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作者：刘磊中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

背景:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)全球发病率约25%,是目前世界上最常见的慢性肝脏疾病。NAFLD由肝脏脂质沉积引发,并与慢性肝炎和肝细胞损伤有关,可造成肝纤维化,最终可导致肝硬化和肝细胞癌的发生,是终末期肝病和肝移植的主要原因之一... 详细信息

背景:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)全球发病率约25%,是目前世界上最常见的慢性肝脏疾病。NAFLD由肝脏脂质沉积引发,并与慢性肝炎和肝细胞损伤有关,可造成肝纤维化,最终可导致肝硬化和肝细胞癌的发生,是终末期肝病和肝移植的主要原因之一。目前研究认为,过度脂质沉积与NAFLD的发生发展密不可分,但肝细胞内过量脂质并非诱发非酒精性脂肪性肝炎(nash)的直接原因。线粒体是细胞必不可少的细胞器,是细胞的能量工厂,对维持细胞的生理功能具有不可替代的作用。大量的研究证据表明,在nash发生发展过程中,线粒体功能障碍是重要因素。现有研究对线粒体的认识越来越深入,从代谢功能延伸至各个分子的作用机制及相互影响。线粒体作为细胞内的多功能细胞器,代谢活跃,具有三羧酸循环、脂肪酸β氧化、氧化磷酸化、能量转化及离子存储等重要功能。此外,线粒体还参与细胞的信号传递、分化和凋亡等过程,并在细胞物质代谢中也发挥重要作用。线粒体具有双层膜结构,线粒体内外物质的运输大多依赖转运蛋白。因此,线粒体膜上的转运蛋白在其能量代谢和物质代谢中均发挥了重要作用。定位于线粒体内膜上的SLC25(Solute carriers family 25)家族是一组重要的线粒体转运载体,其功能是跨线粒体内膜转运各种物质,对维持线粒体功能稳态具有极其重要作用。作为SLC25家族的一员,SLC25A28在人体内普遍表达,定位于线粒体内膜,主要参与调控线粒体对铁的利用与存储,又称为Mitoferrin 2。目前,对SLC25A28在神经系统、心血管系统、生殖系统中进行了研究。有研究发现,SLC25A28分子是小鼠肝脏再生和细胞增殖所必需。然而,SLC25A28对线粒体功能的具体影响及其在nash进展中的作用与机制仍需深入研究。研究目的:探究SLC25A28的表达与NAFLD发生发展的相关性,研究SLC25A28缺失对肝脏形态学、生理学功能以及肝细胞线粒体结构和功能的影响,研究SLC25A28缺失对小鼠nash进展的影响和主要机制。实验方法:(1)利用常规分子生物学的方法,制备兔抗人SLC25A28多克隆抗体。利用小鼠单纯性脂肪肝和细胞脂肪变模型,分析SLC25A28的表达情况。(2)采用SLC25A28 floxed小鼠与Alb-Cre小鼠交配,建立肝脏特异性SLC25A28敲除小鼠。通过正常喂养(Fed)和禁食(Fasted)处理,利用HE、油红O(Oil Red O)染色和TG定量检测,确定SLC25A28缺失对肝脏脂质含量的影响。采用q PCR和Western blot的方法,分析SLC25A28缺失对肝脏脂质代谢关键分子表达的影响(CPT1、ACC1、FASN)。(3)利用透射电子显微镜,观察SLC25A28缺失小鼠肝细胞超微结构变化。利用细胞染色、Western blot、q PCR等方法分析SLC25A28缺失对肝细胞线粒体功能的具体影响。(4)利用胆碱蛋氨酸缺乏饮食(MCD)建立小鼠nash模型,利用HE染色、免疫组化、q PCR和定量检测等方法,分析SLC25A28缺失对小鼠肝脏氧化应激、脂质过氧化、炎症发生的影响。结果:(1)成功制备了兔抗人SLC25A28多克隆抗体,并发现SLC25A28在小鼠单纯性脂肪性肝和脂肪酸诱导的Hep G2细胞中表达升高。(2)为了明确SLC25A28与肝脏脂肪代谢是否相关,我们首先研究了SLC25A28在小鼠脂肪肝中的表达情况,并利用肝脏特异性SLC25A28敲除小鼠,探究了SLC25A28缺失对肝脏脂质代谢的影响。结果发现:(1)在正常喂养(Fed)条件下,SLC25A28缺失小鼠肝脏组织结构和脂滴含量无明显差异。(2)在禁食(Fasted)后,SLC25A28缺失小鼠肝脏脂滴含量增加,脂质含量升高。(3)禁食后,SLC25A28缺失影响肝脏脂质代谢过程中的关键酶CPT1、FASN、ACC1的表达,促进肝脏脂质合成,并导致脂质沉积。(3)为了探究SLC25A28缺失对肝细胞线粒体的影响,我们从线粒体的结构和功能两个方面进行了研究,结果发现:(1)SLC25A28缺失会造成肝细胞线粒体体积显著增加,但数量减少,并伴有不同程度的内外膜分离。(2)SLC25A28缺失引起线粒体膜电位降低。(3)SLC25A28缺失引起铁代谢紊乱并抑制线粒体对铁的利用,造成线粒体Fe-S簇蛋白和Heme合成减少,利用不足,引起线粒体氧化呼吸链复合体功能不全,ATP合成减少,耗氧量降低,表现出线粒体功能障碍。(4)为了认识SLC25A28缺失肝脏炎症发生的主要机制,我们采用小鼠nash模型,发现SLC25A28缺失会引起肝脏氧化应激增强,脂质过氧化物产生增多,巨噬细胞激活和淋巴细胞聚集,同时炎性因子表达升高,说明SLC25A28缺失促进nash的进展。结论:(1

