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利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒

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中国人兽共患病学报 2024年第2期40卷 140-146页

作者：柴萨萨蔡昊刘夏飞赵静宋敬东李金松裴银辉李利利段招军华北理工大学基础医学院河北省慢性疾病基础医学重点实验室唐山063000 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室北京102206 甘肃中医药大学公共卫生学院兰州730000

目的利用反向遗传技术产生nsp1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的nsp1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增... 详细信息

目的利用反向遗传技术产生nsp1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的nsp1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,采用已建立的“12质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救nsp1基因插入和表达EGFP的重组SA11轮状病毒。通过观察细胞病变效应和插入基因(EGFP)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、RT-PCR的测序结果及病毒基因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增。利用TCID 50法和qRT-PCR法,测定了rSA11和rSA11/nsp1-EGFP的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线。结果基于“12质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒rSA11/nsp1-EGFP,证明nsp1片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株。结论基于nsp1基因插入和表达EGFP的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础。

关键词： A组轮状病毒反向遗传外源基因 nsp1基因

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

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黑龙江畜牧兽医 2024年第3期 73-78页

作者：杨霞王爽云于林洋徐舸郑继豪王志朋张歆明刘燕玲张乐宜徐铮宋长绪华南农业大学动物科学学院广州510642

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV) nsp1基因 nsp5基因 N基因重组腺病毒免疫原性构建鉴定

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测基孔肯雅病毒方法的建立

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国际病毒学杂志 2024年第1期31卷 28-32页

作者：罗正汉蒯月璋韩一芳叶福强胡丹王太武汪春晖何君花张锦海东部战区疾病预防控制中心传染病防控一科南京210002 东部战区总医院妇产科南京210018

目的建立一种快速、准确、高灵敏度检测基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)的逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription enzymatic recombinase amplification,RT-ERA)的基因检测技术方法.方法以CHIKV非结构蛋白1(non-structural protein 1,nsp1)基因的保守序列为靶标,根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物,以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品,将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合.利用筛选的探针引物组合,对不同拷贝数的CHIKV进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的最低检出限;再分别以森林脑炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、新布尼亚病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的特异性.结果在40℃恒温条件下,利用荧光RT-ERA法10 min内可以完成CHIKV核酸扩增,该方法最低检出限可达10拷贝/μL,且当CHIKV核酸扩增为阳性时,其他病毒检测结果为阴性.结论成功建立一种可用于检测CHIKV nsp1基因的荧光RT-ERA法,该方法操作简便、检测限低且特异性好.

关键词：基孔肯雅病毒逆转录-酶促恒温扩增 nsp1基因

建立快速检测委内瑞拉马脑炎的RT-LAMP技术

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中华实验和临床病毒学杂志 2020年第1期34卷 78-82页

作者：曹杨李环冯龙斐陈璐萍胡博然袁静扬州大学旅游烹饪学院食品科学与工程学院225009 中国人民解放军疾病预防控制中心北京100071 河南科技学院新乡453000 上海海洋大学食品学院 201306 首都儿科研究所细菌室北京100020

目的利用逆转录-环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立快速检测委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)的方法。方法针对VEEV nsp1基因序列,设计了5套特异性引物进行筛选,再对反应温度进行优化,最后进行特异性、灵敏性及重复性评价。结果RT-LAMP检测VEEV的最适温度在65℃;同时选取11种病毒进行RT-LAMP,证明了RT-LAMP具有高特异性;运用RT-qPCR与RT-LAMP对比灵敏性,结果表现为RT-LAMP检测的灵敏性超RT-qPCR检测的100倍。针对VEEV进行RT-LAMP的重复性实验,结果为具有较好的重复性。结论RT-LAMP检测VEEV法具有简单快速高效的特点,且装置简单,特异性强、灵敏性高、重复性好。

关键词：委内瑞拉马脑炎病毒环介导等温扩增快速检测 nsp1基因

盖塔病毒非结构蛋白nsp1多克隆抗体的制备及鉴定

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畜牧与兽医 2023年第3期55卷 79-83页

作者：张洁李超凡翟晓风粟硕南京农业大学免疫研究所江苏南京210095

试验旨在获得能够特异性识别盖塔病毒(Getah virus, GETV)非结构蛋白nsp1的抗体,用于鉴定nsp1蛋白及其分布。采用RT-PCR技术扩增GETV的非结构蛋白nsp1基因,构建了nsp1蛋白的原核表达质粒pET-nsp1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导大量表达... 详细信息

试验旨在获得能够特异性识别盖塔病毒(Getah virus, GETV)非结构蛋白nsp1的抗体,用于鉴定nsp1蛋白及其分布。采用RT-PCR技术扩增GETV的非结构蛋白nsp1基因,构建了nsp1蛋白的原核表达质粒pET-nsp1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导大量表达。纯化原核表达的目的蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备了nsp1蛋白的多克隆抗体,间接ELISA效价达1∶10^(5)以上。Western blot和免疫荧光试验(IFA)结果显示,nsp1蛋白多克隆抗体与GETV有良好的反应性。nsp1蛋白多克隆抗体的制备,为进一步研究该蛋白在盖塔病毒复制周期中的功能奠定了基础。

关键词：多克隆抗体 nsp1基因非结构蛋白盖塔病毒