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miRNA介导植物-微生物互作中的调控作用及其研究进展

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生物工程学报 2022年第5期38卷 1695-1705页

作者：吕晓曼张文艺张海花梁宗锁陈海敏浙江理工大学生命科学与医药学院浙江杭州310018

微生物与植物之间存在错综复杂的双向交流和串扰,植物与病原微生物互作直接影响寄主植物的生存状况,而植物和益生微生物互作则有利于宿主的生长和健康,共生微生物也会从中受益。不管是病原微生物还是有益微生物进入植物体内,植物miRNA... 详细信息

微生物与植物之间存在错综复杂的双向交流和串扰,植物与病原微生物互作直接影响寄主植物的生存状况,而植物和益生微生物互作则有利于宿主的生长和健康,共生微生物也会从中受益。不管是病原微生物还是有益微生物进入植物体内,植物miRNA都会迅速做出响应,同时微生物也可以产生miRNA样RNA(miRNA-likeRNA,milrna)影响植物健康,可见miRNA(或milrna)是植物与微生物互作过程中迅速响应的重要媒介分子,其内在机制研究近年来取得了许多进展。文中概述了植物-病原微生物、植物-益生微生物互作中miRNA的调控作用,重点阐述了植物miRNA在植物-病原微生物互作过程中对寄主植物抗病性的调控作用和植物-益生微生物互作过程中对宿主植物生长发育及代谢的调控,以及真菌milrna对寄主植物的跨界调控作用。

关键词：植物-微生物互作 miRNA milrna 跨界调控

Identification of microRNA-like RNAs in Ophiocordyceps sinensis

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Science China(Life Sciences) 2019年第3期62卷 349-356页

作者： Wen Zhang Xiaona Li Lina Ma Uzair Urrehman Xilinqiqige Bao Yujing Zhang Chen-Yu Zhang Dongxia Hou Zhen Zhou State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology Jiangsu Engineering Research Center for microRNA Biology and Biotechnology NJU Advanced Institute for Life Sciences (NAILS) School of Life Sciences Nanjing University The Drug Laboratory of Mongolian Medicine and Pharmacy Institute Inner Mongolia International Mongolian Hospital

Ophiocordyceps sinensis is well known as a traditional Chinese medicine and has widely been used for over 2,000 years to stimulate immune system, decrease blood pressure and to inhibit tumor growth. While miRNAs are increasingly recognized for their roles in post-transcriptional regulation of gene expression in animals and plants, miRNAs in fungi were less studied until the discovery of microRNA-like RNA(milrna). High-throughput sequencing and bioinformatics approaches were used to identify conserved and novel milrnas in O. sinensis. 40 conserved milrnas were identified, while 23 pre-miRNA candidates encoding 31 novel milrnas were predicted. Furthermore, the potential target genes of milrnas in human were predicted and gene ontology analysis was applied to these genes. Enrichment analysis of GO-represented biological process showed that target genes of both conserved and novel milrnas are involved in development, metabolic and immune processes, indicating the potential roles of milrnas of O. sinensis in pharmacological effects as health food and traditional Chinese medicine. This study is the first report on genome-wide analysis of milrnas in O. sinensis and it provides a useful resource to further study the potential roles of milrnas as active components of O. sinensis in health food or traditional Chinese medicine.

关键词： Ophiocordyceps sinensis O.sinensis miRNA milrna high-throughput sequencing

棘孢木霉DQ-1 Tri-milR535跨界靶向番茄Chit4逃避寄主免疫反应的调控机理研究

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棘孢木霉DQ-1 Tri-milR535跨界靶向番茄Chit4逃避寄主免疫反应的...