关键词： SLC25A28 铁代谢线粒体功能炎性反应 nash

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一类主从博弈nash均衡点的存在性和稳定性

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江西师范大学学报（自然科学版） 2019年第3期43卷 277-281页

作者：蔡江华贾文生刘露萍贵州大学数学与统计学院贵州贵阳550025

针对单个领导者与多个跟随者的主从博弈,在较弱的条件下,利用Berge极大值定理、Fan-Glicksberg不动点定理,证明了一类主从博弈nash均衡点的存在性,推广和改进了已有的一些结果.在均衡点的稳定性方面,从最佳回应拓扑的角度证明了此类主... 详细信息

针对单个领导者与多个跟随者的主从博弈,在较弱的条件下,利用Berge极大值定理、Fan-Glicksberg不动点定理,证明了一类主从博弈nash均衡点的存在性,推广和改进了已有的一些结果.在均衡点的稳定性方面,从最佳回应拓扑的角度证明了此类主从博弈存在nash均衡点集的本质连通区.

关键词：主从博弈 nash 均衡点伪连续本质连通区拟凹

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甘乐联合多烯磷脂酰胆碱治疗nash疗效观察

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山东医药 2009年第24期49卷 103-104页

作者：王晓杨国红河南中医学院第一附属医院郑州450000

目前对非酒精性脂肪性肝炎(nash)的治疗尚缺乏特效药物.2006年11月～2008年12月,我们运用甘乐联合多烯磷脂酰胆碱治疗nash,取得了良好疗效.现报告如下.

关键词：多烯磷脂酰胆碱疗效观察 nash 治疗甘乐非酒精性脂肪性肝炎

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基于网络药理学探究祛痰活血方治疗非酒精性脂肪性肝炎（nash）的作用机制以及体外验证

基于网络药理学探究祛痰活血方治疗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的...

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作者：吴霞西南医科大学

学位级别：硕士

目的:祛痰活血方是名老中医孙同郊教授多年来总结的经验方,通过前期临床试验发现其能治疗非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,nash）,但其具体作用机理还不明确,本研究通过网络药理学预测祛痰活血方治疗nash的作用通路,... 详细信息

