检索结果-南通市图书馆

作者：张红兵中南大学

学位级别：硕士

目的：探讨长沙地区绝经后女性血清myostatin与肌力、体成分及骨密度（BMD）的相关性。方法：横断面研究175例51～75岁绝经后女性,以ELISA法测量血清myostatin、骨代谢生化指标BAP及CTX,采用双能X线骨密度仪（DEXA）测量全身、腰椎... 详细信息

目的：探讨长沙地区绝经后女性血清myostatin与肌力、体成分及骨密度（BMD）的相关性。方法：横断面研究175例51～75岁绝经后女性,以ELISA法测量血清myostatin、骨代谢生化指标BAP及CTX,采用双能X线骨密度仪（DEXA）测量全身、腰椎正位、左股骨颈、全髋部BMD以及体脂含量、瘦重;测定受试者的右手握力及站起试验时间作为肌肉力量指标。将研究人群分为骨质疏松组和非骨质疏松组。结果：骨质疏松组与非骨质疏松组相比,二者血清myostatin水平及肌力未见差异;myostatin与年龄、绝经时间、绝经年限、肌力、体成分、各骨骼部位BMD、BAP、CTX不相关;体脂含量及瘦重与各部位BMD呈正相关（P＜0.05）;CTX与腰椎、股骨颈、全髋部、全身BMD呈负相关（P＜0.05）;BAP与腰椎及全身BMD呈负相关（P＜0.05）;控制年龄,绝经年龄和身高后,在腰椎,体脂含量对BMD变异的贡献量最大;而在股骨颈及髋部,瘦重对BMD变异的贡献量最大。结论：（1）绝经后女性血清myostatin水平与肌力、体成分、BMD不相关,血清myostatin水平不是BMD、体成分、骨转换生化指标的影响因素;（2）绝经后女性体脂含量是腰椎BMD的重要影响因素,而瘦重是股骨颈及全髋部BMD的重要影响因素。

关键词：绝经后女性 myostatin 体成分骨密度

乌珠穆沁羊myostatin基因序列分析及多态性研究

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乌珠穆沁羊Myostatin基因序列分析及多态性研究

作者：齐志欣内蒙古农业大学

学位级别：硕士

本研究采用自然放牧条件下(多胸椎个体)乌珠穆沁羊,从扩增乌珠穆沁羊myostatin (MSTN)基因全序列入手,对该品种MSTN基因的序列结构、核苷酸组成进行了分析,并对其编码蛋白质进行了预测分析,构建该基因分子进化树;同时分析了乌珠穆沁羊M... 详细信息

本研究采用自然放牧条件下(多胸椎个体)乌珠穆沁羊,从扩增乌珠穆沁羊myostatin (MSTN)基因全序列入手,对该品种MSTN基因的序列结构、核苷酸组成进行了分析,并对其编码蛋白质进行了预测分析,构建该基因分子进化树;同时分析了乌珠穆沁羊MSTN基因部分序列的多态性。结果显示：MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成,其外显子大小分别为373bp、374bp、381bp,内含子大小分别为1833bp、2030bp。CDS序列全长为1128bp,由375个氨基酸组成。利用生物信息学软件分析发现：乌珠穆沁羊MSTN基因编码蛋白的理论分子量约为42.8kDa, PI值为7.01,Leu的含量最高(9.9%),其次是Lys(8.3%)。乌珠穆沁羊基因编码蛋白二级结构以随机卷曲结构为主,其蛋白属于跨膜蛋白,AA6-AA23之间为跨膜区,具有一个分泌信号肽结构。其氨基酸序列MQKLQICVYIYLFMLIVA具有TGF-β家族的特征。P6引物扩增的366bp的区域,在位于CDS序列第126bp处发生C→T的沉默突变,表现EE和EF两种基因型。引物P7扩增的353bp的区域,在所检测的范围内没有发现多态性。P8引物扩增的349bp的区域,在位于CDS序列第909bp处有一个A→G的沉默突变,表现AA和AB两种基因型。本研究为改善地方优良品种以及利用该基因开展乌珠穆沁羊分子育种技术研究等提供理论基础,并为建立乌珠穆沁羊基因文库提供可靠信息。

