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绵羊myomaker基因的克隆与真核表达及其在成肌细胞融合中的作用

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绵羊Myomaker基因的克隆与真核表达及其在成肌细胞融合中的作用

作者：尤钊山西农业大学

学位级别：硕士

myomaker（TMEM8c）蛋白是在小鼠中首次发现的一种能够促进成肌细胞融合的肌肉特异性跨膜蛋白,但其在绵羊中的DNA和m RNA序列目前仅限于预测。为了探究绵羊myomaker在成肌细胞融合中的作用,并进一步将其应用于改善肌肉发育,本试验旨在... 详细信息

myomaker（TMEM8c）蛋白是在小鼠中首次发现的一种能够促进成肌细胞融合的肌肉特异性跨膜蛋白,但其在绵羊中的DNA和m RNA序列目前仅限于预测。为了探究绵羊myomaker在成肌细胞融合中的作用,并进一步将其应用于改善肌肉发育,本试验旨在通过生物信息学预测绵羊myomaker的结构,克隆并构建myomaker-（GS）-EGFP融合表达载体p myomaker-EGFP以及真核表达载体pcDNA3.1-myomaker,对其进行亚细胞定位和功能的研究。对绵羊成肌细胞分别进行了myomaker基因的过表达和干扰处理,其中过表达试验分为对照组（Control）、空载体组（c DNA3.1）和过表达组（c DNA3.1-MYMK）;干扰试验分为对照组（Control）、阴性对照组（si NC）和干扰组（si MYMK）。对处理后的绵羊成肌细胞在未分化和诱导分化状态各培养24 h、48 h和72 h。然后利用倒置显微镜观察细胞表型变化,通过细胞划痕试验检测细胞迁移率,并使用免疫荧光法、荧光定量PCR和Western Blot方法检测myomaker及融合相关基因m RNA和蛋白的表达变化。结果如下:1.成功获得了绵羊myomaker CDS区序列,并构建了p myomaker-EGFP和pcDNA3.1-myomaker表达载体。2.亚细胞定位显示绵羊myomaker蛋白主要定位于细胞膜上,其分子量为24606.2,等电点为8.91;二级和三级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主;跨膜区分析发现绵羊myomaker蛋白有七个跨膜结构域。内源性myomaker与外源性重组质粒p myomaker-EGFP在绵羊成肌细胞中的表达结果证实了其在细胞膜的定位。绵羊内源性myomaker的表达在分化48 h和72 h显著升高,其中48 h最高。3.在绵羊成肌细胞转染myomaker基因表达载体后,在未分化与分化条件下,过表达组myomaker基因表达量均极显著升高,表明成功实现了myomaker基因的过表达。在绵羊成肌细胞转染干扰myomaker的si RNA后,在未分化与诱导分化条件下,siMYMK组myomaker基因表达量均极显著下降,表明成功实现了myomaker基因的干扰。4.免疫荧光检测MyHC蛋白的结果显示,绵羊成肌细胞过表达myomaker并诱导分化后,形成了长度更长,直径更大,细胞核数量更多的肌管,细胞融合指数极显著上升。而干扰myomaker并诱导分化后,形成的肌管不明显,成肌细胞大部分为单核状态,细胞融合指数极显著下降。5.细胞划痕试验表明,在细胞迁移24 h时,绵羊过表达myomaker基因促进了成肌细胞的迁移;而干扰myomaker基因则抑制了成肌细胞的迁移。***-PCR检测成肌细胞融合相关基因Myh1、Myh2、Myh7和CKM m RNA表达的结果显示:绵羊成肌细胞过表达myomaker基因后,在未分化24 h时CKM基因表达量极显著降低;48 h时Myh1、Myh2、Myh7和CKM基因表达量极显著降低;72 h时Myh1和Myh2表达量极显著升高,Myh7和CKM基因表达量极显著降低。诱导分化条件下,过表达组在分化24 h、48 h和72 h时,Myh1和Myh2基因表达量极显著升高,Myh7和CKM基因表达量极显著降低。绵羊成肌细胞干扰myomaker基因后,在未分化24 h、48h时Myh1、Myh2和CKM基因表达量极显著降低;72 h时Myh1、Myh2、Myh7和CKM基因表达量极显著降低。诱导分化条件下,干扰组在分化24 h时Myh1、Myh2、Myh7和CKM基因表达量极显著降低;分化48 h、72 h时Myh1、Myh2和CKM基因表达量极显著降低。*** blot检测结果显示绵羊成肌细胞过表达myomaker基因后,在未分化和诱导分化条件下,myomaker蛋白和MyHC蛋白表达量极显著升高。绵羊成肌细胞在干扰myomaker基因后,在未分化时myomaker和MyHC蛋白表达量极显著降低。诱导分化条件下,myomaker蛋白表达量极显著降低;MyHC蛋白表达量显著降低。结论:克隆并证实了绵羊myomaker基因的CDS区全长序列（666 bp）。绵羊myomaker主要定位于细胞膜,在成肌细胞分化中期和后期表达量明显升高,主要发挥促进成肌细胞融合的作用,且在分化后期的促融合作用增强,其部分作用机制可能与促进细胞迁移和调控MyHC表达有关。

