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4例植物固醇血症患者的临床、家系调查及基因发病机制研究

4例植物固醇血症患者的临床、家系调查及基因发病机制研究

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作者：赵水明南昌大学

学位级别：硕士

目的:通过对4例植物固醇血症先证者血清植物固醇浓度的检测、家系调查及基因测序,明确先证者的基因缺陷特点及家系遗传特点。对一例ABCG8基因内含子突变的致病机制进行研究。方法:第一部分:收集4例先证者的临床资料,同时进行家系调查。... 详细信息

目的:通过对4例植物固醇血症先证者血清植物固醇浓度的检测、家系调查及基因测序,明确先证者的基因缺陷特点及家系遗传特点。对一例ABCG8基因内含子突变的致病机制进行研究。方法:第一部分:收集4例先证者的临床资料,同时进行家系调查。采集先证者的外周血,进行血清植物固醇浓度检测,同时提取外周血基因组DNA,通过基因测序,明确致病基因突变位点,并对家系成员进行基因突变验证。第二部分:采用minigene技术对其中一例先证者ABCG8基因c.322-2A>G突变进行致病性分析。明确内含子突变对RNA剪接的影响后,通过真核表达载体验证ABCG8基因c.322-2A>G突变对蛋白的影响。结果:第一部分:1、本研究共诊断4例植物固醇血症患者,2例患者父母为近亲婚配。4例先证者血常规均有贫血及血小板减少,网织红细胞升高,有溶血性贫血的表现。外周血涂片提示其中4例可见口形红细胞,3例患者见巨大血小板;4例先证者均有脾大,其中3例可见胆红素及转氨酶轻度升高,有2例患者有心血管累及,有1例患者出现了黄色瘤;4例患者骨髓细胞学提示均为增生明显活跃,红系明显升高,粒红比倒置,巨核细胞均增生活跃,未见明显病态造血;后期随访中有1例患者死于肝功能衰竭。4例患者血清菜油固醇、β-谷固醇的含量明显升高,其中3例可见豆固醇含量轻度升高。2、在PCR扩增及全外显子测序中,病例1发现了2个致病突变,即ABCG5基因中c.64C>T:p.Q22X及c.1336C>T:p.R446X的突变。病例2发现了3个致病突变,为ABCG8基因中c.A1732T:p.I578L、c.G1720A:p.G574R及c.T1621C:p.C541R突变。病例3发现了1个致病突变,为ABCG5基因中c.1336C>T:p.R446X:纯合无义突变。病例4发现了1个致病突变,为ABCG8基因c.323-2A>G纯合突变。经数据库检索ABCG8基因c.A1732T:p.I578L、c.T1621C:p.C541R突变及c.323-2A>G突变均为新发突变。第二部分:1、我们使用pc MINI和pc MINI-C两套载体,采用minigene技术对病例4ABCG8基因c.323-2A>G突变进行转录后剪接方式的验证,结果发现c.322-2A>G突变会影响基因m RNA的正常剪接,且pc MINI和pc MINI-C两套载体的检测结果一致,都会导致Exon4跳跃,整个Exon4同时被剪切掉,蛋白翻译时将产生移码突变,在后续第10个氨基酸位置形成终止密码,其在c DNA及蛋白水平的表示方式为:c.323＿561del239bp ***109Glyfs*10。2、在体外经Phage及GFP系列真核细胞表达载体中,ABCG8基因c.322-2A>G突变后导致HA-ABCG8-Flag及GFP-ABCG8 m RNA水平和融合蛋白水平表达量均显著下调。结论:1、本研究诊断的4例植物固醇血症患者,1例患者有典型的黄色瘤,2例患者伴有心血管累及,4例均有溶血性贫血及血小板减少;3例患者出现肝功能异常,外周血涂片可见巨大血小板、口形红细胞;骨髓细胞学均未见明显的病态造血等异常。4例患者血清植物固醇浓度(菜油固醇、β-谷固醇)均显著升高。2、通过基因测序,4例患者共发现了6个致病性突变,ABCG5、ABCG8均有,其中2个无义突变(ABCG5基因c.64C>T:p.Q22X和c.1336C>T:p.R446X突变),3个错义突变(ABCG5基因c.T1621C:p.C541R突变,ABCG8基因c.A1732T:p.I578L、c.G1720A:p.G574R突变),1个内含子突变(ABCG8基因c.323-2A>G突变)。其中经数据库检索,ABCG8基因c.A1732T:p.I578L、c.T1621C:p.C541R突变及c.323-2A>G突变均为新发突变。3、ABCG8基因c.323-2A>G纯合突变将导致ABCG8基因外显子4在转录后的剪接过程中被剪切掉(c.323＿561del239bp),在第5外显子中产生提前的终止密码子(***109Glyfs*10),最终导致疾病的发生。4、临床上对于出现黄色瘤、早发性冠心病、不明原因肝功能异常、溶血性贫血、口形红细胞、巨大血小板的患者应考虑植物固醇血症可能,需积极进行血清植物固醇浓度以及基因检测。