关键词：乌珠穆沁羊 myostatin 蛋白质结构序列分析 PCR-SSCP

肌肉生长抑制素（myostatin）及其相关基因在绵羊肱二头肌发育中的表达分析

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肌肉生长抑制素（Myostatin）及其相关基因在绵羊肱二头肌发育中...

作者：刘晨曦新疆农业大学

学位级别：硕士

肌肉抑制素基因-myostatin （MSTN） ,又称GDF-8,属TGF-β（transforming growth factor beta）超家族成员,是肌肉生长发育的负调节因子。对该基因表达的抑制可引起成肌细胞的过度增殖和肌纤维的肥大,从而引起骨骼肌增生。本实验以小尾... 详细信息

肌肉抑制素基因-myostatin （MSTN） ,又称GDF-8,属TGF-β（transforming growth factor beta）超家族成员,是肌肉生长发育的负调节因子。对该基因表达的抑制可引起成肌细胞的过度增殖和肌纤维的肥大,从而引起骨骼肌增生。本实验以小尾寒羊×杜伯羊羔羊为实验动物,采集从出生到7周不同发育时期肱二头肌,利用Realtime PCR技术对肌肉抑制素（myostatin, MSTN）及其相关基因胰岛素样生长因子I （insulin-like growth factorsI, IGF1）、胰岛素样生长因子II （insulin-like growth factors II, IGF2）、肌球蛋白重链II a（myosin heavy chain 2a, MHC2a）在出生后不同时期羔羊肱二头肌中的表达规律进行了定量分析。结果显示, IGF1、IGF2和MSTN基因出生后的表达趋势各不相同。其中,IGF-1表达水平最低,MHC2a表达水平最高;IGF2与MSTN表达水平相当;MSTN的表达于7天时表达水平最高,是出生时表达的3倍,随后于14天时急剧下降,于7周时降至最低水平;出生时IGF1的表达水平最高,随后于一周时降至出生时的一半,后期的表达变化不大;IGF2的表达水平于3周时表达最高,是出生时的两倍,在1周时最低。3周后骤然降低,呈现一个波浪型变化;MHC的表达出生时最高,于1周后降至原来的1/7,随后逐渐升高,但变化并不太大。 myostatin基因的表达与IGF1、IGF2、MHC2a基因表达之间无显著相关性,提示myostatin基因的表达与IGF1、IGF2、MHC2a之间并不存在紧密的调控机制;IGF1与MHC基因表达之间存在显著正相关,表明IGF1与MHC之间存在紧密的相互作用,这种调控机制有待进一步探讨

关键词： myostatin 肱二头肌 Realtime PCR 小尾寒羊×杜伯羊

子痫前期患者血清、胎盘follistatin-like 3和myostatin水平的变化及意义

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子痫前期患者血清、胎盘follistatin-like 3和myostatin水平的变...

作者：郭婧浙江大学

学位级别：硕士

背景：子痫前期是发生于妊娠20周以后的妊娠期特有疾病,妊娠妇女中发病率约为7%-12%。临床表现为高血压、蛋白尿、水肿,严重者可出现抽搐、昏迷、心力衰竭、胎盘早剥、弥漫性血管内凝血和HELLP综合征（hemolysis, elevated serum l... 详细信息