作者：薛鸣海南大学

学位级别：硕士

木霉(Trichoderma spp.)是一种重要的生防真菌,在自然界中分布广泛。木霉菌可在植物根际土壤中存活,也可以定殖于植物根系表面和质外体,通过释放生物活性分子与与植物建立一个互作共生关系,促进植物根系对营养物质的吸收,诱导植物产生... 详细信息

木霉(Trichoderma spp.)是一种重要的生防真菌,在自然界中分布广泛。木霉菌可在植物根际土壤中存活,也可以定殖于植物根系表面和质外体,通过释放生物活性分子与与植物建立一个互作共生关系,促进植物根系对营养物质的吸收,诱导植物产生抗病性。本实验室前期通过高通量测序技术,筛选出一些在木霉-番茄互作过程中高丰度表达的mi RNA-like-RNA(milrna),并从中获得一个可能跨界靶向番茄几丁质酶基因的特异表达的Tri-milR535。本文采用基因功能研究技术和显微观察等技术研究Tri-milR535靶向番茄几丁质酶基因逃避宿主免疫反应的分子机制,其具体结果如下:1.为了研究Tri-milR535表达和靶基因,通过实时荧光定量技术,选取11种不同的植物和微生物种类,明确了Tri-milR535只在棘孢木霉DQ-1特异表达,在其它物种不存在该小RNA表达,并且在木霉-番茄互作的早期阶段开始上调表达,在互作24小时表达量最高,然后开始下调表达;进一步通过生物信息学预测该小RNA靶向番茄的几丁质酶基因Chit4,采用q RT-PCR技术证实Chit4与Tri-milR535在木霉-番茄互作过程中的表达呈现负相关;进一步通过烟草共表达技术表明Tri-milR535可以抑制Chit4基因表达;利用5’-RLM RACE技术明确了Tri-milR535可以与Chit4结合位点的第6/7位碱基进行剪切,这些结果表明Tri-milR535可以靶向Chit4抑制该基因的表达,并且受时间精细调控。2.为了研究Tri-milR535生物学功能,通过同源重组、过表达以及短串联靶标技术(STTM)获得棘孢木霉DQ-1 Tri-milR535敲除、过表达和沉默突变体;采用荧光显微观察和木霉生物量的检测发现,与野生型相比,敲除突变体和沉默突变株在番茄根部的定殖能力明显减弱,而过表达突变体在番茄根部的定殖能力则明显增强,这可能与Tri-milR535的过表达抑制了番茄Chit4的表达,有利于木霉菌的定殖。以上结果表明Tri-milR535通过靶向抑制Chit4的表达,提高了棘孢木霉DQ-1在番茄根部的定殖。3.通过生物信息学分析了Chit4与内几丁质酶家族间的遗传进化关系,发现Chit4分别与番茄CHI3、CHI9和拟南芥的At＿CHI52、At＿CHI61基因存在高度的相似性,推测该基因可能与At＿CHI52、At＿CHI61有相似的功能,属于抗病相关蛋白(PR)。进一步通过Chit4原核表达,发现该蛋白在15μM、10μM、5μM、1μM的浓度下均可抑制棘孢木霉DQ-1的孢子萌发,并且抑制效果随着蛋白质浓度的升高而变强,表明Chit4具有抑菌作用。4.为了进一步研究Chit4基因功能,利用Crispr-Cas9基因编辑技术获得Chit4敲除株系,与野生型相比,发现敲除突变体的抗病性减弱,并且有利于棘孢木霉DQ-1在番茄根部定殖。然而,Chit4过表达突变株与野生型相比,其番茄根部胼胝质积累增多,抗病性增强,并发现棘孢木霉DQ-1在过表达株系定殖速度下降且定殖量显著减少。以上结果表明Chit4属于抗病相关蛋白,可以抑制棘孢木霉DQ-1的菌丝生长和在番茄根部定殖。综合以上结果,表明木霉产生特异性的Tri-milR535,可以跨界靶向番茄几丁质酶基因Chit4逃避宿主免疫反应。

关键词： milrna 互作几丁质酶逃避寄主免疫跨界靶向

苹果树腐烂病菌Dicer2依赖的small RNAs鉴定及Vm-milrna6调控病菌致病的机理分析

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苹果树腐烂病菌Dicer2依赖的small RNAs鉴定及Vm-milRNA6调控病菌...