目的:祛痰活血方是名老中医孙同郊教授多年来总结的经验方,通过前期临床试验发现其能治疗非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,nash）,但其具体作用机理还不明确,本研究通过网络药理学预测祛痰活血方治疗nash的作用通路,以及后期细胞实验验证祛痰活血方治疗nash的具体作用机制。方法:从中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）获取祛痰活血方的有效活性成分及其靶基因,从genecards、OMIM、Pharm Gkb、TTD以及Drug Bank五个数据库提取nash疾病基因。利用Cytoscape软件对这些数据进行可视化分析,构建活性成分-基因-靶点网络图、PPI蛋白互作图以及GO和KEGG的富集分析,后期进行细胞实验验证。通过分离nash模型大鼠原代肝细胞和原代kupffer细胞,建立体外nash大鼠细胞模型,利用CCK8实验筛选祛痰活血方含药血清最佳作用浓度,设立对照组（C）、nash模型组（N）、5%祛痰活血方组（L）、7.5%祛痰活血方组（M）和10%祛痰活血方组（H）五个组,检测祛痰活血方含药血清作用后原代肝细胞谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、甘油三酯（triglyceride,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）的分泌情况,以及细胞油红O检测细胞脂肪变情况;利用Western Blotting、q-PCR检测大鼠原代肝细胞以及原代Kupffer细胞的SOCS1、TLR4、Myd88、NF-k B的表达情况;设计SOCS1 si RNA转染试剂沉默原代Kupffer细胞中的SOCS1基因,利用免疫荧光、WB、q-PCR验证,并检测SOCS1/TLR4细胞信号通路相关因子的表达情况,探讨祛痰活血方治疗nash的具体作用机制。结果:（1）利用网络药理学对祛痰活血方进行分析,得到祛痰活血方有效活性成分130个,祛痰活血方中药靶点基因1243个,分别从genecards、OMIM、Pharm Gkb、TTD以及Drug Bank五个数据库提取nash疾病基因8579个,获得祛痰活血方与nash疾病交集基因147个,通过PPI网络分析、GO与KEGG富集分析显示,祛痰活血方中药靶基因与nash疾病基因之间存在着复杂的关系,祛痰活血方能够通过改善炎症通路、脂质代谢等多个靶点治疗nash。于是本研究结合前期实验结果与网络药理学分析结果、在线JASPAR数据库预测,探究祛痰活血方通过SOCS1/TLR4/NF-k B细胞信号通路治疗nash的具体作用机制。（2）体外细胞实验结果发现,祛痰活血方能够明显降低大鼠原代肝细胞ALT、AST、TG、TC,改善肝细胞脂质沉积情况,缓解肝细胞损伤（P＜0.05）;在nash模型中发现TLR4、Myd88、NF-kB的表达明显升高;当加入祛痰活血方含药血清之后,TLR4、Myd88、NF-kB表达降低（P＜0.05）,且呈现一定剂量依耐性;利用在线JASPAR数据库发现,SOCS1与TLR4/NF-κB信号通路有关,同时,检测原代肝细胞提取6h、24h、48h后SOCS1表达无统计学意义（P＞0.05）,而在原代Kupffer细胞中,nash组SOCS1的表达明显低于对照组（P＜0.05）;利用SOCS1 si RNA转染试剂沉默原代Kupffer细胞中的SOCS1蛋白表达后,TLR4、Myd88以及NF-k B表达明显升高,当加入祛痰活血方（10%）后,SOCS1表达升高,TLR4、Myd88、NF-k B表达降低（P＜0.05）。结论:祛痰活血方治疗nash的机制主要是作用于细胞炎症以及脂质代谢、胰岛素抵抗等细胞信号通路,体外细胞验证实验发现祛痰活血方能够治疗nash,主要是改善肝脏炎症反应以及脂质调节作用,其机制主要是通过调控nash模型中Kupffer细胞SOCS1/TLR4/NF-kB信号通路。

关键词：祛痰活血方 nash 枯否细胞炎症反应

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基于网络药理学探讨EGFR/PI3K/AKT信号通路在中药慈菇消脂方抗nash相关炎症作用中的机制

基于网络药理学探讨EGFR/PI3K/AKT信号通路在中药慈菇消脂方抗NAS...

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作者：郑兰兰甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的1、探讨EGFR的表达,观察EGFR对PI3K/AKT信号通路中关键基因表达及功能的影响;进一步探讨EGFR能否通过调控PI3K/AKT信号通路进而抑制nash相关炎症的进展。2、探讨慈菇消脂方能否抑制nash相关炎症过程中炎症因子的表达。3、探讨中药... 详细信息