背景：子痫前期是发生于妊娠20周以后的妊娠期特有疾病,妊娠妇女中发病率约为7%-12%。临床表现为高血压、蛋白尿、水肿,严重者可出现抽搐、昏迷、心力衰竭、胎盘早剥、弥漫性血管内凝血和HELLP综合征（hemolysis, elevated serum level of liver enzymes, and low platelets）,甚至死亡,严重危害母婴健康,是孕产妇和围生儿病率及死亡率的主要原因。子痫前期的发病机制尚未阐明。目前,已经证实许多转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）超家族的成员及其相关结合蛋白与子痫前期的发生、发展有关,activin信号通路——activin A以及相关蛋白,包括inhibin A、follistatin、follistatin-like 3等就是其中的热点。Activin A和inhibin A均是隶属于TGF-β超家族的糖蛋白,而follistatin则是TGF-β超家族成员的结合蛋白,能以高亲和力结合activin并拮抗其生理功能。TGF-β超家族成员及其相关蛋白在细胞的生长与分化、胚胎发育的调控以及维持成年动物内环境的稳定等方面均发挥着重要作用。大量研究证实在子痫前期孕妇外周血中activin A和inhibin A的浓度较正常妊娠对照组妇女显著增高,而follistatin的浓度则轻度升高或无显著变化。 Follistatin-like 3（FSTL3）又称为FLRG （Follistatin related-gene）,是TGF-β超家族成员的一个结合蛋白,能够与TGF-β超家族的myostatin、activin、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMPs）、GDF-11等多个成员特异性的结合,抑制Smad介导的细胞内信号转导,进而抑制TGF-β超家族成员的生物学功能。Follistatin-like 3在胎盘、成熟的睾丸、心脏和胰腺组织中显著高表达。 myostatin（MSTN）也被称为肌肉生长抑制素,是TGF-p超家族的一个新成员,由于与其他TGF-β超家族成员的同源性很低,又被称为生长分化因子-8（Growth and differential factor-8,GDF-8）。myostatin的主要生物学功能是对骨骼肌细胞生长的负调控作用,同时也参与蛋白质、脂肪和糖代谢的调节。myostatin主要在哺乳动物的骨骼肌中表达,在脂肪组织、胎盘组织和滋养细胞中也有一定的分布。目前发现,myostatin前肽、follistatin （FST）、follistatin-like 3、activin receptorⅡB （ACTRⅡB）拮抗剂和myostatin抗体均可抑制myostatin的功能。有学者通过ELISA、实时荧光定量PCR、Western Blotting和免疫组化证实,与正常妊娠孕妇相比,子痫前期孕妇胎盘中follistatin-like 3的mRNA、蛋白的水平以及外周血中的follistatin-like 3的浓度均显著增加。但是目前关于子痫前期孕妇血清及胎盘myostatin水平的变化还是未知,子痫前期患者妊娠中期血follistatin-like 3和myostatin的变化也未见报道。目的：测定子痫前期患者和正常妊娠孕妇外周血、胎盘组织follistatin-like 3和myostatin的水平,以及发生子痫前期的患者及正常对照组孕妇妊娠中期血清follistatin-like 3和myostatin的水平,并观察妊娠中期血清follistatin-like 3和myostatin水平的变化与子痫前期的关系,探讨follistatin-like 3和myostatin子痫前期发生、发展中的作用。方法：研究分为三个部分。（一）采用ELISA测定子痫前期患者（40例）和正常妊娠妇女（40例）血清中follistatin-like 3和myostatin的浓度;（二）采用real-time PCR和Western Blotting分别测定子痫前期患者（40例）和正常妊娠妇女（40例）胎盘follistatin-like 3和myostatin的mRNA和蛋白表达;（三）采用ELISA测定发生子痫前期的病人（40例）和正常妊娠妇女（40例）妊娠中期的血清follistatin-like 3和myostatin的浓度。结果：子痫前期患者血清follistatin-like 3和myostatin水平显著高于正常妊娠对照组,差异有显著性（P均＜0.001）。子痫前期患者胎盘follistatin-like 3和myostatin的mRNA和蛋白水平均显著高于对照