作者：郭斐然西北农林科技大学

学位级别：硕士

苹果在我国果业中占有重要地位,其产业关乎区域经济增长和果农的脱贫致富。然而由黑腐皮壳属真菌Valsa mali侵染引起的苹果树腐烂病却严重影响我国苹果产业的健康可持续发展。加快解析病菌致病机理对针对性防控策略的制定和病害的持久... 详细信息

苹果在我国果业中占有重要地位,其产业关乎区域经济增长和果农的脱贫致富。然而由黑腐皮壳属真菌Valsa mali侵染引起的苹果树腐烂病却严重影响我国苹果产业的健康可持续发展。加快解析病菌致病机理对针对性防控策略的制定和病害的持久有效控制具有重要意义。近年研究表明,milrnas在病原菌对植物的侵染过程中起着关键作用,但苹果树腐烂病菌milrnas在转录后水平调控病菌与寄主互作的机理尚未明确。前期研究发现苹果树腐烂病菌存在RNAi通路关键蛋白,且在病菌的致病过程中发挥重要作用,特别是Dicer2缺失以后,病菌的致病力显著降低。为此,本研究利用small RNA测序技术、降解组测序技术、基因敲除及烟草共转化等试验分析了差异sRNAs,鉴定了milrnas靶基因,并且明确了milrna与靶基因的调控关系,进而对两者进行功能分析。研究结果为全面揭示milrnas调控苹果树腐烂病菌致病机理奠定了重要基础。主要结果如下:1、分别构建了苹果树腐烂病菌菌丝体(MVm)与Dicer2突变体菌丝体(MD2)sRNA文库。去掉垃圾序列后,在MVm和MD2中分别分析获得sRNAs有效序列1023889条和593982条。分析发现,VmDCL2的缺失也会对siRNAs的生成产生显著影响,进而发现在MVm和MD2中milrnas的表达存在显著差异。利用降解组深度测序技术,构建了苹果树腐烂病菌菌丝体(TMVm)与Dicer2突变体菌丝体降解组库(TMD2),共筛选获得11个Dicer2依赖的milrnas对应的靶标基因。2、对Vm-milrna6的前体序列进行敲除,共获得4个敲除突变体(△6-1-22、△6-1-27、△6-2-18和△6-2-25)。对野生型菌株和敲除突变体进行观察比较,发现其菌落均表现为白色,近圆形,但敲除突变体的菌落直径显著减小,致病力显著增强。根据降解组测序、功能注释及生物信息学分析,鉴定VPS10为Vm-milrna6的关键候选靶基因。进而将Vm-milrna6前体和靶基因VPS10共转化入烟草叶片中结果显示,VPS10单独注射的烟草叶片,在细胞膜上观察到明显的绿色荧光;当Vm-milrna6前体和VPS10共表达时,绿色荧光显著减少,说明Vm-milrna6对VPS10确实有靶向切割作用,Western Blot进一步证实共转化之后GFP的表达量显著降低。由此表明Vm-milrna6与靶基因VPS10存在调控关系。进而对VPS10进行敲除,共获得2个敲除突变体(△2-2-37和△2-2-44)。敲除突变体菌株与野生型菌株相比,菌落形态一致,但菌落直径显著减小,致病力显著降低。

关键词：苹果树腐烂病菌测序基因敲除 milrna 致病力分析

里氏木霉中milrna的表达干预及其对纤维素酶表达的调控研究

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里氏木霉中milRNA的表达干预及其对纤维素酶表达的调控研究

作者：阮土娣深圳大学

学位级别：硕士

里氏木霉(Trichoderma reesei)是重要的纤维素酶产生菌,也是用于研究丝状真菌纤维素酶合成调控机制的常用菌株,其中的纤维素酶合成调控机理已获得了较充分的认识。Micro RNA(miRNA)广泛存在于各种生物中,能够与靶mRNA特异性结合对基因... 详细信息