关键词：绵羊 myomaker 成肌细胞融合 siRNA 真核表达

myomaker和Myomerger调控成肌细胞融合的分子机制

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遗传 2019年第12期41卷 1110-1118页

作者：朱艳张进威齐婧李学伟陈磊李明洲马继登四川农业大学动物科技学院畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室成都611130 重庆市畜牧科学院重庆402460

骨骼肌形成是一个复杂的生理过程,主要涉及肌源性干细胞增殖形成成肌细胞,进而分化、融合形成多核肌管。研究发现,有多种蛋白参与成肌细胞融合过程,但它们均不具有肌肉特异性。近年来,两种肌肉特异性膜蛋白myomaker和Myomerger先后被发... 详细信息

骨骼肌形成是一个复杂的生理过程,主要涉及肌源性干细胞增殖形成成肌细胞,进而分化、融合形成多核肌管。研究发现,有多种蛋白参与成肌细胞融合过程,但它们均不具有肌肉特异性。近年来,两种肌肉特异性膜蛋白myomaker和Myomerger先后被发现和鉴定,它们能协调促进成肌细胞融合,从而参与骨骼肌形成过程。本文对成肌过程中myomaker和Myomerger的表达模式、功能域等研究现状及其参与成肌细胞的融合机制进行了综述,旨在为深入研究骨骼肌形成过程及治疗肌细胞融合相关疾病提供参考信息。

关键词：骨骼肌形成 myomaker Myomerger 细胞融合

miR-205通过靶向抑制myomaker表达抑制猪骨骼肌卫星细胞融合

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miR-205通过靶向抑制Myomaker表达抑制猪骨骼肌卫星细胞融合

作者：朱艳四川农业大学

学位级别：硕士

猪(Sus scrofa)不仅是重要的农业动物,在探究骨骼肌生长发育和其他人类相关疾病的分子机制方面也是重要的模式动物。骨骼肌形成是动物生长发育过程中极其重要的步骤,其中TMEM8c(也叫myomaker,MYMK)作为一种肌肉特异性跨膜蛋白,能显著促... 详细信息