关键词：子痫前期血清胎盘 follistatin-like 3 myostatin

半滑舌鳎myostatin及其通路相关基因对肌肉生长发育调控的研究

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半滑舌鳎myostatin及其通路相关基因对肌肉生长发育调控的研究

作者：张梦倩上海海洋大学

学位级别：硕士

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）在我国海水养殖产业中占有重要地位,因其性别二态性而备受关注,性成熟雌鱼体长和体重显著高于雄鱼,作为体重占比40-60%的骨骼肌,是造成雌雄鱼差异的主要因素。肌肉生长抑制素（myostatin,mstn）负向... 详细信息

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）在我国海水养殖产业中占有重要地位,因其性别二态性而备受关注,性成熟雌鱼体长和体重显著高于雄鱼,作为体重占比40-60%的骨骼肌,是造成雌雄鱼差异的主要因素。肌肉生长抑制素（myostatin,mstn）负向调控肌肉的生长发育,对肌肉生长发育有抑制作用。mstn/smad信号通路在调控肌肉生长发育中占有重要地位。本研究采用RT-qPCR方法、组织切片染色以及原位杂交方法,旨在探究肌肉生长发育过程中,肌肉生长发育的负调控因子mstn及其通路相关基因在半滑舌鳎雌、雄鱼中的时空表达模式,为深入研究半滑舌鳎雌雄生长差异提供基础。主要结果如下:1龄半滑舌鳎9个组织中mstn的qPCR结果显示:雄鱼、雌鱼mstn基因在肌肉组织中的表达量最高,其他组织中则较低。mstn在雄鱼肌肉组织的表达量最高,其次是精巢和脑;在雌鱼肌肉、脑中的表达量显著高于其它组织。性别差异表达分析结果显示,mstn表达量在脾、肠、肾、性腺、脑、肌肉组织均存在显著差异（P＜0.05）,而在肝脏、鳃、心脏3个组织的表达量不存在显著差异。在肌肉发育的不同时期,1龄时期雄鱼中的表达量显著高于雌鱼（P＜0.05）,而在40d、60d、120d、180d和2y雌雄鱼之间的表达量不存在显著差异。肌肉组织切片制备观察结果显示肌纤维的横截面呈现出不规则的多角状。原位杂交结果显示mstn的表达位置是肌细胞的边缘,位于肌纤维之间,即成肌细胞增殖、分化的位置。通过PCR方法克隆得到smad家族smad2、smad3a、smad3b和smad7基因的编码区序列。smad2、smad3a、smad3b和smad7编码的氨基酸序列均含SMAD蛋白家族MH1和MH2典型结构域。RT-qPCR结果显示smad2在雄鱼性腺中的表达量最高,心脏和鳃组织次之;在雌鱼卵巢中表达量最丰富,其次是鳃和脑组织。smad2在雌鱼中性腺的表达量显著高于雄鱼且存在显著差异（P＜0.05）。smad3a基因在雄鱼肌肉组织表达量最高,其次是脑和心脏;在雌鱼中表达量最高的是肌肉组织,其次是脑。smad3a基因在肝脏、肾、性腺、心脏、脑和肌肉组织中雄鱼表达量高于雌鱼且存在差异（P＜0.05）,其它组织中不存在显著差异表达。RT-qPCR结果表明smad3b基因在半滑舌鳎肌肉组织中表现出最高的表达量,雄鱼表达量高于雌鱼且差异显著（P＜0.05）。smad7基因在半滑舌鳎鳃组织中的表达量最高,且smad7基因在鳃、肝脏、脾脏、肠、肾、心脏、脑和肌肉组织中雄鱼表达量高于雌鱼且存在显著差异表达（P＜0.05）。

关键词：半滑舌鳎 myostatin smad 肌肉生长发育 RT-qPCR 原位杂交

猪myostatin基因RNA干扰及启动子研究

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猪Myostatin基因RNA干扰及启动子研究

作者：姜丹丹东北农业大学

学位级别：硕士

肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）,是TGF-β（transforming growing factor-β）超家族成员,是肌肉细胞的自分泌因子,主要在动物骨骼肌中特异性表达并对肌肉的生长发育起到负调控作用。该基因敲除的小鼠,其骨骼肌重量增加到正常小鼠的... 详细信息

肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）,是TGF-β（transforming growing factor-β）超家族成员,是肌肉细胞的自分泌因子,主要在动物骨骼肌中特异性表达并对肌肉的生长发育起到负调控作用。该基因敲除的小鼠,其骨骼肌重量增加到正常小鼠的两倍左右。RNA干扰（RNAi）是一种特异性降解靶基因mRNA序列的基因表达调节机制,具有高效、特异、快速等优点,已成为研究基因功能和表达调控的有效方法。因此,本实验利用PCR方法以猪骨骼肌cDNA为模板克隆myostatin基因并构建真核表达载体pMSTN-1;针对猪肌生成抑制素基因mRNA3个干涉位点,设计合成三对特异的shRNA干扰序列和一对非特异的shRNA干扰序列,通过退火形成双链后依次将其连入带有U6启动子的干涉载体pGenesil-1上,构建干扰载体。得到含四个目的DNA片段的重组质粒分别脂质体转染过表达myostatin细胞,利用real time-PCR检测各实验组细胞中myostatin在mRNA水平的表达,检测干扰效果。结果表明3个干扰片段均在一定程度上下调了MSTN mRNA的表达。shRNA1、shRNA 2和shRNA 3对MSTN基因的抑制率分别为69.82%、80.97%和87.52%,同时转染shRNA0也能抑制MSTN基因的表达但是差异不显著,3对干扰序列间干扰水平无明显差异。同时本研究中,对myostatin基因启动子功能进行了研究。利用PCR方法从猪基因组DNA中分离了1.2 kb的myostatin基因启动子（Pro）序列。该启动子序列与已报道的GenBank序列:AJ133580和AY527153相应序列的相似度分别为100%和99.5%,进一步以GFP为报告基因,构建真核表达载体MSTNPro-EGFP;通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系和猪成纤维细胞,对猪myostatin基因启动子的转录调控活性进行鉴定。结果表明,本实验成功克隆了猪myostatin基因启动子,并且构建了真核表达载体,猪myostatin基因启动子可以启动GFP在C2C12细胞中的转录和表达,而将猪MSTNProEGFP载体转染猪胎儿成纤维细胞后并未观察到GFP的表达,说明myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性。

关键词： myostatin RNA干扰 myostatin启动子猪胎儿成纤维细胞 C2C12

绵羊成纤维细胞肌肉生长抑制素（myostatin）基因敲除的初步研究

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绵羊成纤维细胞肌肉生长抑制素（Myostatin）基因敲除的初步研究

作者：孙丹辽宁师范大学

学位级别：硕士

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)又名GDF-8(转化生长因子),首次于1997年美国约翰霍普金斯大学医学院Mcpherron科研小组在研究TGF-β(转化生长因子超家族)时采用简并PCR法在该家族的保守区域扩增得以发现。该基因作为骨骼肌特异性生长发... 详细信息