里氏木霉(Trichoderma reesei)是重要的纤维素酶产生菌,也是用于研究丝状真菌纤维素酶合成调控机制的常用菌株,其中的纤维素酶合成调控机理已获得了较充分的认识。Micro RNA(miRNA)广泛存在于各种生物中,能够与靶mRNA特异性结合对基因表达进行调控。近年来,与miRNA结构相似的小分子RNA(micro RNA-like RNA,milrna),在多种真菌中通过高通量测序分析后被鉴定,如粗糙脉胞菌、核盘菌、黑僵菌以及里氏木酶等。然而,关于里氏木酶miRNA或milrnas研究的报道较少。本研究以课题组前期对里氏木酶高通量测序得到的13个milrnas为基础,根据milrnas在诱导和非诱导条件下的表达水平,选取了4个里氏木酶QM9414的milRN A进行功能研究。根据已获得的milrna序列信息,设计milrna的Tough Decoy(TuD)序列以及PCR扩增过表达序列,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析;并利用里氏木酶强组成型启动子Ppdc构建milrna抑制表达载体和过表达载体,将载体转入里氏木酶进行原生质体转化后表达。筛选构建成功的重组菌培养于纤维素酶诱导培养基,利用荧光定量PCR检测milrna、酶基因cbh1、egl1的表达水平,测定滤纸酶活(FPA)以及羧甲基纤维素酶活(CMCA),探讨milrna是否调控纤维素酶的表达,分析milrna与纤维素酶表达调控的相关功能关系。再将调控效果明显的milrna重组菌进行培养基碳氮源组分的优化培养,测定纤维素酶调控因子cre1、xyr1的表达量以及滤纸酶活,进一步提高重组菌株的纤维素酶活。研究结果表明,milR4、milR9参与了纤维素酶的表达调控。荧光定量PCR数据显示,抑制表达的菌株milrna表达水平降低,说明TuD序列发挥了抑制作用;过表达菌株milrna表达水平提高,说明成功扩增了milrna的前体序列。酶活测定结果显示,各个菌株在诱导培养120 h后达到最高值。其中,过表达菌株P-milR4酶活是原始菌株的0.919倍,并有下降的趋势;抑制表达菌株TuD4酶活有一定提高,是原始菌株的1.228倍,milR4参与了纤维素酶表达的正调控。抑制表达菌株TuD9酶活是原始菌株的0.946倍,过表达菌株P-milR9酶活提高明显,是原始菌株的1.349倍,milR9参与了纤维素酶表达的负调控。对纤维素酶产酶培养基进行优化后,得到一株产酶量相对较高的重组菌P-milR9,其酶活为原始菌株的1.454倍。本工作通过构建TuD抑制表达载体和过表达载体得到的小分子RNA:milR4和milR9能显著改变T.reesei纤维素酶酶活;并通过优化培养基进一步提高了重组菌株P-milR9的纤维素酶活。本工作为研究里氏木霉中的小分子RNA调控机制提供了新认识,并为进一步提高T.reesei纤维素酶酶活提供新的方法。

关键词：里氏木霉 milrna 过表达 TuD 纤维素酶

香蕉枯萎病菌milrna合成相关基因QDE2功能研究

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香蕉枯萎病菌milRNA合成相关基因QDE2功能研究

作者：林漪莲华南农业大学

学位级别：硕士

由尖孢镰刀菌古巴专化型[Fusarium oxysporum f.***.cubense（E.F.Smith）Snyder et Hansen]引起的香蕉枯萎病是严重制约香蕉生产的毁灭性病害。milrna（microRNA-like）在真菌的生长发育过程中起到了重要的调控作用。有关其生物合成及... 详细信息