猪(Sus scrofa)不仅是重要的农业动物,在探究骨骼肌生长发育和其他人类相关疾病的分子机制方面也是重要的模式动物。骨骼肌形成是动物生长发育过程中极其重要的步骤,其中TMEM8c(也叫myomaker,MYMK)作为一种肌肉特异性跨膜蛋白,能显著促进成肌细胞融合,在骨骼肌正常发育中发挥关键作用,该结果已在多个物种中得到验证,但是myomaker对猪(Sus scrofa)成肌细胞融合的作用以及分子调控机制尚不清楚。因此,本试验采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测myomaker在猪骨骼肌生长发育和原代成肌细胞融合过程中的表达情况,并通过免疫荧光试验研究myomaker过表达对成肌细胞融合的影响;利用3’RACE(3’Rapid Amplification of c DNA Ends)技术扩增出猪myomaker的3’UTR序列,结合双荧光素酶报告系统筛选出对myomaker具有靶向调节作用的miRNAs,并验证miRNAs对成肌细胞融合的影响;最后通过构建猪骨骼肌损伤模型研究myomaker在骨骼肌再生过程中的表达情况。本研究主要结果如下:(1)RT-PCR结果显示,myomaker在长白猪骨骼肌组织中的表达水平极显著高于其他组织(心、肝、脾、肺、肾和皮肤)(Pmyomaker的表达呈现上升趋势,且在分化第四天其表达量达到峰值,之后开始降低。(2)myomaker功能验证结果显示,myomaker过表达后促进多核肌管的形成,肌管融合指数显著上升(Pmyomaker能促进猪成肌细胞融合,形成多核肌管。(3)通过MEGA6.0软件构建了myomaker氨基酸进化树,并利用3’RACE技术成功扩增出猪myomaker的3’UTR序列。(4)Targetscan、RNAhybrid和双荧光素酶报告系统表明miR-205能与myomaker 3’UTR靶向结合;miR-205功能验证显示,miR-205过表达能显著抑制myomaker的表达以及成肌细胞融合(Pmyomaker表达被激活,在损伤第五天其表达量达到峰值,且出现大量新生肌纤维;此外,肌源性转录因子Myo D、Myo G和Myf5的表达模式与myomaker类似。综上所述,本研究发现myomaker在猪成肌细胞融合和骨骼肌再生过程中发挥作用,并证明miR-205通过靶向调节myomaker表达抑制成肌细胞融合。

关键词：猪成肌细胞融合 myomaker miR-205 骨骼肌损伤

地塞米松对小鼠骨骼肌myomaker与MyoD基因表达的影响

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地塞米松对小鼠骨骼肌Myomaker与MyoD基因表达的影响

作者：张枫惠山西农业大学

学位级别：硕士

myomaker是一种肌肉特异性跨膜蛋白,对肌细胞的融合至关重要,MyoD是肌肉发育和形成过程中的重要因子。在持续应激状况下,机体产生的过量的糖皮质激素造成肌肉萎缩,对机体的发育产生不利影响,为了研究过量的糖皮质激素作用于机体后,Myoma... 详细信息

myomaker是一种肌肉特异性跨膜蛋白,对肌细胞的融合至关重要,MyoD是肌肉发育和形成过程中的重要因子。在持续应激状况下,机体产生的过量的糖皮质激素造成肌肉萎缩,对机体的发育产生不利影响,为了研究过量的糖皮质激素作用于机体后,myomaker和MyoD对机体的修复与再生作用,本研究中用地塞米松(人工合成的糖皮质激素)以20mg/kg/d剂量腹腔注射于小鼠体内,并用生理盐水作为对照,连续注射一周后分别在注射结束后的第一天、第四天、第七天和第十四天对小鼠的股四头肌进行采样,并通过免疫组织化学、qRT-PCR和Western blotting技术对myomaker和MyoD基因的表达进行检测。结果表明:(1)通过PCR方法在健康成年小鼠骨骼肌中扩增到myomaker基因CDS区,并且测序结果与NCBI上myomaker基因的登录序列相同,进一步通过免疫组织化学和Western blotting试验证实myomaker蛋白在健康成年小鼠骨骼肌中存在表达。(2)myomaker蛋白主要表达于肌细胞膜上,MyoD蛋白主要存在于细胞核里。光密度分析结果表明,在处理后一天,myomaker蛋白的表达量较弱,MyoD蛋白表达量较强,在处理后第四天,二者的表达均显著增加,之后维持在正常水平。(3)在地塞米松处理后第一天,myomaker mRNA和蛋白表达显著降低,MyoD mRNA和蛋白表达有升高趋势,在处理后第四天myomaker与MyoD基因mRNA和蛋白的表达均明显增加,之后维持在正常水平。结论:myomaker基因在健康成年小鼠骨骼肌中存在表达。在地塞米松连续处理一周后的第四天,myomaker和MyoD二者的表达量均明显升高,表明地塞米松处理后能够促进myomaker和MyoD的表达,以为可能发生的肌肉再生做出适应性准备。