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)又名GDF-8(转化生长因子),首次于1997年美国约翰霍普金斯大学医学院Mcpherron科研小组在研究TGF-β(转化生长因子超家族)时采用简并PCR法在该家族的保守区域扩增得以发现。该基因作为骨骼肌特异性生长发育的负调控因子,遗传突变功能失活后能够产生肌肉急剧增加的“双肌表型”。本研究利用基因敲除技术体外构建针对绵羊myostatin基因第三外显子缺失的基因敲除载体,转染入绵羊成纤维细胞,利用骨架载体上Neo基因替代myostatin基因的exon3,以期达到使细胞内myostatin基因失活的目的。对绵羊体细胞myostatin基因敲除的可行性进行初步探索研究;为创制肉羊育种新材料、培育转基因绵羊奠定基础。本论文主要的研究结果如下: (1)根据绵羊myostatin基因全序列(GenBank No.DQ530260)利用LA-PCR技术,成功扩增得到绵羊myostatin基因同源长臂4.9k,包括全部的exon1,intron1,exon2,及部分启动子和大部分intron2;同源短臂1.1K,包括部分exon3和3’非翻译区序列,将二者连入PloxpII正负筛选基因敲除骨架载体,成功构建专门针对myostatin第三外显子区域缺失的置换型敲除载体PloxpII-OVIS-MSTN(13.5K),酶切和测序鉴定证明载体构建正确。 (2)通过组织块贴壁的方法建立绵羊耳缘组织成纤维细胞系,增殖活力良好,为后续细胞转染实验奠定基础。 (3)建立了绵羊myostatin基因敲除载体转染及筛选方法:脂质体2.5ul,敲除载体2ug,转染效率较高;经过300ug/mlG418初步筛选7-10天,而后经200ug/mlG418加50nmol/lGANC维持筛选20天左右可得到明显的细胞克隆。 (4)经过30天左右的正负筛选共得到64个细胞克隆,经PCR鉴定后初步认为12号细胞克隆为发生了同源重组的阳性细胞克隆。本研究根据myostatin基因突变可导致肌肉量激增而产生“双肌”表型的特点,利用基因敲除技术使绵羊细胞内myostatin基因缺失,从而为应用基因敲除及体细胞克隆技术相结合制作产肉率高的转基因肉羊建立技术研究平台,为肉羊育种及品种改良提供新思路。

关键词：绵羊 myostatin 基因敲除置换型敲除载体成纤维细胞

大鼠myostatin蛋白的抗体制备及其应用

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大鼠Myostatin蛋白的抗体制备及其应用

作者：黄丽南通大学

学位级别：硕士

目的利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合系统在大肠杆菌中表达纯化大鼠myostatin蛋白,采用GST-myostatin融合蛋白进行多克隆抗体的制备、鉴定并进一步阐明胫神经损伤后腓肠肌肌萎缩过程中myostatin蛋白表达变化。方法用IPTG诱导含已构建的pG... 详细信息

目的利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合系统在大肠杆菌中表达纯化大鼠myostatin蛋白,采用GST-myostatin融合蛋白进行多克隆抗体的制备、鉴定并进一步阐明胫神经损伤后腓肠肌肌萎缩过程中myostatin蛋白表达变化。方法用IPTG诱导含已构建的pGEX-4T-myostatin质粒的大肠杆菌BL21表达GST-myostatin蛋白,采用Western-blot用抗- GST抗体验证融合蛋白表达,用电洗脱法纯化蛋白。将纯化好的GST-myostatin融合蛋白免疫家兔,获得抗血清,经Western-blot、免疫组织化学及ELISA检测抗体特异性及效价;建立大鼠胫神经夹伤模型,采用RT-PCR、Western-blot及免疫组织化学法检测胫神经夹伤后不同时间段腓肠肌中myostatin基因及蛋白表达变化。结果得到较高纯度的GST-myostatin融合蛋白,获得兔源的抗myostatin血清,经Western-blot、免疫组织化学及ELISA实验显示所得抗体具有较高的特异性及效价;发现在胫神经夹伤后,腓肠肌myostatin基因及蛋白水平迅速上升,在第14天达到高峰,随后逐渐下降,至第28天降至接近正常水平。结论成功获得GST-myostatin融合蛋白,成功制备了兔抗大鼠myostatin抗血清,进一步检测表明了胫神经损伤后腓肠肌中myostatin蛋白的表达具有时间依赖性。本研究为探讨myostatin在骨骼肌萎缩过程中的作用提供了实验基础。