由尖孢镰刀菌古巴专化型[Fusarium oxysporum f.***.cubense（E.F.Smith）Snyder et Hansen]引起的香蕉枯萎病是严重制约香蕉生产的毁灭性病害。milrna（microRNA-like）在真菌的生长发育过程中起到了重要的调控作用。有关其生物合成及作用机制通路中的重要组分如Dicer酶、Argonaute（AGO）蛋白等的功能在粗糙脉孢菌和禾谷镰刀菌等真菌中有研究报道,但在香蕉枯萎病菌中这些通路中相关蛋白的功能尚不明确。为探究香蕉枯萎病菌milrna生物合成及作用通路中重要蛋白的合成基因的功能,本论文以前期研究中筛选得到的Dicer蛋白合成基因DCL1和DCL2的敲除突变体?DCL1-1和?DCL2-1以及AGO蛋白合成基因QDE2的敲除突变体?QDE2-6为研究对象,研究分析了DCL1、DCL2、QDE2基因在香蕉枯萎病菌中与致病相关表型及milrna合成与积累,并通过基因回补获得QDE2基因互补转化子HB?QDE2-21及HB?QDE2-47,进一步对QDE2基因的功能进行了验证,主要结果如下:1.对可能参与milrna生物合成与作用通路中的三个基因敲除突变体的表型分析发现,突变体?QDE2-6在菌落形态、生长、产孢、孢子的耐热性、对过氧化氢的敏感性、对长波和短波光照的敏感性以及致病力等表型上均与野生型菌株XJZ2存在显著差异;milrna的qRT-PCR结果显示,QDE2基因敲除突变体中检测的大部分milrnas表达量显著下降。而通路中另外两个基因敲除突变体与野生型相比,除?DCL1-1的孢子耐热性和致病力有轻微下降外,其他表型变化不显著。2.通过构建Argonaute蛋白的系统发育树,分析了AGO蛋白在不同真菌间的系统进化关系。在大部分的真菌中,都有两个AGO蛋白,少数真菌有3-5个AGO蛋白;香蕉枯萎病菌的QDE2与粗糙脉孢菌QDE2、禾谷镰刀菌的FgAgo1以及来自稻瘟病菌的AGO蛋白聚在一个分支上,说明他们具有相同的起源;而尖孢镰刀菌自身的AGO蛋白极为紧密的聚集在一起,说明种内进化较为一致。3.为进一步研究QDE2在香蕉枯萎病菌中的具体功能,我们构建了QDE2基因互补载体,运用PEG介导的转化法,成功获得QDE2基因互补突变体HB?QDE2-21及HB?QDE2-47。通过对QDE2基因敲除突变体和互补转化子的表型分析,结果发现与QDE2基因敲除突变体相比,互补转化子HB?QDE2-21及HB?QDE2-47的气生菌丝增多,产孢量有所增加,对过氧化物的抗性增强,致病力明显增强,可见QDE2基因回补后,突变体的表型能够恢复或部分恢复至野生型的表型,说明在香蕉枯萎病菌中QDE2具有影响生长、产孢和致病力的功能。4.在实验室前期研究基础上,根据预测的milrnas设计特定的检测引物,对目标milrnas的表达量进行检测。结果显示在突变体?DCL1-1、?DCL2-1和?QDE2-6中均有部分milrnas的表达量显著下降,进一步对QDE2基因互补转化子HB?QDE2-21及HB?QDE2-47中目标milrnas的表达量检测发现,原本在QDE2基因敲除突变体中表达显著下降的milrnas,在互补转化子中的表达量基本恢复至野生型的水平,表明这部分milrnas是依赖于QDE2基因产生的。上述结果表明,香蕉枯萎病菌QDE2基因除了可以参与部分milrnas的合成外,还影响病原菌的生长、产孢以及对寄主香蕉的致病力。

关键词：香蕉枯萎病菌 QDE2基因 milrna

生防木霉菌筛选及其诱导番茄抗灰霉病分析与milrna的鉴定

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生防木霉菌筛选及其诱导番茄抗灰霉病分析与milRNA的鉴定

作者：崔佳黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的在番茄上危害常见且严重的一种病害。目前对灰霉病的防治方法仍以化学药剂为主,因此导致病原菌抗药性增强,同时农药的使用也对环境、人类及动物健康带来潜在风险。开发和利用微生物制... 详细信息