关键词：植物固醇血症 ABCG5基因 ABCG8基因基因突变全外显子测序 minigene技术

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Wiskott-Aldrich综合征家系新发外显子与内含子双突变协同致病作用体外研究

Wiskott-Aldrich综合征家系新发外显子与内含子双突变协同致病作...

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作者：侯雪宁河北医科大学

学位级别：硕士

目的:Wiskott-Aldrich综合征(Wiskott-Aldrich syndrome,WAS)是一种罕见的X连锁隐性遗传的原发性免疫缺陷病,由WASP基因突变导致WAS蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein,WASp)表达异常所致。WAS的临床表型差异较大,WASP基因突变、WASp表达水平均与临床表型密切相关。本研究采用minigene技术对一个有两个新发突变位点的WAS家系进行体外研究,探索新发内含子突变对外显子的剪接作用并结合新发突变WAS家系中患者的临床表现分析基因型与表型的相关性。方法:1.收集家系患者临床资料、家系情况、蛋白表达以及测序结果;2.利用生物信息学在线工具The Mutation Taster和Poly Phen-2分析基因突变致病性;3.采用minigene法构建WAS野生型(mini-WASP-WT)、单外显子突变型(mini-WASP-Mut1)、单内含子突变型(mini-WASP-Mut2)以及双突变型(mini-WASP-Mut3)共4组重组质粒并进行COS-7细胞转染表达;4.逆转录实时荧光定量PCR检测空质粒、野生型及3组突变型重组质粒中m RNA的相对表达量;5.对逆转录cDNA产物进行直接测序并对比验证。结果:1.先证者及其表弟均有血小板减少伴小血小板、感染及出血等临床表现,临床评分为4分和5分,且有血小板减少家族史。两名患者均存在WASP基因新发外显子2上c.158T>C突变,导致p.L53P改变;表弟还存在第二新发内含子突变IVS2+14C>T。先证者流式细胞术及免疫印迹检测均显示蛋白表达明显减少。2.生物信息预测工具显示新发外显子c.158T>C突变的致病性预测结果为可能具有致病性。3.成功构建WAS野生型及3个突变型部分基因序列的重组质粒并通过测序验证显示mini-WASP-WT为正常基因序列、mini-WASP-Mut1有突变c.158T>C、mini-WASP-Mut2有突变IVS2+14C>T,mini-WASP-Mut3包含c.158T>C和IVS2+14C>T两个突变,细胞转染后验证转染成功的测序结果同上。4.逆转录实时荧光定量PCR检测结果显示mini-WASP-WT的相对表达量为1681.849;mini-WASP-Mut1的相对表达量为2498.951;mini-WASP-Mut2为2055.928;而mini-WASP-Mut3则为881.948。5.体外表达RNA的逆转录c DNA产物测序结果显示,包含内含子突变的mini-WASP-Mut2及mini-WASP-Mut3均得到的是包含前三个外显子的360bp的基因序列,无基因的增加或缺失;mini-WASP-Mut2与同mini-WASP-WT均一样为正常基因序列;mini-WASP-Mut1和mini-WASP-Mut3是只包含c.158T>C突变的360bp外显子序列。结论:本研究明确了WAS家系新发内含子突变不影响外显子的剪接,排除了该突变在转录水平使本WAS家系中表弟临床表现较重的影响。应用minigene法进行体外研究为探究WAS新发点突变的发病机制提供了新思路。

关键词： Wiskott-Aldrich综合征新发突变 minigene技术剪接作用体外验证

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Adams-Oliver综合征DOCK6基因突变检测及功能研究