关键词： myostatin 抗体胫神经夹伤 Western blot immunohistochemistry

MicroRNA-128靶向myostatin编码区调控成肌细胞的增殖与分化

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MicroRNA-128靶向Myostatin编码区调控成肌细胞的增殖与分化

作者：石磊南京农业大学

学位级别：硕士

MicroRNAs(miRNAs)对骨骼肌发育过程中起着关键的作用。之前的研究发现miR-128在骨骼肌中高表达,但其对骨骼肌发育的调节机制尚不明确。本研究通过生物信息学预测分析,发现miRNA-128可能结合到肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)mRNA的编码... 详细信息

MicroRNAs(miRNAs)对骨骼肌发育过程中起着关键的作用。之前的研究发现miR-128在骨骼肌中高表达,但其对骨骼肌发育的调节机制尚不明确。本研究通过生物信息学预测分析,发现miRNA-128可能结合到肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)mRNA的编码区(Coding DomainSequence,CDS)区,进而调控骨骼肌细胞的增殖与分化。我们利用C2C12成肌细胞为模型,分别将miRNA-128前体、抑制剂、mimics与阴性对照(NC)转染到C2C12细胞中,并运用5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)细胞增殖检测、流式细胞术、定量PCR、免疫荧光和蛋白印迹等分子生物学技术,探讨了 miRNA-128差异表达对MSTN的表达和对成肌细胞增殖与分化的影响;同时检测小鼠体内miRNA-128与MSTN在体内的表达模式,得到以下结果:1.miRNA Stem-loop RT-PCR定量检测结果显示,miRNA-128的表达量随着小鼠日龄的增加以及C2C12成肌细胞的分化而显著升高。提示miRNA-128可能参与调控骨骼肌细胞的发育过程。2.在C2C12细胞中过表达miRNA-128降低了 MSTN蛋白的表达水平;转染miRNA-128的抑制剂升高了 MSTN的蛋白水平,但是miRNA-128差异表达对MSTN的mRNA水平没有影响。这些结果表明miRNA-128差异表达影响了 MSTN蛋白的表达。3.构建包含miRNA-128与MSTN结合的种子序列及其突变的质粒,将重组质粒与miRNA-128的mimics共同转染到C2C12细胞与HEK293细胞中;用双荧光报告检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性,结果发现:与转染带有突变序列质粒的细胞相比,miRNA-128 降低了 MSTN重组质粒的荧光素酶活性,提示MSTN是miRNA-128的靶基因。4.荧光定量PCR检测发现:当miRNA-128在C2C12成肌细胞中过表达后,细胞中成肌标记基因Myf5、MyoG、Pax3/7的表达量显著降低;当C2C12成肌细胞中miRNA-128表达受到抑制时,细胞中成肌标记基因MyoG、Myf5、Pax3/7的表达量显著升高。结果暗示miRNA-128差异表达会影响C2C12成肌细胞的增殖与分化。5.通过EdU细胞增殖试验检测发现:当miRNA-128在C2C12成肌细胞中表达时,显著降低了 C2C12成肌细胞的增殖;流式细胞仪分析发现:G1期细胞数目显著增多,说明miRNA-128过表达能够将成肌的细胞周期阻滞在G1期,从而抑制成肌细胞增殖。另一方面,当miRNA-128的表达受到抑制时,则促进了 C2C12成肌细胞增殖。6.当miRNA-128在C2C12成肌细胞中过表达时诱导其分化,通过免疫荧光检测发现:C2C12成肌细胞中成肌标记基因肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达量显著升高;荧光定量PCR检测发现:肌细胞生成素(myogenin,MyoG)与MyHC基因的mRNA水平增加了;Western blot结果显示:MyHC蛋白的表达量显著升高。结果表明:miRNA-128过表达能够促进C2C12成肌细胞分化,而当miRNA-128的表达受到抑制时,成肌标记基因MyHC、MyoG的表达降低了,说明成肌细胞分化受到抑制。综上所述,在骨骼肌细胞的发育过程中,miRNA-128通过对其靶基因MSTN表达的调控来影响骨骼肌细胞的增殖与分化。