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的在番茄上危害常见且严重的一种病害。目前对灰霉病的防治方法仍以化学药剂为主,因此导致病原菌抗药性增强,同时农药的使用也对环境、人类及动物健康带来潜在风险。开发和利用微生物制剂和生物农药是进行绿色防治的有效方法,也是提升农产品质量的重要手段。因此,本研究以筛选优势生防木霉菌为基础,研究木霉菌诱导番茄的抗病分子机理及其互作过程中木霉菌milrna的鉴定,为下一步探究木霉菌milrna跨界调控番茄抗灰霉病菌的分子机理奠定基础。其主要研究结果如下:1.以实验室分离获得的23株木霉菌为材料,采用浸种、灌根处理,评价了木霉菌对番茄种子萌发、根系生长的影响,其中DQ-1、HN2325-2、HN2108-4、HL119四株木霉菌明显促进种子萌发与根系伸长。DQ-1效果最为明显,种子萌发率较对照提高6.64%;根长较对照增长37.86%。通过对峙平板培养,比较了这些木霉菌菌株对灰霉病菌的抑制效果,结果发现DQ-1对灰霉病菌的抑菌率高达88.41%。棘孢木霉DQ-1可作为防治番茄灰霉病的潜在生防菌株。2.棘孢木霉DQ-1灌根处理番茄后,可减轻叶片灰霉病的发生,表明棘孢木霉DQ-1可能诱导番茄的抗病性。通过荧光定量PCR技术检测根灌棘孢木霉DQ-1后,番茄根部和叶部的抗病基因(PR2、TPX)和茉莉酸乙烯信号通路基因(ETR1、CTR1、LOX1、PAL)表达情况。结果显示番茄根部的PR2和LOX1、TPX和ETR1、PAL分别在6h、12h和24h时达到最高表达水平,CTR1在6h下调表达至最低。在番茄叶片中ETR1、PR2和PAL、LOX1分别在12h、24h、48h达到表达最高值,CTR1在24h下调表达至最低,TPX在番茄叶部表达量无明显变化,表明棘孢木霉DQ-1灌根处理可以诱导番茄根和叶部的抗病基因以及茉莉酸乙烯信号通路基因的表达。3.根灌棘孢木霉DQ-1 24h后,挑战接种番茄灰霉病菌,结果发现番茄根部PR2、TPX、ETR1在接种后24h达到表达峰值,LOX1、PAL在12h达到表达峰值,CTR1在24h下调表达至最低。番茄叶片中PR2、ETR1、LOX1、PAL均在24h达到表达高峰,TPX在12h达到表达高峰,CTR1在12h下调表达至最低。结果显示棘孢木霉DQ-1处理番茄后,在挑战接种灰霉病菌条件下,同样可以提高番茄根部和叶部的抗病基因以及茉莉酸乙烯信号通路基因的表达,提高了番茄对灰霉病的抗性。4.为检测棘孢木霉DQ-1中是否存在milrna参与诱导番茄抗病性。通过高通量测序技术,构建棘孢木霉DQ-1与番茄互作过程中DQ-1的miRNA测序文库,筛选和鉴定了相关的milrna表达水平。结果鉴定出126个已知milrna,预测得到21个新的milrna。其中Tri-milR947-y、Tri-milR008-5p在木霉菌与番茄根部互作24h时达到表达量峰值,TrimilR5215-y在互作12h时下调表达至最低点、Tri-milR7122-x、Tri-milR001-3p在互作时12h达到表达高峰,Tri-milR004-3p在互作中表达量未显著变化,暗示milrna Tri-milR947-y、Tri-milR008-5p、Tri-milR5215-y、Tri-milR7122-x、Tri-milR001-3p可能涉及到木霉菌诱导番茄抗病、抑菌和促生等方面的调控。

关键词：番茄灰霉病棘孢木霉诱导抗病性高通量测序 milrna

家蚕微孢子虫milrna-8的鉴定和功能研究

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家蚕微孢子虫milRNA-8的鉴定和功能研究

作者：郑宁西南大学

学位级别：硕士

miRNA是一类长度约为21-23 nt的调控性小分子RNA,具有高度的保守性、时序性和组织特异性,在生物生长发育、分化和疾病等方面都发挥重要作用。目前,在真菌内发现了类似miRNA的真菌小RNA（MicroRNA-likeRNA,milrnas）。milrnas可通过调控... 详细信息

