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广西中华眼镜蛇的蛇毒蛋白natrin对过氧化氢损伤乳大鼠原代心肌细胞钙超载及相关基因表达的影响

中国药理学与毒理学杂志 2016年第2期30卷 95-100页

作者：梁永红苏延旭马兴才张洪也蒋兴明陆世银苏志恒郑华宋慧广西医科大学药学院广西南宁530021 中国人民解放军第303医院药剂科广西南宁530021 南宁第七人民医院广西南宁530022

目的观察广西中华眼镜蛇（Naja naja atra）的蛇毒蛋白（natrin）对SD大鼠原代心肌细胞钙超载的影响,并探讨natrin对心肌的保护作用及对心肌钙、钾离子通道影响的可能作用机制。方法分别用natrin 5,25和125 mg·L^-1预处理原代SD乳大鼠... 详细信息

目的观察广西中华眼镜蛇（Naja naja atra）的蛇毒蛋白（natrin）对SD大鼠原代心肌细胞钙超载的影响,并探讨natrin对心肌的保护作用及对心肌钙、钾离子通道影响的可能作用机制。方法分别用natrin 5,25和125 mg·L^-1预处理原代SD乳大鼠心肌细胞24 h后,再以H2O20.3 mmol·L^-1诱导损伤,以Fluo-3为Ca^2＋荧光探针,应用激光共聚焦显微镜动态检测细胞内游离钙离子浓度变化;另外用natrin 5,25和125 mg·L^-1及维拉帕米（Ver）5 nmol·L^-1预处理24 h后,再以H2O20.3 mmol·L^-1诱导损伤15 min,FQPCR法检测心肌细胞钙离子通道Cav1.2,Calm,Ry R2和钾离子通道Kir6.2的m RNA表达情况。结果激光共聚焦显微镜检测结果发现,与正常对照组比较,H2O2作用3-15 min心肌细胞内钙荧光平均峰值增强49.37%（P〈0.01）;而给予natrin 5,25,125 mg·L^-1预处理24 h组该平均峰值分别增强27.52%,12.71%和5.15%,显著低于H2O2组（P〈0.01）。PCR结果表明,H2O2损伤组其心肌细胞Cav1.2,Calm,Ry R2及Kir6.2的m RNA表达分别为正常对照组的1.78倍,1.26倍,4.34倍和0.79倍（P〈0.01）;而给予natrin及维拉帕米干预组,细胞Cav1.2,Calm和Ry R2的m RNA表达较H2O2损伤组均显著降低（P〈0.01）,而Kir6.2的m RNA表达较H2O2损伤组显著升高（P〈0.05）。结论广西中华眼镜蛇natrin可明显减轻H2O2所致的心肌细胞钙超载,对心肌细胞过氧化损伤有良好的保护作用,其作用机制可能与降低H2O2损伤的心肌细胞的Cav1.2,Calm和Ry R2的m RNA表达及增加Kir6.2的m RNA表达有关。

关键词： natrin 钙超载肌细胞心脏离子通道

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广西眼镜蛇毒中natrin的克隆及在E.coli中的表达

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时珍国医国药 2012年第3期23卷 513-515页

作者：宋慧马兴才周燕焦杨周元聪舒雨雁广西医科大学药学院广西南宁530021 广西南宁第七人民医院 530022 中国科学院上海生化与细胞研究所上海200031 广西医科大学蛇毒研究所广西南宁530021

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌中表达广西眼镜蛇毒中natrin成熟蛋白。方法将来源于广西眼镜蛇毒的natrin蛋白的基因克隆至融合表达载体pMAL-c2x中,以N端融合了麦芽糖结合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表... 详细信息

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌中表达广西眼镜蛇毒中natrin成熟蛋白。方法将来源于广西眼镜蛇毒的natrin蛋白的基因克隆至融合表达载体pMAL-c2x中,以N端融合了麦芽糖结合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达natrin蛋白。超声破菌后,将上清液经Amylose树脂柱上纯化后,收集并冻干natrin融合蛋白,利用蛋白印迹分析其是否有natrin抗原活性。结果经蛋白印迹分析可知在50 kD处的条带具有natrin抗原活性。结论在大肠杆菌中可以表达出natrin蛋白。

关键词：广西眼镜蛇蛇毒 natrin 蛋白表达

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蛇毒活性蛋白natrin与双相生物陶瓷BCP协同促进成骨作用的研究

蛇毒活性蛋白Natrin与双相生物陶瓷BCP协同促进成骨作用的研究

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作者：靳攀广西医科大学

学位级别：硕士

目的：通过体内和体外实验研究生物活性因子广西眼镜蛇毒活性蛋白natrin和具有骨诱导性的双相生物陶瓷（BCP）对大鼠成骨的影响，探讨活性因子与活性陶瓷材料协同促进成骨的作用，为临床修复大面积颅骨缺损提供依据。方法：（1）考察单... 详细信息