目的1、探讨EGFR的表达,观察EGFR对PI3K/AKT信号通路中关键基因表达及功能的影响;进一步探讨EGFR能否通过调控PI3K/AKT信号通路进而抑制nash相关炎症的进展。2、探讨慈菇消脂方能否抑制nash相关炎症过程中炎症因子的表达。3、探讨中药复方慈菇消脂方通过EGFR/PI3K/AKT信号通路干预nash炎症的进展。方法基于网络药理学预测得到慈菇消脂方(CXD)治疗nash“炎癌”转化的潜在作用靶点和信号通路,并对关键靶点进行分子对接,经动物实验验证CXD对该信号通路的调控作用。选用SPF级雄性C57BL/6J小鼠8周龄48只,采用蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCD)喂养小鼠,随机将小鼠分为6组,模型组8只,其余每组8只。分别为(1)正常组(空白对照组);(2)模型组;(3)模型组+Erlotinib组;(4)模型组+中药低剂量组;(5)模型组+中药中剂量;(6)模型组+中药高剂量;制备非酒精性脂肪性肝炎(nash)模型,造模成功后分别给予CXD及EGFR抑制剂干预28天,干预结束后处死小鼠。苏木素-伊红法(HE)观察各组小鼠肝脏组织形态学变化;免疫组化法染色检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B(AKT)蛋白表达;蛋白免疫印迹法(Wentern blot)检测各组小鼠肝组织表皮生长因子受体(EGFR)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B(AKT)蛋白相对表达量;酶联免疫吸附实验(ELISA)用于评估每组小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α(白细胞介素-1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α)的相对表达水平。结果1、网络药理学:经网络药理学筛选得到慈菇消脂方潜在活性成分284个、潜在治疗靶点159个及关键靶点20个。慈菇消脂方可影响细胞增殖、炎症反应等多个生物过程,涉及肿瘤、PI3K/AKT等多个信号通路;经分子对接进行初步验证,发现慈菇消脂方中的核心活性成分豆甾醇与核心靶点EGFR结合活性较低,结合良好。2、HE染色结果显示:正常组小鼠肝索结构正常,肝细胞排列有序,肝小叶结构完整。模型组小鼠肝索排列紊乱,肝细胞肿胀,胞质疏松,出现大量脂滴空泡和炎症细胞浸润。与模型组相比较,慈菇消脂方各剂量组小鼠肝脏体积增大,颜色向正常状态恢复,肝组织脂肪变性、炎症有明显改善。与模型组相比,Erlotinib组无明显改善。3、免疫组化染色结果显示:与正常组相比,模型组小鼠肝脏中PI3K、AKT蛋白在肝细胞胞核和胞质中明显沉积、着色加深(P0.05)。4、Western Blot实验结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠肝组织中PI3K和AKT蛋白的表达水平显著上调(P0.05)。5、ELISA实验结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平显著上调(P0.05)。结论1、在nash动物模型中,抑制EGFR的表达后,PI3K、AKT的表达增加,并且肝脏损伤加重,说明EGFR下调后可能通过激活PI3K/AKT信号通路,而加剧了nash炎症的进展。2、中药慈菇消脂方可能通过上调EGFR的表达,减弱PI3K、AKT的表达发挥其对肝脏的保护作用,进而干预nash的进展。3、中药慈菇消脂方可以明显改善肝脏的炎症程度,降低炎症相关蛋白的表达,延缓了nash炎症的慢性转化。

关键词：网络药理学慈菇消脂方 nash 炎癌 EGFR PI3K/AKT信号通路

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双环醇片治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)

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世界华人消化杂志 2005年第1期13卷 139-140页

作者：朱越卫生部北京医院北京市100730

目的:观察双环醇片治疗非酒精性脂肪性肝炎的临床疗效. 方法:67例非酒精性脂肪性肝炎患者随机分为两组,治疗组36例服用双环醇片(商品名:百赛诺),阴性对照组29例服用水飞蓟素(复方益肝灵).观察治疗前后血清转氨酶、血脂及B超声像图等的... 详细信息

目的:观察双环醇片治疗非酒精性脂肪性肝炎的临床疗效. 方法:67例非酒精性脂肪性肝炎患者随机分为两组,治疗组36例服用双环醇片(商品名:百赛诺),阴性对照组29例服用水飞蓟素(复方益肝灵).观察治疗前后血清转氨酶、血脂及B超声像图等的变化情况. 结果:双环醇片能够有效降低脂肪性肝炎患者的血清转氨酶、血脂的水平,与阴性对照组相比,具有统计学差异(P<0.05). 结论:双环醇片具有显著的保肝降酶和降低血脂的作用.

关键词：双环醇片治疗非酒精性脂肪性肝炎血清转氨酶 nash 服用血脂结论水平目的

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HDAC抑制剂givinostat靶向抑制HSC激活防治nash及肝纤维化研究

HDAC抑制剂givinostat靶向抑制HSC激活防治NASH及肝纤维化研究

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作者：黄鹤鸣上海交通大学

学位级别：硕士

研究背景:非酒精性脂肪性肝炎（nash）及肝纤维化是当今临床面临的巨大挑战,目前尚无有效防治方法。因此,探寻nash及肝纤维化防治的新靶点及新策略显得尤为重要。基于靶向肝星状细胞（HSC）可治疗肝纤维化及表观机制在HSC激活中的关键作... 详细信息

