Ogura不育系的orf138、芸薹属作物与萝卜Ogu CMS体细胞杂种的orf138同源性均达到99%,E值为2e-155。证明了紫色大白菜CMS不育系为一种改良的Ogura萝卜细胞质不育系,同时初步探讨了该不育系和紫色基因的应用前景。

关键词：紫色大白菜 OguCMS orf138 应用

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甘蓝细胞质雄性不育类型的分子鉴定

上海农业学报 2009年第3期25卷 19-22页

作者：陈烨丽陈学好陈锦秀缪体云薄天岳上海市农业科学院园艺研究所上海市设施园艺技术重点实验室上海201106 扬州大学园艺与植物保护学院扬州225009

为鉴定几种来源不同的甘蓝细胞质雄性不育材料的类型,获得与其不育性状相关的特异序列,基于同源序列的候选基因法,通过检索NCBI核苷酸及蛋白质数据库获得orf138和orf224开放阅读框序列,依据其保守序列设计2对引物,对甘蓝的5个不育系及... 详细信息

为鉴定几种来源不同的甘蓝细胞质雄性不育材料的类型,获得与其不育性状相关的特异序列,基于同源序列的候选基因法,通过检索NCBI核苷酸及蛋白质数据库获得orf138和orf224开放阅读框序列,依据其保守序列设计2对引物,对甘蓝的5个不育系及其保持系进行PCR扩增。orf138引物在5个甘蓝雄性不育系中均扩增出749 bp的片段,同源性比对发现这5个不育材料的特异片段与萝卜Ogu CMS所具有的Oguorf138基因同源度达100%,表明这几个来源不同的甘蓝细胞质不育材料同属萝卜细胞质不育类型。

关键词：甘蓝细胞质雄性不育 orf138 orf224

新型大白菜细胞质雄性不育系RC_7的不育分子机理探讨

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安徽农业大学学报 2008年第3期35卷 311-314页

作者：陈夫贵赵利民巩振辉张静荣王永成西北农林科技大学园艺学院杨凌712100 河南农业大学林学园艺学院郑州450002

用PCR方法在大白菜新型雄性不育系RC7中克隆出与雄性不育基因相关的片段,该片段与NCBI发布的orf138具有高度同源性,同源性为100%。说明RC7的不育机理与Ogu-CMS具有相似性,也证明了CMS基因的相对保守性。为RC7的利用奠定了理论基础,充实... 详细信息

用PCR方法在大白菜新型雄性不育系RC7中克隆出与雄性不育基因相关的片段,该片段与NCBI发布的orf138具有高度同源性,同源性为100%。说明RC7的不育机理与Ogu-CMS具有相似性,也证明了CMS基因的相对保守性。为RC7的利用奠定了理论基础,充实了大白菜细胞质雄性不育理论。

关键词：大白菜细胞质雄性不育系 orf138

原生质体非对称融合向花椰菜转移Ogura萝卜胞质雄性不育性的研究

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原生质体非对称融合向花椰菜转移Ogura萝卜胞质雄性不育性的研究

作者：惠志明河北农业大学

学位级别：硕士

原生质体非对称融合技术在作物遗传改良上具有重要的应用价值,通过该技术一方面可以将细胞质雄性不育性转移到栽培品种,缩短回交转育的年限,提高杂种优势的利用效率;另一方面也可以将野生种质资源中的抗性基因转入栽培品种,提高栽培种... 详细信息