Adams-Oliver综合征DOCK6基因突变检测及功能研究

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作者：王兆坤郑州大学

学位级别：硕士

Adams-Oliver综合征(Adams-Oliver Syndrome,AOS,MIM100300)是一种以先天性头皮缺陷及远端肢体缺陷为主要特点的可累及神经、眼部及心血管系统的先天性多系统发育异常疾病。根据其遗传方式,可将其分为常染色体显性遗传和常染色体隐性遗... 详细信息

Adams-Oliver综合征(Adams-Oliver Syndrome,AOS,MIM100300)是一种以先天性头皮缺陷及远端肢体缺陷为主要特点的可累及神经、眼部及心血管系统的先天性多系统发育异常疾病。根据其遗传方式,可将其分为常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传,其中由DOCK6基因突变所致常染色体隐性遗传的Adams-Oliver综合征称为Adams-Oliver综合征2型(AOS2)。AOS2患者的主要临床表现为末端肢体缺陷如手指(趾)缺如、指(趾)短、并指及甲发育不全和头皮发育不全如头顶部皮肤缺损、头皮萎缩,部分患者可出现中枢神经系统、眼部及心血管系统发育异常。DOCK6(dedicator of cytokinesis 6 gene)基因位于19号染色体19p13.2,由48个外显子组成。DOCK6基因编码的鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)通过激活G蛋白家族的RaC1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)和CDC42的过程中作为分子开关调节鸟苷二磷酸(GDP)与鸟苷三磷酸(GTP)相互转换。RaC1与CDC42在调节肌动蛋白细胞骨架的过程中起至关重要的作用,二者在G蛋白家族(Rho GTPases)中负责引导肌动蛋白微丝聚合的信号蛋白,在许多基础的的细胞过程中起到关键作用,比如增殖、极化、迁移、粘附、分泌、维持细胞形态、细胞分裂、凋亡及吞噬作用。DOCK6蛋白主要有2个功能域,DHR1和DHR2。DHR2功能域含有422个氨基酸并在物种进化过程中高度保守,其主要功能是调控小G蛋白的GEF的活性。DHR2功能域的缺失可以导致DOCK6蛋白的功能失活,进而产生AOS表型。在本研究中,我们对一个临床初步诊断为AOS的家系进行了基因检测,新发现了DOCK6基因的2处突变:c.3063 C>G(p.Y1021*)无义突变与c.4106+2T>C剪接位点突变。两处突变均为首次报道的新突变。Sanger DNA测序进一步验证了2个突变分别遗传自先证者父亲和母亲。随后,我们对c.4106+2T>C突变构建了minigene载体并通过RT-PCR技术研究c.4106+2T>C剪接突变的影响,结果显示:c.4106+2T>C剪接位点突变导致内含子中的隐蔽剪接位点被激活,致使内含子32中有4bp的碱基滞留在第32外显子及第33外显子之间。额外的4bp的碱基导致转录本的阅读框架发生移码,并在1374位氨基酸处提前出现终止密码子,导致蛋白质的结构和异常。我们的研究结果发现DOCK6基因c.3063 C>G(p.Y1021*)无义突变及c.4106+2T>C剪接位点突变是该AOS家系的致病原因。c.3063 C>G(p.Y1021*)无义突变提前产生了终止密码子,导致产生了缺少一个N端1026氨基酸的异常蛋白,c.4106+2T>C剪接位点突变导致内含子中的隐蔽剪接位点被激活,致使内含子32中有4bp的碱基滞留在第32外显子及第33外显子之间。额外的4bp的碱基导致转录本的阅读框架发生移码,并在1374位氨基酸处提前出现终止密码子。本次研究的结果扩大了Adams-Oliver综合征报告病例的数量和DOCK6基因突变的突变谱,可以作为产前诊断和遗传咨询的基础。

关键词： Adams-Oliver综合征 DOCK6基因突变高通量测序 minigene技术

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5个先天性心脏病家系的遗传学病因分析和TBX5基因新剪接位点变异的功能鉴定

5个先天性心脏病家系的遗传学病因分析和TBX5基因新剪接位点变异...