研究背景:非酒精性脂肪性肝炎（nash）及肝纤维化是当今临床面临的巨大挑战,目前尚无有效防治方法。因此,探寻nash及肝纤维化防治的新靶点及新策略显得尤为重要。基于靶向肝星状细胞（HSC）可治疗肝纤维化及表观机制在HSC激活中的关键作用,通过构建基于细胞的高通量筛选方法,筛选表观抑制剂库中的小分子化合物,前期筛选研究发现HDAC抑制剂givinostat可强力抑制HSC激活,提示givinostat可能对nash及肝纤维化具有治疗作用。目的:（1）探讨givinostat对四氯化碳（CCL4）诱导小鼠肝纤维化的影响及机制;（2）探讨givinostat对小鼠nash及相关肝纤维化的影响及机制。方法:以转化生长因子-β（TGF-β）诱导肝星状细胞系LX2作为HSC激活的细胞模型,以RAW 264.7作为炎症细胞模型;分别以CCL4和胆碱/蛋氨酸缺乏饲料（MCD）或高脂饮食（HFD）喂养构建2种肝纤维化小鼠模型;运用生化检测、细胞组织病理学、高通量测序及分子生物学检测givinostat干预对HSC激活、nash及肝纤维化的影响及机制。结果:（1）与模型组相比,免疫组化及Western blot检测显示:givinostat可在体内外显著抑制HSC a-SMA和col1a基因表达,生化检测及组织病理学显示:givinostat干预可明显改善CCL4诱导的小鼠肝纤维化;高通量测序及RT-q PCR验证DMKN、MSLN和UPK3B是givinostat阻断HSC激活过程中下调最显著的三个基因,Knockdown DMKN、MSLN和UPK3B也显示可显著抑制TGF-β诱导的HSC激活;（2）与模型组相比,Western blot及RT-q PCR显示:givinostat干预可显著提高巨噬细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平,抑制肝巨噬细胞和nash肝组织促炎细胞因子及趋化因子表达;降低NAS评分及改善nash相关肝纤维化;高通量测序显示:givinostat干预最显著的信号通路涉及代谢和炎症,givinostat可抑制炎症相关基因如TNF-a、MCP-1、IL-6、CXCL2、CCL5及脂肪酸合成基因FAS、SREBP-1C、SCD1表达;上调脂肪酸β氧化相关基因如CYP7A、ACOX1、COX5a、UCP2及PDK4表达。结论:（1）givinostat可通过上调组蛋白乙酰化水平,抑制HSC DMKN、MSLN和UPK3B基因表达,阻抑HSC激活,改善CCL4诱导的小鼠实验性肝纤维化;（2）givinostat可通过抑制肝细胞脂肪酸合成,促进脂肪酸β氧化,抑制肝巨噬细胞促炎细胞因子及趋化因子表达,减轻肝组织炎症和脂肪变,阻抑HSC激活,由此改善nash及相关肝纤维化,提示givinostat有潜力成为防治nash及肝纤维化的创新型药物。

关键词：肝纤维化 nash HSC 表观遗传组蛋白去乙酰化酶抑制剂

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外泌体miR-146a-5p在nash发生发展过程中的作用及机制研究