原生质体非对称融合技术在作物遗传改良上具有重要的应用价值,通过该技术一方面可以将细胞质雄性不育性转移到栽培品种,缩短回交转育的年限,提高杂种优势的利用效率;另一方面也可以将野生种质资源中的抗性基因转入栽培品种,提高栽培种的抗逆性。筛选细胞分裂旺盛、不定芽发生频率较高的基因型作为受体亲本,是原生质体非对称融合成功的关键。本研究通过下胚轴不定芽诱导与原生质体培养的方法,从四种甘蓝(Brassica oleracea L.)基因型中筛选出了合适的基因型。以筛选出的花椰菜“傲雪菜花一号”为受体,与Ogu CMS甘蓝型油菜(供体)进行非对称融合,研究结果如下: 1 以傲雪菜花一号、天王雪白菜花(花椰菜)、京研四季(结球甘蓝)和まり绿(青花菜)为受体亲本的筛选材料,采用下胚轴不定芽诱导与原生质体培养的方法,从中筛选出不定芽发生频率较高基因型:京研四季、天王雪白菜花、傲雪菜花一号。较原生质体培养,下胚轴不定芽诱导的方法同样可以筛选出合适的基因型用以作为原生质体非对称融合的受体亲本。 2 采用PEG介导的非对称体细胞融合获得了花椰菜与Ogura萝卜胞质甘蓝型油菜种间体细胞杂种32株。 3 转育了与Ogu CMS相关的基因orf138。 4 与Ogura胞质不育性密切相关的线粒体DNA orf138的STS标记,可以作为花椰菜体细胞杂种Ogura胞质雄性不育性的分子鉴定。 5 在供、受体亲本生长的不同时期取材,进行不同种类同工酶的筛选,选出了两种在供受体亲本间表现差异明显的同工酶:过氧化物酶(POX)和磷酸葡萄糖变位酶(PGM)。 6 人工合成46条在甘蓝型油菜和甘蓝中已表现出多态性的10碱基RAPD随机引物,从中筛选出了两条供受体双亲中表现出差异的引物:H(TCG TGT TGC T)和3(CTC AGC CCA G)。 7 运用形态学、细胞生物学和分子生物学的方法鉴定获得的68株再生植株,其中32株为杂种植株。同时证明在非对称融合杂种植株鉴定中,必须采用多种鉴定方法才能得到可靠的结果。 8 随着紫外线辐射剂量的增加,融合细胞的分裂进程无明显变化,但是形成的愈伤组织的数量有明显减少的趋势。

关键词：花椰菜非对称融合紫外线 ogu胞质雄性不育 orf138

大白菜雄性不育系RC7不育性及不育相关基因克隆与分析

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大白菜雄性不育系RC7不育性及不育相关基因克隆与分析

作者：陈夫贵西北农林科技大学

学位级别：硕士

在大白菜新品种培育中,细胞质雄性不育系是生产杂交一代的理想亲本系。柯桂兰,赵利民等1997年从国外引进新型甘蓝型油菜胞质雄性不育材料RC97-1,以其作为不育源,与不同类型大白菜杂交、多代回交转育其不育性,从幼苗、花期到经济性状各... 详细信息

在大白菜新品种培育中,细胞质雄性不育系是生产杂交一代的理想亲本系。柯桂兰,赵利民等1997年从国外引进新型甘蓝型油菜胞质雄性不育材料RC97-1,以其作为不育源,与不同类型大白菜杂交、多代回交转育其不育性,从幼苗、花期到经济性状各阶段连续严格筛选,育成了不育性稳定、幼苗无黄化、蜜腺正常、配合力好,不育株率及不育度均达100%的大白菜胞质雄性不育系RC7,并利用RC7选育出优势明显、符合市场需求的大白菜新品种“金秋70”和“金秋90”,供生产上应用。为了明确不育系RC7花粉败育的机理,本试验试图从解剖学和分子生物学方面探索RC7不育形成的机理,为进一步利用这一优良不育源提供科学依据。 1.对RC7的花期花蕾和开放花朵采用石蜡切片的方法,进行形态解剖学分析发现,RC7花蕾出现败育,其败育发生在四分体时期,此时RC7绒毡层细胞异常肥大,四分体受到挤压后破裂并降解,无法形成正常的小孢子。 2.在RC7 mtDNA中扩增出一长度为417bp的特异片断,在其保持系B7中没有该片断。该特异片断与orf138同源性为100%。这一结果证明RC7的不育性与Ogu CMS不育系具有相似性,它的不育性来源于Ogu CMS萝卜不育源。 3.以RC7 mtDNA为模板进行PCR扩增,扩增出大小为588bp的特异条带。在其保持系B7中没有该条带。该片段可编码75个氨基酸,命名为orf75。orf75推导的氨基酸序列N末端与萝卜Ogu CMS所具有的orf138有28个氨基酸完全相同;C末端与钾依赖钠钙交换蛋白-1同源性为54%。推测orf75可能是orf138与钾依赖钠钙交换蛋白-1的编码基因发生重排产生的新的开放阅读框。该588bp片段还可编码一个含有一个疏水基团和一个跨膜区的67个氨基酸的蛋白片段,命名为orf67,它属可溶性蛋白。 4.以RC7为材料,采用RT-PCR方法,分析了588bp特异条带的转录。表明588bp特异条带在叶片、花蕾和花朵中均有表达。mtDNA与cDNA的同源性为100%,转录后没有后期加工。

关键词：大白菜细胞质雄性不育形态解剖学分析生物信息学分析 orf138