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多重PCR技术和重组DNA技术在水产品安全中的应用

多重PCR技术和重组DNA技术在水产品安全中的应用

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作者：郭倩倩上海海洋大学

学位级别：硕士

我国是水产品生产、消费和输出大国,水产品质量安全问题关系到我国广大人民群众的生命健康,关系到经济健康发展和社会稳定,关系到政府和国家的形象。同时,由于我国传统的水产业发展模式落后,整体生产力水平低下,高密度的养殖环境导致大... 详细信息

我国是水产品生产、消费和输出大国,水产品质量安全问题关系到我国广大人民群众的生命健康,关系到经济健康发展和社会稳定,关系到政府和国家的形象。同时,由于我国传统的水产业发展模式落后,整体生产力水平低下,高密度的养殖环境导致大量致病菌迅速繁殖;为了防治这些致病菌,滥用抗生素现象严重,再加上水环境污染越演越烈,有毒物质通过食物链在水产品体内大量蓄积,水产品质量安全问题严重威胁到广大人民群众的利益。因此,在今后相当长的时间内,水产品的安全检测和质量控制将是我们面临的一个重要课题。本研究内容分两部分。第一部分针对水产品中日益复杂的食源性致病菌的混合污染,建立了一种能同时、准确、快速检测多种常见食源性致病菌的多重PCR方法。沙门氏菌(Salmonella)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus )和副溶血性弧菌( Vibrio parahaemolyticus)是我国水产品中引起食源性疾病及食物中毒的重要致病菌。传统的微生物鉴定方法需分离培养、生化反应和血清学鉴定等多个步骤,操作复杂、检测周期长、灵敏度低,而且每次只能检测出一种致病菌。本研究根据沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白基因(invA)、单核细胞增生李斯特菌的侵入关联蛋白基因(iap)、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)和副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因(tdh)分别设计四对特异性引物,并以细菌16SrRNA基因的部分保守序列为内标,通过对退火温度、引物浓度等反应参数的调整和优化,建立了如下多重PCR方法:10×PCR buffer 2.0μL(含Mg)、dNTP 200μmol/L、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶2.5U,引物浓度分别为:16SrRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L,加无菌水至总体积为20μL;反应条件:94℃预变性4min、94℃变性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min,反应共进行30个循环。为了检验该方法的可行性,进一步对人工接种上述四种病原菌的南美白对虾进行了多重PCR检测。研究结果表明:对污染样品直接提取DNA和预增菌后提取DNA再进行多重PCR检测,均能有效扩增出各个目的片段;但预增菌处理后可使检测限明显降低,进而大大提高了检测的灵敏度。本研究建立的多重PCR方法为食品包括水产品中病原微生物的检测提供了快速、灵敏和高效的检测技术。第二部分针对水产养殖中滥用抗生素的现象,拟通过重组DNA技术制备一种能替代传统抗生素的、无残留的新型广谱抗菌饲料添加剂——抗菌肽。抗菌肽是由生物细胞特定基因编码的一类具有强抗菌作用的小分子多肽,广泛存在于各种生物体内,在机体天然免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。本研究对斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏表达的抗菌肽(LEAP-2)的成熟肽基因进行了cDNA克隆、测序及表达载体的构建,为重组抗菌肽的制备奠定了重要的研究基础。首先以已经获取的LEAP-2全长cDNA为模板,设计含有酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ的双向引物,扩增得到长度为140bp的成熟肽区域的基因片段,命名为“mleap-2”,将其连接到pSURE-T克隆载体后进行测序确证;选择pET-30a作为表达载体,采用EcoRⅠ和HindⅢ分别对表达载体pET-30a和mleap-2目的片段进行双酶切,以期构建重组表达质粒。经PCR插入检验和双酶切鉴定证明pET30a-mleap-2重组表达质粒已被成功构建;经转化BL21工程菌测序后,证明该成熟肽基因未发生任何变异。本研究为mleap-2的原核表达及抗体的制备奠定了重要的前期研究基础。

关键词：水产品安全多重PCR 重组DNA 抗菌肽 mleap-2基因 cDNA克隆重组表达质粒

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