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作者：路曼郑州大学

学位级别：硕士

背景先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)是一类由胚胎期心血管发育异常导致的心脏及大血管结构功能缺陷疾病,居婴幼儿出生缺陷首位,活产儿发病率为10‰～12‰。CHD依据生理解剖学可划分为间隔缺损、梗阻性缺陷及复杂性心血管畸... 详细信息

背景先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)是一类由胚胎期心血管发育异常导致的心脏及大血管结构功能缺陷疾病,居婴幼儿出生缺陷首位,活产儿发病率为10‰～12‰。CHD依据生理解剖学可划分为间隔缺损、梗阻性缺陷及复杂性心血管畸形,依据有无合并其它缺陷可分为综合征型CHD和单纯型CHD。CHD病情严重者可降低生活质量甚至导致死亡。因此,积极寻找病因并预防下一代缺陷是如今针对CHD的有效手段。除环境因素以外,遗传因素在CHD病因中占据重要角色,包括染色体异常、拷贝数变异及基因变异。基因变异又细分为小的插入、缺失和单核苷酸变异。目前研究已发现至少50余种CHD相关基因,但由于CHD临床表型多有交叉,不同家庭可能存在不同遗传背景,CHD的致病基因鉴定尚不完全明确,仍有相当部分的CHD相关基因及其变异有待深入研究。目的本研究采用全外显子组测序技术(Whole Exome Sequencing,WES)对5个排除染色体及CNV异常的CHD家系进行致病基因变异分析,明确其遗传背景,帮助判断再发风险,为这类家系遗传咨询及产前诊断提供指导依据。同时针对其中1个家系所发现的TBX5基因c.663+1G>C新剪接位点变异进行体外功能鉴定,探究变异引起异常剪接的机制,综合评价该变异的致病性。方法(1)采集患者病史及家族史,绘制家系图,提取家系部分人员血液基因组DNA,采用WES技术进行致病基因筛选,结合疾病相关数据库(ClinVar,HGMD)及多种生物信息学软件(SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、VarSite)进行分析,使用ACMG指南综合评价候选基因变异致病性。(2)采用minigene技术进行实验,选取pEX-3作为质粒载体,将新剪接位点变异所在内含子及其前后2个外显子作为目的基因,分别构建野生型及突变型重组质粒,转染至HEK293T细胞,提取RNA并反转录,琼脂糖电泳得到cDNA条带,最后对cDNA条带进行测序,以此鉴定目的基因表达的mRNA产物差异,来分析体外正常和变异基因的剪接能力。结果(1)CHD-01 家系检测到FBN1基因(NM00138)c.2113G>A杂合变异,CHD-02家系检测到FBN1基因(NM00138)c.6772T>C变异,均为明确的致病变异,可导致常染色体显性遗传的Marfan综合征。(2)CHD-03 家系检测到FGF13 基因(NM04114)c.227G>A变异,经ACMG指南评为意义不明变异,变异可导致X染色体显性/隐性遗传的发育性癫痫性脑病90型;CHD4基因(NM01273)c.2249C>T变异经ACMG指南评为致病变异,变异可导致染色体显性遗传的Sifrim-Hitz-Weiss综合征。(3)CHD-04 家系检测到GDF1基因(NM01492)c.1047050delCTTT及c.478G>T复合杂合变异,ACMG指南均评为意义不明变异,可导致常染色体隐性遗传的右心房异构疾病及常染色体显性遗传的多型先天性心脏病。(4)CHD-05 家系检测到TBX5 基因(NM00192)c.663+1G>C变异,ACMG指南评为致病变异,变异可导致常染色体显性遗传的Holt-Oram综合征。(5)针对CHD-05家系TBX5基因c.663+1G>C新剪接位点变异进行Mingene技术实验,结果表明野生型目的基因正常转录剪接去内含子,得到成熟mRNA,而突变型目的基因缺失了相应的条带,说明c.663+1G>C变异的存在使mRNA前体在剪接内含子时出现错误,无法正常转录出成熟mRNA。结论(1)CHD-01家系及CHD-02家系诊断为FBN1基因变异导致的Marfan综合征;CHD-03家系为CHD4基因变异导致的Sifrim-Hitz-Weiss综合征;CHD-04家系为GDF1基因变异导致的右心房异构疾病;CHD-05家系为TBX5基因变异导致的Holt-Oram综合征。(2)检出的2个明确的致病变异及5个可疑致病变异丰富了CHD的致病基因变异谱,为这类存在CHD临床表型的家系遗传咨询及产前诊断提供了指导思路,为再发风险判断提供了重要依据。(3)Mingene技术在转录水平鉴定出TBX5基因c.663+1G>C新剪接位点变异导致异常剪接,使基因无法正常转录,进而可能影响转录因子TBX5蛋白的结构和功能。实验丰富了对TBX5基因c.663+1G>C的致病性研究,为该变异导致CHD-05家系罹患Holt-Oram综合征提供了实验依据。