目的：通过体内和体外实验研究生物活性因子广西眼镜蛇毒活性蛋白natrin和具有骨诱导性的双相生物陶瓷（BCP）对大鼠成骨的影响，探讨活性因子与活性陶瓷材料协同促进成骨的作用，为临床修复大面积颅骨缺损提供依据。方法：（1）考察单独natrin蛋白对成骨细胞的作用：体外培养3-7天SD乳鼠原代成骨细胞，用不同浓度的蛋白natrin（0g/ml,2.5g/ml,5g/ml和10g/ml）干预，分别于2,5，8天测定MTT，ALP活性和成骨相关基因（BMP2， RUNX2，ALP，BSP，OCN，COL1A1）表达，并行FDA/PI、鬼笔环肽、一型胶原、ALP和茜素红染色;（2）考察natrin蛋白及BCP活性陶瓷对成骨细胞作用的体外实验：将原代成骨细胞种植在多孔HA/β-TCP双相生物陶瓷（BCP,质量比6:4，直径12mm，厚度2mm，孔隙率>75%）材料上，然后用不同浓度的蛋白natrin（0g/ml,1.25g/ml,2.5g/ml和5g/ml）干预，分别于2,5,8天检测MTT，ALP活性和成骨相关基因（BMP2，RUNX2，ALP，BSP，OCN，COL1A1）表达，并行FDA/PI、鬼笔环肽染色和扫描电镜;（3）natrin蛋白及BCP活性陶瓷用于颅骨缺损修复的动物实验：将成年雄性SD大鼠40只（体重300±20g）随机分配成四组（A, B, C, D组，每组10只），建立矢状缝与人字缝十字交叉右上象限5mm直径圆形颅骨缺损模型，A、B组为不加材料的空白组，C、D组植入双相生物陶瓷（BCP，质量比6:4，直径5mm，厚度2mm,孔隙率>75%）材料，抗炎3天后，A、C组注射等量生理盐水，B、D组于颅骨缺损局部注射natrin蛋白浓度为5g/ml、2.5g/ml的生理盐水0.5ml，于术后1个月、2个月每组分别处死5只大鼠，行大体观察、硬组织切片，锥束CT扫描。结果：（1）考察单独natrin蛋白对成骨细胞的作用：在二维培养中，MTT、ALP活性与成骨相关基因表达的检测等结果表明单独natrin对成骨细胞的增殖和分化具有促进作用，其最适作用浓度为5g/ml;（2）考察natrin蛋白及BCP活性陶瓷对成骨细胞作用的体外实验：在三维培养中，MTT、扫描电镜、ALP活性与成骨相关基因表达的检测等结果表明natrin和BCP陶瓷对成骨细胞的增殖和分化具有协同促进作用，尤其是在natrin蛋白为2.5g/ml时作用最为明显;（3）natrin蛋白及BCP活性陶瓷用于颅骨缺损修复的动物实验：大体观察、锥束CT扫描和硬组织切片等检测看出BCP有良好的生物相容性，可促进颅骨缺损修复，添加蛋白natrin后促进效果更为明显。结论：natrin蛋白及BCP活性陶瓷可协同促进颅骨缺损修复，具有较好的临床开发价值。

关键词：蛇毒 natrin 双相生物陶瓷 BCP 协同成骨

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广西眼镜蛇毒蛋白natrin在体外诱导人肿瘤细胞SMMC-7721和SKOV3凋亡的研究

广西眼镜蛇毒蛋白natrin在体外诱导人肿瘤细胞SMMC-7721和SKOV3凋...

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作者：徐星新广西医科大学

学位级别：硕士

目的用凝胶层析，离子交换层析，FPLC分离的方法，从广西眼镜蛇的毒液中分离纯化得到高纯度的natrin;观察natrin在体外对人肝癌SMMC-7721细胞和人卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用和凋亡诱导作用，并研究natrin诱导SMMC-7721细胞凋亡的机... 详细信息

目的用凝胶层析，离子交换层析，FPLC分离的方法，从广西眼镜蛇的毒液中分离纯化得到高纯度的natrin;观察natrin在体外对人肝癌SMMC-7721细胞和人卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用和凋亡诱导作用，并研究natrin诱导SMMC-7721细胞凋亡的机制。方法（1）广西眼镜蛇的毒液经Sephadex G50凝胶过滤及CM SepharoseCL-6B阳离子交换柱，再通过FPLC mono-S柱层析分离纯化得到natrin;再用SDS-PAGE和质谱分析测定natrin的纯度和相对分子质量。（2）以不同浓度的natrin作用于SMMC-7721细胞和SKOV3细胞24h后，用MTT法检测细胞的生长抑制率。（3）应用透射电子显微镜法、AO/EB双染色法观察细胞凋亡形态。（4）流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期。（5）FQ-PCR法分析被natrin作用24h后，人肝癌SMMC-7721细胞中凋亡相关基因bax、bcl-2、p53、caspase-3mRNA的表达量变化。结果（1）从广西眼镜蛇毒中分离纯化出高纯度蛋白组分natrin，经质谱测定分子量为24.937ku。（2）natrin对人肝癌细胞SMMC-7721和人卵巢癌细胞SKOV3有体外抑制作用，随着药物浓度的增大抑制率也随之增大，24h半数抑制浓度IC50分别为138.69mg.L-1和26.13mg.L-1。（3）给药后，荧光显微镜下与透射电子显微镜下两种细胞呈现典型的凋亡形态改变。（4）流式细胞仪检测到随着药物浓度的增大凋亡细胞百分数也随之增大。（5）natrin能诱导SMMC-7721细胞发生S期和G2/M期阻滞。（6）natrin能降低bax、bcl-2、p53、caspase-3mRNA在人肝癌SMMC-7721细胞中的表达量，随着剂量的增大，各基因的mRNA表达量随之降低。结论从广西眼镜蛇毒中分离纯化得到的蛋白组分natrin在体外能抑制人肿瘤细胞SMMC-7721和SKOV3增殖并诱导其凋亡;其中诱导SMMC-7721细胞凋亡的机制可能与natrin引起S期、G2/M期阻滞和降低细胞中bcl-2mRNA表达量有关。