外泌体miR-146a-5p在NASH发生发展过程中的作用及机制研究

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作者：王艺奋青岛大学

学位级别：硕士

研究目的：1.通过GEO数据库探明非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic Steatohepatitis,nash)患者血浆外泌体中miR-146a-5p的表达水平。2.通过蛋氨酸胆碱缺乏(Methionine-and choline deficient,MCD)饮食构建nash小鼠模型,探明nash小鼠血浆外泌体中miR-146a-5p的表达水平。3.通过超速离心法制备高表达miR-146a-5p的外泌体,在细胞水平探讨其对巨噬细胞M1极化的作用,为进一步体内实验治疗nash提供理论基础。研究方法：1.通过GEO数据库检索与课题相关的数据集;使用“Analyze with GEO2R”对系列数据进行在线分析;获取该基因所有样品的具体数值后通过“Graph Pad prism 9”分析数据。2.将7周龄小鼠随机分成2组(6只/组),分别给予正常饮食和MCD饮食5周,每周记录小鼠体重;实验周期结束后,检测两组小鼠肝组织内甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)含量和CD80的表达情况;检测小鼠空腹血浆谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,ALT)和IL-6的含量;解剖小鼠,取出肝脏后,拍照并观察两组小鼠肝脏形态并称重,取少许肝组织做病理切片;提取小鼠血浆外泌体后,检测两组小鼠血浆外泌体中miR-146a-5p的表达水平。最后通过原代细胞提取,进一步明确nash小鼠肝细胞和肝巨噬细胞内miR-146a-5p的表达情况。3.将50 nmol/L miR-146a-5p mimic或阴性对照转染至诱导分化的巨噬细胞内,转染48h后收集细胞,通过western blot检测巨噬细胞内M1型巨噬细胞的标记蛋白CD86的表达情况;从巨噬细胞中分离总RNA,将m RNA逆转录为c DNA,以GAPDH为内参,定量CD86的表达;通过免疫荧光标记CD86,进一步明确miR-146a-5p在M1极化过程中发挥的作用。4.分别将50 nmol/L miR-146a-5p mimic或阴性对照转染至Hep G2细胞中,转染48 h后收集细胞培养基上清,通过超速离心的方法制备高表达miR-146a-5p的外泌体和对照组外泌体。通过透射电子显微镜镜观察外泌体的形态;通过western blot检测外泌体标记蛋白CD63的表达情况;从外泌体中分离总RNA,将miRNA逆转录为c DNA,以U6为内参,定量miR-146a-5p的表达。5.将高表达miR-146a-5p的外泌体或对照组外泌体加入至巨噬细胞中共孵育48小时;以U6为内参,定量巨噬细胞内miR-146a-5p的表达;以18S为内参,定量巨噬细胞内MCP-1、TNF-α、IL-6的表达;通过western blot检测巨噬细胞内CD86的表达情况;通过生物信息学预测靶基因并进行相关机制研究。研究结果：***患者及小鼠血浆外泌体中miR-146a-5p表达下调;***组血浆外泌体中miR-146a-5p与血浆中IL-6的含量呈负相关;nash组小鼠肝原代细胞和肝巨噬细胞内miR-146a-5p的表达均明显降低;3.在巨噬细胞内过表达miR-146a-5p在蛋白水平和m RNA水平降低M1型巨噬细胞标记蛋白CD86的表达;并且可以在一定程度上逆转LPS导致的M1型巨噬细胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放。4.高表达miR-146a-5p的外泌体与巨噬细胞共孵育48h后,巨噬细胞内miR-146a-5p的表达明显升高;高表达miR-146a-5p的外泌体可以降低CD86的表达并减少M1型巨噬细胞促炎因子MCP-1、TNF-α、IL-6的释放;高表达miR-146a-5p的外泌体可以通过靶向作用于CD80来抑制巨噬细胞M1极化。研究结论：nash患者和小鼠血浆外泌体中miR-146a-5p表达明显下调;nash组小鼠原代肝细胞和肝巨噬细胞内miR-146a-5p的表达均明显降低。细胞实验研究表明,在巨噬细胞内过表达miR-146a-5p可以抑制M1极化;制备高表达miR-146a-5p的外泌体与巨噬细胞体外共孵育后可以通过靶向作用于CD80来抑制巨噬细胞M1极化,并减少促炎因子MCP-1、TNF-α、IL-6的释放。

关键词： nash 外泌体miR-146a-5p CD80 巨噬细胞

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参葛方抑制肝脏氧化应激反应治疗nash的相关机制研究

参葛方抑制肝脏氧化应激反应治疗NASH的相关机制研究

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作者：徐张迎上海中医药大学

学位级别：硕士

目的:研究参葛方通过抑制单纯高脂饮食诱导的nash模型小鼠肝脏氧化应激、炎症反应及调节脂质代谢治疗nash的相关机制。方法:1.分组:将76只雄性C57BL/6J小鼠,适应性喂养一周后,按体重进行区组划分为正常组、模型组、参葛方低剂量组、参... 详细信息