关键词： myomaker MyoD 地塞米松小鼠骨骼肌

Genome Editing in the Olive Flounder(Paralichthys olivaceus)Using CRISPR/Cas9 and a Simple Microinjection System

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Journal of Ocean University of China 2021年第6期20卷 1528-1536页

作者： TAN Xungang WANG Ling WU Zhihao JIAO Shuang WANG Lijuan ZOU Yuxia JIANG Jingteng YOU Feng CAS and Shandong Province Key Laboratory of Experimental Marine Biology Center for Ocean Mega-ScienceInstitute of OceanologyChinese Academy of SciencesQingdao 266071China Laboratory for Marine Biology and Biotechnology Qingdao National Laboratory for Marine Science and TechnologyQingdao 266071China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China Weihai Fishery Technology Promotion Station Weihai 264200China Shenghang Aquatic Science and Technology Co. Ltd.Weihai 264200China

The whole-genome sequence of the olive flounder(Paralichthys olivaceus)provides a basis for gene functional analyses,which is important for the aquaculture *** gene function will help us to select better economic traits such as fast growth and better culture conditions,which further will increase the aquaculture *** knockout is an important reverse genetics approach for in vivo studies of gene *** this study,the CRISPR/Cas9 genome editing method with a microinjection system using a simple braked needle was employed in olive *** injection in embryos,green fluorescent protein expression was detected in 40%of *** proportion of normal-hatched larvae was approximately 50%.Different mutations,including short indels and fragment deletions,were found in our test genes gsdf and ***,we detected more than one mutation in a single *** summary,our microinjection technique and CRISPR/Cas9 can be applied to study gene functions in olive flounder.

关键词： CRISPR/Cas9 gsdf microinjection myomaker needle with brake olive flounder

HuR促进山羊骨骼肌卫星细胞分化的分子机制研究

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HuR促进山羊骨骼肌卫星细胞分化的分子机制研究

作者：孙严金四川农业大学

学位级别：硕士

肌肉的生长发育是一个极其复杂和精密的过程,受到多种调节因子,包括生长因子、转录因子、调节蛋白和一些激素受体构成的调控网络共同作用。近年的研究发现,大量编码RNA和非编码RNA(miRNA、lncRNA和circRNA)也参与肌肉生成的调控。Hu抗原... 详细信息