关键词： miRNA-128 C2C12成肌细胞 myostatin 增殖与分化

半滑舌鳎myostatin基因通路相关基因的克隆和表达

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半滑舌鳎Myostatin基因通路相关基因的克隆和表达

作者：衣启麟中国海洋大学

学位级别：硕士

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是一种重要的经济鱼类,具有生长快等优点。myostatin（MSTN）,为肌肉抑素,又名生长转化因子8（GDF-8）,属于转化生长因子β（TGF-β）家族成员。在哺乳类和其他物种中在主要在发育的和成年个体的骨... 详细信息

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是一种重要的经济鱼类,具有生长快等优点。myostatin（MSTN）,为肌肉抑素,又名生长转化因子8（GDF-8）,属于转化生长因子β（TGF-β）家族成员。在哺乳类和其他物种中在主要在发育的和成年个体的骨骼肌中表达,起着抑制肌肉生长的作用。Follistatin（FST）为卵泡抑素,是一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽,它是对于包括MSTN在内TGF-β家族成员的一种重要的调节蛋白,对myostatin起到抑制作用;Activin II型B受体（ActRIIB）是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体家庭的一员, MSTN最先与ActRIIB结合形成复合体激活下游Smad传导蛋白,启动信号通路。本研究通过同源克隆和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术获得FST和ActRIIB的全长cDNA,利用生物软件对基因进行了生物信息学的预测分析,并借助于实时荧光定量技术对两种基因不同组织和发育时期的时空表达进行了研究。 1、半滑舌鳎的Follistatin基因的克隆及表达分析根据GenBank中已提交的鱼类Follistatin序列保守区域设计简并引物得到核心片段,通过RACE技术获得3’及5’末端,经拼接后得到半滑舌鳎FST cDNA全长1373bp,ORF为966bp,还包括16 bp的5’UTR,417bp的3’UTR。该基因编码了一个含有321个氨基酸的蛋白质前体,预测的分子量为35.5kD,等电点为8.12,在该蛋白的N末端包含一个由31个氨基酸残基组成的信号肽,是一种分泌型蛋白。蛋白质前体含有信号肽区域、N-端结构域、Follistatin结构域Ⅰ、Follistatin结构域Ⅱ、Follistatin结构域Ⅲ和C-端结构域。比较分析表明半滑舌鳎FST氨基酸序列与其他物种的FST同源性较高,其结构域Ⅰ和Ⅱ保守性更高,并富含保守的半胱氨酸残基。FST在半滑舌鳎10种组织中均有表达,其中在精巢、卵巢、脾脏中表达量较高;发育时期FST表达呈现出一定的波动性,与MSTN的表达量变化趋势相似并表现出一定的相互作用,暗示了FST在早期发育中发挥了作用。 2、半滑舌鳎的ActRIIB基因的克隆及表达分析 ActRIIB是myostatin通路中重要的受体蛋白,通过同源克隆和RACE技术得到半滑舌鳎的ActRIIB基因cDNA全长2053bp,其中ORF序列为1539bp,还包括195 bp的5’UTR,325 bp的3’UTR。该基因编码512个氨基酸,蛋白质预测的分子量约为58.12 KD,等电点为5.80,N末端有一个24个氨基酸残基组成的信号肽,为跨膜蛋白。该蛋白含有明显的的丝氨酸/苏氨酸激酶激活位点签名序列,及胞外结构域,转膜结构域,丝氨酸/苏氨酸激酶结构域等三个重要结构域。在半滑舌鳎所有检测的10种组织中都不同程度上观察到了AcvRIIB的表达,但存在表达量上的差异;ActRIIB为母源性表达,与MSTN相比,在发育时期的表达低量且较为稳定。

关键词： myostatin Follistatin ActRIIB 基因克隆半滑舌鳎