目的:研究参葛方通过抑制单纯高脂饮食诱导的nash模型小鼠肝脏氧化应激、炎症反应及调节脂质代谢治疗nash的相关机制。方法:1.分组:将76只雄性C57BL/6J小鼠,适应性喂养一周后,按体重进行区组划分为正常组、模型组、参葛方低剂量组、参葛方中剂量组、参葛方高剂量组、易善复组、非诺贝特组,其中正常组与模型组每组13只、其余各用药组10只。2.造模及鉴定:正常组予普通饮食,其余组均予高脂饮食,12周时,正常组与模型组各取3只小鼠,通过大体观察、血脂、肝脏脂质含量及血清转氨酶的检测及组织学染色,进行模型鉴定,后续饮食同前。3.给药方法:12周后,正常组予蒸馏水灌胃,参葛方低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠,分别按照7.875g/kg/d、15.75g/kg/d（即人的等效剂量）、31.5g/kg/d用药量给予参葛方灌胃,易善复和非诺贝特按人的等效剂量灌胃（分别为0.2052g/kg/d、0.03g/kg/d）,按0.1ml/10g调整小鼠灌胃量,每天一次,药物治疗4周后处死取材。4.各项指标检测方法:（1）参葛方对nash模型小鼠体重、肝脏指数、肝脏脂质沉积及代谢的调节作用:称量各组小鼠体重、肝重、脾重,并计算脏器指数,肝组织油红O染色法观察脂质沉积情况,生化法检测血清中TG、TC、LDL-c、HDL-c、Glu、UA、Cr的水平及肝组织匀浆上清的TG和TC含量,Real-Time PCR法检测脂肪酸氧化基因CPT1、PPAR-α的表达水平;（2）参葛方对nash模型小鼠的抗炎保肝作用:生化法检测血清ALT、AST含量,ELISA法检测血清TNF-α的水平,Real-Time PCR法检测肝组织TNF-α、CD68及F4/80m RNA的表达水平,肝组织HE染色法观察炎症浸润情况;（3）参葛方对nash模型小鼠肝脏氧化应激反应的抑制作用:生化法检测肝组织匀浆上清中MDA的含量,ELISA法检测血清中脂联素的水平,Real-Time PCR法检测Adipo R1、Adipo R2、SIRT1、PGC1α及NRF2m RNA的表达水平,Western Blot法检测小鼠肝组织Adiopo R1、p-AMPK/AMPK、SIRT1、SIRT3、PGC1α等脂联素信通路中相关蛋白的表达水平。结果:***小鼠模型鉴定与正常组相比,模型组体重和肝重显著增加（P＜0.01）;血清ALT、AST及肝组织TG水平显著上升（P＜0.05）;小鼠肝组织HE染色显示肝小叶结构紊乱、呈现混合型脂肪变（小泡型为主兼有大泡型）、小叶内少量炎症细胞浸润、肝细胞肿胀疏松,NAS评分为4.67±1.53分;油红染色则显示大量橘红色成片的脂滴2.参葛方治疗nash小鼠模型的疗效及机制（1）参葛方能减轻nash模型小鼠体重及肝重,减少肝脏脂质沉积及调节代谢:与正常组相比,模型组小鼠肝脏体积增大、边缘较钝、颜色偏淡黄、质地如泥沙样且油腻、内脏可见大量脂肪沉积;体重、肝脏指数显著增加（P＜0.05）;油红染色则见大量成片的脂滴;血清TG、TC、LDL-c、FBG、Cr、肝组织TG、TC均有不同程度的增加（P＜0.05）;肝组织PPAR-α和CPT1 m RNA的表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组相比,各用药组肝脏组织色泽偏红、油腻感不明显;各用药组均能显著降低nash模型小鼠的体重（P＜0.0001）;除参葛方低剂量组和非诺贝特组外,其余各组肝脏指数均明显下降（P＜0.01）;肝组织油红O染色显示各用药组脂滴数量减少;除易善复组外,各组均能显著降低血清TG及肝脏TG水平（P＜0.05）;除参葛方低、中剂量组外,其余各组均能显著降低血清TC水平（P＜0.001）;除参葛方低剂量组外,其余各组均能显著降低血清LDL-c水平（P＜0.05）;除参葛方低剂量组外,其余各组均能显著上调脂肪酸氧化基因PPAR-α和CPT1 m RNA的表达水平（P＜0.01）。（2）参葛方能减轻nash模型小鼠的炎症损伤:与正常组相比,模型组小鼠肝脏HE染色显示满视野的肝细胞脂肪变、小叶内炎症细胞浸润,肝细胞肿胀疏松;NAS评分为5.3±1.15分;血清ALT、AST、TNF-α水平及肝组织TNF-α、CD68、F4/80 m RNA的表达水平均显著升高（P＜0.01）。与模型组相比,各用药组均能降低肝细胞脂肪变的程度及小叶内炎症细胞浸润的情况,降低NAS评分;除参葛方低剂量组外,其余各用药组均能显著降低ALT水平（P＜0.0001）;除易善复组外,各组均能显著减低血清AST水平（P＜0.05）各用药组均能显著降低血清TNF-α水平及肝组织中巨噬细胞表面标志物CD68、F4/80m RNA的表达水平（P＜0.01）;除参葛方低剂量组外,各用药组小鼠肝组织TNF-αm RNA的水平显著下