肌肉的生长发育是一个极其复杂和精密的过程,受到多种调节因子,包括生长因子、转录因子、调节蛋白和一些激素受体构成的调控网络共同作用。近年的研究发现,大量编码RNA和非编码RNA(miRNA、lncRNA和circRNA)也参与肌肉生成的调控。Hu抗原R(Hu-antigen R,HuR)作为RNA结合蛋白之一,其在肌肉的生长发育以及多种生物过程中发挥重要的调节作用。目前已有研究表明HuR可以调节肌肉的生长发育,但其在畜禽动物肌肉发育方面的研究报道还很少,尤其是在山羊上。本试验以山羊骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite,MuSCs)为试验材料,利用qPCR、MyHC免疫荧光、蛋白免疫印迹杂交、转录组测序(RNA-seq)、RNA免疫共沉淀和RNA稳定性试验等技术,揭示HuR在山羊MuSCs分化中的作用,解析HuR调控山羊MuSCs分化的分子调控机制。主要研究结果如下:(1)山羊不同组织(背最长肌、腰大肌、半膜肌、半腱肌、腓肠肌、大脑、肝、肺和肾组织)中HuR mRNA的表达谱结果显示,HuR在肌肉组织中的表达高于其他组织。HuR mRNA在山羊不同发育时期背最长肌E90、E105、E135、B3、B150(E为胚胎期,B为出生后)中的表达,结果显示,HuR在胚胎期90天的表达高于其它时期,而且,HuR在MuSCs增殖和分化过程中波动表达。(2)在MuSCs分化过程中,过表达HuR显著上调了肌源性标记基因MyoG、MyoD和MyHC的mRNA水平(Pmyomaker,CHRNA1,CAPN6)极显著下调(Pmyomaker可以与HuR结合。(4)在MuSCs分化时期,过表达HuR后,myomaker mRNA和蛋白表达均显著增加(Pmyomaker mRNA和蛋白表达均显著降低(Pmyomaker的稳定性显著降低。此外,我们验证了HuR可以增强成肌基因mRNA(MyoD、MyoG)稳定性,进一步促进山羊MuSCs分化。(5)共转染试验结果显示,抑制myomaker后,MyoG和MyHC的mRNA表达降低。HuR的过表达消除了干扰myomaker对MuSCs的抑制作用。因此,HuR通过增加myomaker的稳定性促进山羊MuSCs分化。综上所述,在本研究中,我们证明HuR是肌肉分化的关键翻译后调节因子,并确定了myomaker是HuR在促进山羊肌肉分化中的新靶点。从机制上,HuR与myomaker结合并增加myomaker的mRNA稳定性,从而通过正调节myomaker的表达来激活MuSC分化。该研究结果为HuR调控山羊骨骼肌发育过程中的分子机制提供参考依据,同时,对于完善山羊肌肉生长发育的分子调控网络具有重要意义。

关键词：山羊 Hu抗原R 骨骼肌卫星细胞分化 myomaker

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褪黑素抑制小鼠成肌细胞分化的机理研究

褪黑素抑制小鼠成肌细胞分化的机理研究

作者：陈彼得浙江大学

学位级别：硕士

褪黑素是一种由松果体分泌的多效激素,研究证实其功能的多样性可促进骨骼肌的再生与修复,例如抗炎症作用、抗凋亡作用和抗氧化应激作用。然而,褪黑素对肌生成的负面作用却鲜有报道。因此本研究设计试验探究了不同浓度褪黑素对小鼠成肌... 详细信息