关键词：广西眼镜蛇毒蛋白 natrin 人肝癌SMMC-7721细胞细胞凋亡凋亡机制

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广西眼镜蛇毒natrin的分离纯化及抗人肿瘤细胞生物活性研究

广西眼镜蛇毒Natrin的分离纯化及抗人肿瘤细胞生物活性研究

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作者：蒋兴明广西医科大学

学位级别：硕士

目的：用柱层析法从广西眼镜蛇毒中分离纯化出蛋白natrin;探讨natrin对抗人肿瘤细胞的生物活性研究。方法：（1）广西眼镜蛇粗毒经Sephadex G75凝胶过滤及CM SepharoseCL-6B阳离子交换柱及FPLC mono-S柱层析进行分离纯化得到natrin... 详细信息

目的：用柱层析法从广西眼镜蛇毒中分离纯化出蛋白natrin;探讨natrin对抗人肿瘤细胞的生物活性研究。方法：（1）广西眼镜蛇粗毒经Sephadex G75凝胶过滤及CM SepharoseCL-6B阳离子交换柱及FPLC mono-S柱层析进行分离纯化得到natrin蛋白;再用SDS-PAGE鉴定natrin的纯度和相对分子质量。（2）采用MTT法,以natrin浓度分别为0.625,1.25,12.5,125,250μg/ml处理人肝癌BEL-7721细胞株、HEPG2细胞株、人卵巢癌SKOV3细胞株和人宫颈癌SIHA细胞株等四种人肿瘤细胞作用24h,观察不同浓度natrin对四种人肿瘤细胞的毒性和生长抑制率;（3）以不同浓度处理人卵巢癌SKOV3细胞株24小时后,固定脱干包埋切片染色后利用电子显微镜的方法观察人卵巢癌SKOV3细胞株的形态变化;（4）以不同浓度处理人卵巢癌SKOV3细胞株24小时后,用AO/EB试剂染色利用倒置荧光显微镜的方法观察人卵巢癌SKOV3细胞株的染色及形态变化;（5）以不同浓度处理人卵巢癌SKOV3细胞株24小时后,采用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测人卵巢癌SKOV3细胞株的凋亡率。结果：（1）从广西眼镜蛇毒中分离纯化出natrin,经测定其相对分子质量为25Ku,质谱测定分子量为24.937Ku,测得N端的序列为NVDFNSESTRRKKKQKEIVD;（2）natrin对四种人肿瘤细胞均有细胞毒性作用,且呈剂量依赖关系,尤其是对SKOV3的抑制作用更强,对SKOV3作用24h的IC50值为1.47ug/ml;电镜观察可观察到人卵巢癌SKOV3细胞株的凋亡细胞的主要特点为：核染色质固缩、边集,核膜皱褶,胞质紧实,电子密度增加,及凋亡小体现象;倒置荧光显微镜下可观察到人卵巢癌SKOV3的凋亡细胞的主要特点为：细胞体积缩小,染色质固缩,橘红色荧光增强;流式细胞仪检测到人卵巢癌SKOV3细胞株的凋亡细胞的的早期凋亡率在一定剂量内随natrin浓度的增高而增加,但是到达最大值后凋亡率反而随着natrin的浓度的增加而有所降低,各浓度组与对照组的细胞凋亡率比较仍有明显差异（P＜0.05）

关键词：广西眼镜蛇毒 natrin 分离纯化抗肿瘤活性凋亡

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广西眼镜蛇毒中natrin的抗脂质过氧化作用

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大众科技 2011年第10期13卷 178-179页

作者：黄燕军宋慧李福森李姝焦杨黄昱广西医科大学药学院广西南宁530021

从广西眼镜蛇毒中分离出natrin蛋白,研究其对大鼠肝脏脂质过氧化作用的影响。结果表明:从广西眼镜蛇毒中分离出纯的natrin组分,对大鼠肝脏脂质过氧化具有抑制作用。

关键词：广西眼镜蛇毒 natrin 脂质过氧化

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