关键词： nash 参葛方氧化应激脂联素

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α7nAChR基因敲除对nash炎症反应的作用及其机制

α7nAChR基因敲除对NASH炎症反应的作用及其机制

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作者：李富强浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的:在前期研究的基础上购买基因敲除杂合子小鼠,繁殖并且鉴定其子代小鼠的基因型;通过建立 α 7 烟碱型乙酰胆碱能受体（alpha7 nicotinic acetylcholine recepto,α 7nAChR）基因敲除nash小鼠模型;探讨该基因敲除对非酒精性脂肪性肝... 详细信息

目的:在前期研究的基础上购买基因敲除杂合子小鼠,繁殖并且鉴定其子代小鼠的基因型;通过建立 α 7 烟碱型乙酰胆碱能受体（alpha7 nicotinic acetylcholine recepto,α 7nAChR）基因敲除nash小鼠模型;探讨该基因敲除对非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic Steatohepatitis,nash）小鼠肝脏炎症的作用及其相关分子机制。方法:1.将引进的α7nAChR基因敲除杂合子小鼠进行饲养并繁殖,提取子代小鼠尾部DNA,用PCR方法检测子代小鼠基因型,应用Western blot检测α7nAChR蛋白质的表达,进一步证实PCR鉴定方法的可靠性;2.40只雄性6周龄的SPF级C57BL/6J小鼠和40只雄性6周龄α7nAChR基因敲除小鼠分为C57普通饮食小鼠组、C57高脂高糖饮食小鼠组、基因敲除普通饮食小鼠组、基因敲除高脂高糖饮食小鼠组,分别给予普通及高脂高果糖饮食,喂养24周建立nash小鼠模型;小鼠饲养期间定期称量各组小鼠的体重变化,并且尾静脉取血检测谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate Transaminase,AST）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、血清总胆固醇（Serum Total Cholesterol,TC）的浓度;21周时给予上述4组小鼠生理盐水或烟碱行腹腔注射,每天1次,注射量为400μg/kg,注射3周。24周后处死小鼠观察肝脏重量和颜色变化,眼球取血ELISA检测血清炎症因子白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）的浓度,肝脏病理切片染色观察炎症程度和脂肪变性情况。3.小鼠造模成功后处死小鼠原代分离培养肝脏巨噬细胞,给予烟碱以及内毒素（Lipopolysaccharides,LPS）处理后,ELISA检测细胞上清中炎症因子IL-6、TNF-α的水平;细胞间接免疫荧光和Western blot观察其对信号通路核因子-kB（Nuclear Factor κB,NF-κB）的影响;定量PCR检测巨噬细胞中Toll样受体-4（Toll-like Receptors-4,TLR-4）mRNA表达量。结果:1.成功获得获得子代（α7nAChR-/-）,子代小鼠纯合率为30%。2.成功建立了 nash小鼠模型;基因敲除高脂高糖饮食小鼠体重、肝脏湿重、ALT、AST、TG、TC、IL-6、TNF-α均较C57普通高脂高糖小鼠增高,小鼠肝组织病理结果显示α7nAChR基因敲除高脂高糖饮食小鼠肝脏炎症和脂肪变性较C57普通高脂高糖小鼠加重。***结果表明,基因敲除高脂饮食小鼠组细胞上清中的IL-6、TNF-α浓度明显高于C57BL/6J高脂饮食组,Western blot结果表明基因敲除高脂饮食小鼠组的的p-NF-κB、TLR-4的蛋白表达量明显高于C57BL/6J高脂饮食组,细胞间接免疫荧光结果显示基因敲除高脂饮食小鼠组的的NF-κB荧光强度明显高于C57BL/6J高脂饮食组;PCR结果表明,基因敲除高脂饮食小鼠组TLR-4 mRNA表达量明显高于C57BL/6J高脂饮食组。结论:1.α7nAChR基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,为进一步研究α7nAChR缺失对nash的影响提供了理想的动物模型。2.成功建立小鼠nash模型,通过对不同小组的小鼠病理、生化、体重的对比,α7nAChR基因敲除能够明显加重nash小鼠的肝脏炎症,其作用机制为通过NF-κB信号通路抑制炎症反应。

关键词： Kupffer细胞 α7烟碱型乙酰胆碱能受体 nash 烟碱基因敲除

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