褪黑素是一种由松果体分泌的多效激素,研究证实其功能的多样性可促进骨骼肌的再生与修复,例如抗炎症作用、抗凋亡作用和抗氧化应激作用。然而,褪黑素对肌生成的负面作用却鲜有报道。因此本研究设计试验探究了不同浓度褪黑素对小鼠成肌细胞增殖、分化和凋亡的影响;进一步通过高通量测序,探究褪黑素抑制肌肉发育的作用机制。研究的具体内容和结果如下:1不同浓度褪黑素对小鼠成肌细胞增殖、分化和凋亡的影响本研究主要以C2C12细胞为研究对象,探究了不同浓度褪黑素（0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2mM）对成肌细胞增殖、分化和凋亡的影响。在增殖方面,l mM褪黑素在48-96h之内可显著促进C2C12细胞增殖（48h,P＜0.05;72h,P＜0.01;96h,P＜0.01）。2mM褪黑素在0-24h之内对C2C12细胞增殖没有显著影响,但在48-96h之内抑制了 C2C12细胞增殖并导致细胞出现死亡（48h,P＜0.05;72h,＜0.01;96h,P＜0.001）。结晶紫染色结果表明,与对照组相比,1 mM褪黑素处理48h致使C2C12细胞密度增加了 20%。实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,1 mM褪黑素处理48h显著提高了 Ki67mRNA水平。免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,1 mM褪黑素处理48h显著提升了 Ki67阳性细胞的比例。在分化方面,0-0.5mM褪黑素处理4天对C2C12细胞分化没有显著影响,而1、2mM褪黑素处理却显著的抑制了 C2C12细胞分化,降低了成肌分化标志基因 Myogenin（1 mM 和 2 mM,P＜0.001）,eMyhc（1 mM 和 2 mM,P＜0.001）和肌融合标志基因 Cadh-15（2mM,P＜0.01）,Capn-1（2mM,P＜0.01）,Cav3（0.05-0.5 mM,P＜0.05;1 和 2mM,P＜0.001）以及 Des（1 mM,P＜0.05和2 mM,P＜0.01）的mRNA水平。在凋亡方面,流式分析结果显示,与对照组相比,1 mM褪黑素处理没有产生明显的凋亡现象,而2mM褪黑素处理则显著诱导C2C12细胞产生凋亡。2褪黑素处理显著抑制小鼠C2C12成肌细胞和小鼠原代成肌细胞的分化通过采用不同浓度褪黑素处理C2C12细胞,我们发现1 mM褪黑素可以促进C2C12细胞增殖,但却抑制其分化。在此基础上,本研究进一步表明,1 mM褪黑素可抑制C2C12成肌细胞和小鼠原代成肌细胞的分化效率,阻碍其肌管形成。免疫荧光染色（MyHC）结果均显示C2C12成肌细胞和小鼠原代细胞的肌管形成受到到显著抑制,肌管核数与对照组相比明显减少。免疫荧光染色（MyoG）和统计分析结果表明褪黑素处理组中C2C12成肌细胞中MyoG阳性细胞的比例相比于对照组显著减少。实时荧光定量PCR结果显示褪黑素处理的C2C12成肌细胞中分化和融合相关基因的MyoG,eMyhc,Cav3,Des的mRNA水平与对照组相比显著减少,而MyoD和Myh8无显著性差异。蛋白印迹结果显示褪黑素处理的C2C12成肌细胞中分化标志基因MyoG,MyHC的蛋白水平与对照组相比显著减少,而MyoD的蛋白水平无显著性差异。3褪黑素处理显著下调了小鼠C2C12成肌细胞肌融合特异性基因myomaker和Myomixer-myomerger-minion 的表达为了探究褪黑素抑制小鼠成肌细胞分化的机制,我们对褪黑素处理的C2C12成肌细胞和对照组进行高通量测序。结果表明,与对照组相比,褪黑素处理的C2C12细胞中共有364个基因上调,774个基因下调。Go富集分析表明,超过40%的差异基因属于生物学过程大类,而另外两大类（细胞组分和分子功能）基因由79%细胞内组分,64%细胞膜组分和59%蛋白结合组分构成。基因热图显示,与对照组相比,褪黑素处理的C2C12细胞中肌球蛋白重链家族基因显著下降。而且在差异性基因表达谱中,有两种最新报道的肌融合特异性基因myomaker（Tmem8c）和 Myomixer-myomerger-minion（Gm7325）也发生了显著下降。另外,也有一些Wnt信号通路相关基因发生了两倍以上的变化:Fzdl,Sfrp2,Wisp2,Prkca,Camk2a 和 Porcn。4褪黑素通过磷酸化GSK-3b丝氨酸9号位点调控C2C12细胞成肌分化以及 myomaker 和 Myomixer-myomerger-minion 的表达研究表明,与对照组相比,褪黑素处理可显著降低pGSK-3b,b-catenin的蛋白表达量。免疫荧光染色（b-catenin）结果表明褪黑素处理组中C2C12成肌细胞中b-catenin表达量相比于对照组显著减少。为了进一步验证褪黑素通过GSK-3b调控小鼠成肌细胞分化,我

关键词： C2C12 褪黑素增殖分化凋亡 myomaker Myomixer Myomerger Minion