关键词：先天性心脏病基因变异剪接位点变异 minigene技术

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一例中国西部Alport综合症家系及其COL4A5基因新发突变的研究

一例中国西部Alport综合症家系及其COL4A5基因新发突变的研究

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作者：牛琛皓甘肃中医药大学

学位级别：硕士

研究目的:对1例Alport综合征确诊患儿及其家系通过二代基因测序技术(NGS)技术进行COL4A5基因测序,在发现COL4A5突变基因并在cinvar、HGMD及COL4A5突变数据库Pumbed数据库中检索,并未发现有报道。对COL4A5中新发突变应用minigene法,研究... 详细信息

研究目的:对1例Alport综合征确诊患儿及其家系通过二代基因测序技术(NGS)技术进行COL4A5基因测序,在发现COL4A5突变基因并在cinvar、HGMD及COL4A5突变数据库Pumbed数据库中检索,并未发现有报道。对COL4A5中新发突变应用minigene法,研究其遗传学意义。丰富AS综合征COL4A5基因突变数据库,解释这一新发突变的遗传学意义。研究方法:对1个Alport综合征家系其中10名成员详细采集病史、一代测序、家系遗传图谱绘制、二代测序技术基因测序并分析;并构建Mini-COL4A5基因,于HEK293T细胞转染构建的Mini-COL4A5基因质粒(Mini-COL4A5-WT/MiniCOL4A5-Mut)、荧光对照质粒(FG12);Trizol提取RNA,进行RT-PCR及电泳;Mini-COL4A5-WT组及Mini-COL4A5-Mut组RT-PCR产物T克隆测序。研究结果:先证者所在家系阳性样本中均发现COL4A5基因上的剪接突变:NM00495:c.1588-2A>G。COL4A5基因突变:NM00495:c.1588-2A>G分布于该家系先证者:半合子突变、先证者之母:移码杂合、突变先证者之舅之女:移码杂合突变、先证者之外婆:移码杂合突变、先证者之舅:半合子突变。NM00495:c.1588-2A>G突变为COL4A5基因第1588号碱基上游紧邻的内含子序列(即23号内含子)中的倒数第2个碱基由A突变为G。通过MutationTaster软件预测该变异会影响蛋白功能。Mini-COL4A5-WT组RT-PCR产物一代测序与COL4A5的minigene序列完全匹配,与COL4A5的CDS蛋白质编码区(EXON23-EXON24-EXON25)完全匹配;Mini-COL4A5-Mut组RT-PCR产物一代测序与COL4A5的minigene序列在COL4A5基因外显子24(EXON24)的的5’端少10bp,与COL4A5的CDS蛋白质编码区(EXON23-EXON24-EXON25)对比在COL4A5基因外显子24(EXON24)的的5’端出现缺失;Mini-COL4A5-Mut组RT-PCR产物T克隆测序7个T克隆产物中4个是外显子24(EXON24)的5’端缺失10bp,1个是外显子24(EXON24)的5’端缺失76bp,2个为外显子24(EXON24)跳跃。研究结论:***4A5基因突变:NM00495:c.1588-2A>G(COL4A5基因第1588号碱基上游紧邻的内含子序列即23号内含子中的倒数第2个碱基由A突变为G)在先证者所在家系中遗传方式符合Alport syndrome综合征X连锁显性遗传模式。***4A5基因突变:NM00495:c.1588-2A>G在clinvar、HGMD、COL4A5突变数据库及Pumbed数据库中检索“COL4A5"AND"c.1588-2A>G"也未发现有报道。COL4A5基因突变:NM00495:c.1588-2A>G为新发突变。3.根据ACMG遗传变异分类标准与指南将此突变归类为疑似致病变异。***4A5基因突变:NM00495:c.1588-2A>G发生后,野生型的剪接位点供位(SD)没有发生变化,但野生型的剪接位点受位(SA)发生改变,会使后续的翻译产生移码突变和直接跳跃EXON24。

关键词： Alport综合征 COL4A5 二代测序技术 minigene技术

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