miRNA是一类长度约为21-23 nt的调控性小分子RNA,具有高度的保守性、时序性和组织特异性,在生物生长发育、分化和疾病等方面都发挥重要作用。目前,在真菌内发现了类似miRNA的真菌小RNA（MicroRNA-likeRNA,milrnas）。milrnas可通过调控病原菌与寄主内相关基因的表达,从而在真菌的发育、致病和宿主的免疫等过程中发挥重要作用。微孢子虫（Microsporidia）是一类专性细胞内寄生的真菌类病原微生物,能够广泛的感染无脊椎动物和脊椎动物。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis,N.b）是第一个被发现的微孢子虫,可作为微孢子虫的代表种,其引发的家蚕微粒子病严重威胁着蚕业生产的可持续发展,由于其独特的致病机理,也可作为研究寄生类真菌的模式生物。通过对家蚕微孢子虫milrna及其功能的研究,可为家蚕微孢子虫milrna的研究奠定基础,也为解析家蚕微孢子虫的侵染机制和病害防控提供参考。鉴于此,我们通过深度测序预测了家蚕微孢子虫milrnas,对milrna-8的表达特征和功能进行了研究,并通过预测milrna的靶基因,初步解析了milrna-8调控家蚕微孢子虫的增殖机制。论文取得的研究结果如下:1.家蚕微孢子虫milrnas的预测和分析为了预测家蚕微孢子虫的milrnas,本研究通过荧光显微镜观察和q PCR检测对家蚕微孢子虫的生活史进行分析,结果显示家蚕微孢子虫在48 h的裂殖增殖期时,尚未形成完整的孢壳,是微孢子虫milrnas最丰富的时期,故选择48 h的家蚕微孢子虫进行milrna测序。通过milrna测序对得到的家蚕微孢子虫sRNAs进行长度筛选、基因组比对和milrnas二级结构分析,共预测到的11个家蚕微孢子milrnas。采用stem-loop q RT-PCR对其表达量进行验证,结果显示有10个milrnas的表达水平与测序预测趋势一致,均在微孢子虫感染后特异高表达。以上研究结果表明,在家蚕微孢子虫48 h裂殖增殖期预测的10个milrnas较为可靠,可进行后续研究。2.家蚕微孢子虫milrna-8的鉴定和功能分析为了分析家蚕微孢子虫milrnas的功能,本研究成功构建7个milrnas过表达载体,在细胞水平转染后,利用q PCR检测家蚕微孢子虫的拷贝数,结果显示milrna-4、milrna-8、milrna-10和milrna-12对N.b的增殖有促进作用,milrna-1、milrna-3和milrna-11对N.b的增殖有抑制作用,其中milrna-8对N.b的促进作用最显著,故以milrna-8为研究对象进行后续研究。为分析milrna-8的表达特征进行,我们通过stem-loop q RT-PCR对milrna-8的表达水平进行分析,结果表明家蚕细胞感染N.b后,milrna-8的表达量呈上升趋势;进一步对milrna-8设计特异的荧光探针,采用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）发现,milrna-8在微孢子虫的孢原质和宿主的细胞质内表达。为进一步探究milrna-8的功能,在细胞水平添加milrna-8 inhibitor后,通过q PCR检测家蚕微孢子虫的拷贝数,结果显示N.b的增殖受到了抑制。以上研究表明,milrna-8对N.b的增殖有重要的调控作用。3.家蚕微孢子虫milrna-8靶基因的筛选与鉴定为进一步探究milrna-8对N.b增殖的调控机制,我们对milrna-8在宿主内的靶基因进行预测,共预测到569个候选基因,选取其中表达水平的差异倍数≥2的64个候选基因进行研究。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and genomes,KEGG）分析发现这些基因主要富集于新陈代谢类、神经活性受体--配体类和过氧化物酶体通路。此外,利用q RT-PCR对候选基因的表达水平进行检测,发现过表达milrna-8后,家蚕过氧化物酶膜蛋白基因16（Bombyx mori peroxisomal membrane protein 16,BmPEX16）的表达水平受到显著抑制。基于以上对候选基因的功能和表达水平的分析,我们选择了其中涉及过氧化物酶体生物形成的BmPEX16进行深入研究。为了验证milrna-8与BmPEX16的结合作用,除对结合位点进行分析外,利用双荧光素酶报告实验检测发现,将BmPEX16 3’UTR部分序列与milrna-8过表达载体共转后,实验组荧光素酶活性降低。为了分析BmPEX16的基因特征,通过序列比对分析,发现BmPEX16与鳞翅目类、双翅目类具有较高的序列保守性;q RT-PCR检测发现,其在大造5龄3天（5L3D）的血液和中肠高表达,同时,在细胞水平上感染N.b后,发现其表达水平呈下降趋势。为进一步研究milrna-8对BmPEX16的调控作用

关键词：家蚕家蚕微孢子虫 milrna milrna-8 BmPEX16

香蕉枯萎病菌mi1R138靶标基因的鉴定与功能研究

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香蕉枯萎病菌mi1R138靶标基因的鉴定与功能研究