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伤寒沙门菌mig-14基因表达特性研究

伤寒沙门菌mig-14基因表达特性研究

作者：陈龙江苏大学

学位级别：硕士

目的:mig-14是沙门菌属通过水平转移获得的外来毒力基因,其产物蛋白mig-14在沙门菌属拮抗多粘菌素B杀伤的过程中扮演着重要的角色。并且作为一种调节因子,mig-14可调控多种基因表达。但是,对于mig-14的表达机制与特性仍然未明。本研究... 详细信息

目的:mig-14是沙门菌属通过水平转移获得的外来毒力基因,其产物蛋白mig-14在沙门菌属拮抗多粘菌素B杀伤的过程中扮演着重要的角色。并且作为一种调节因子,mig-14可调控多种基因表达。但是,对于mig-14的表达机制与特性仍然未明。本研究旨在探索不同环境中伤寒沙门菌中mig-14基因的表达特性。方法:1.伤寒沙门菌缺失变异株的制备使用自杀质粒法,利用同源重组的原理,分别制备伤寒沙门菌调节因子Hil D、Him A、Him D、Ydg T、Hha、HNS的缺失变异株,Fis及Omp R缺失变异株由实验室保存。2.q RT-PCR分析mig-14转录水平采用实时定量PCR技术,观察伤寒沙门菌野生株及各缺陷变异株中mig-14基因的转录水平。普通LB(Luria-Bertani培养基)培养条件下,比较伤寒沙门菌野生株及ydg T、hha、hns缺失变异株中mig-14基因的转录水平,从而判断mig-14作为伤寒沙门菌水平转移获得的外来基因,其转录是否被沉默蛋白(Ydg T、Hha、HNS)抑制;多粘菌素B(polymyxin,PB)刺激条件下,比较伤寒沙门菌野生株及hil D、him A、him D、fis、omp R缺失变异株中mig-14的转录水平,从而判断mig-14在PB存在的情况下,其转录是否由调节因子Hild、Him A、Him D、Fis、Omp R激活。*** blot免疫印迹法检测mig-14表达水平实验室存有mig-14兔多克隆抗体,收集伤寒沙门菌及各缺失变异株全菌蛋白,以mig-14兔多克隆抗体进行Western blot免疫印迹实验从而分析mig-14在各菌株中的表达情况。***融合实验构建mig-14启动子区域的lacZ基因融合质粒pHRP309。PCR扩增mig-14启动子区域,与含β-半乳糖苷酶基因(lac Z)的质粒载体p HRP309连接构建mig-14启动子-lac Z融合质粒。将融合质粒导入伤寒沙门菌野生株和各缺失变异株中,细菌胞内的β-半乳糖苷酶活性即可表示mig-14的转录表达水平。裂解细菌,收集上清,测定β-半乳糖苷酶活性,以Miller Units表示。5.蛋白表达及纯化利用大肠杆菌BL21系统,分别表达纯化沉默蛋白HNS以及宿主整合因子IHF的α亚基Him A,以进一步分析调节因子对mig-14的调控作用。6.凝胶阻滞实验(EMSA)通过体外凝胶阻滞实验(EMSA)分析调节因子HNS、Him A对mig-14表达的调节机制。7.分析IHF、mig-14对iagA的影响构建伤寒沙门菌的himA/mig-14双基因缺失变异株,构建him A和mig-14的p BAD33异源表达载体,双缺失变异株分别回补him A和mig-14后,观察高渗早期iag A基因的转录情况。结果:1.伤寒沙门菌基因缺失变异株的制备成功制备伤寒沙门菌hil D、him A、him D、hha及ydg T的缺失变异株,并经序列鉴定分析验证;伤寒沙门菌hns的缺失变异株构建失败,遂通过构建伤寒沙门菌hns高表达株反向分析HNS对mig-14的抑制。2.普通LB培养条件下沉默蛋白抑制mig-14转录利用实时定量PCR(q RT-PCR)比较伤寒沙门菌野生株及hha、ydg T缺失变异株及hns高表达株中的mig-14的转录水平。结果显示hha、ydg T缺失变异株中mig-14转录水平明显高于伤寒沙门菌野生株,且缺失了hha后mig-14转录水平上升明显高于ydg T缺失变异株。另外,伤寒沙门菌GIFU10007的hns基因无法敲除,故通过构建hns高表达菌株来反映HNS对mig-14的抑制作用。结果显示,伤寒沙门菌hns高表达菌株的mig-14转录水平明显低于野生株。这表明,沉默蛋白HNS、Hha、Ydg T抑制外来基因mig-14的转录表达。***刺激下野生株及各缺失变异株中mig-14转录水平PB可刺激mig-14表达。实时定量PCR及lac Z融合实验结果均显示:在PB刺激下,伤寒沙门菌的hil D、him A、him D、fis、omp R缺失变异株同野生株相比,mig-14转录表达水平均明显下降。结果表明,在PB刺激下,伤寒沙门菌调节因子Hil D、Fis、IHF(Him A/Him D)、Omp R均参与激活mig-14。*** blot免疫印迹法检测mig-14表达水平利用实验室前期工作制备的mig-14兔多克隆抗体,检测各菌株中mig-14表达水平。结果发现伤寒沙门菌mig-14缺失变异株及野生株在目的条带处(mig-14大小约36.5 KD)无明显差异条带,故认为mig-14兔多克隆抗体失效。5.成功表达伤寒沙门菌HNS蛋白及IHF的α亚基Him A成功构建p E

关键词：伤寒沙门菌 mig-14 多粘菌素B 水平转移基因调控

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伤寒沙门菌mig-14基因功能研究

伤寒沙门菌mig-14基因功能研究

作者：夏秋风江苏大学

学位级别：硕士

目的mig-14是伤寒沙门菌的一种内膜结合蛋白,在高渗应激时期表达显著增高,蛋白结构分析提示它可能为一种调节蛋白。本研究目的是揭示伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对基因表达的调节作用。方法1.用自杀质粒介导的同源重组方法,制备伤寒... 详细信息

目的mig-14是伤寒沙门菌的一种内膜结合蛋白,在高渗应激时期表达显著增高,蛋白结构分析提示它可能为一种调节蛋白。本研究目的是揭示伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对基因表达的调节作用。方法1.用自杀质粒介导的同源重组方法,制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株。根据伤寒沙门菌mig-14基因序列,设计PCR特异性引物,并在引物5'末端加上需要的酶切位点。扩增mig-14基因上、下游DNA片段,用BglⅡ消化后,定向连接成mlg-14基因的缺损性同源性核苷酸片段。将此片段胶回收后克隆至自杀质粒pGMB151的BamH I位点,再将经酶切和特异性PCR鉴定的阳性重组自杀质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株,用蔗糖诱导同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为mig-14基因缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确证。2.利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,在体外模拟高渗应激环境,向在低渗培养基中培养至对数生长期的菌液中加入NaCl,使其浓度从50 mM增加到300 mM。在高渗应激早期(30min)分别提取伤寒沙门菌野生株和mig-14基因缺陷变异株总RNA,反转录成cDNA并加标荧光(cy3或cy5),与基因组芯片进行杂交,扫描分析,比较伤寒沙门菌野生株和mig-14基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异,并选择部分差异表达基因利用实时荧光定量RT-PCR验证,以分析mig-14在高渗应激下对基因表达的调节作用。3.在中性和酸性条件下对mig-14缺陷株、phoP缺陷株和野生株做多粘菌素B杀伤实验,以确证在*** GIFU10007野生株中mig-14是否能拮抗多粘菌素B的杀伤作用。结果1.成功制备伤寒沙门菌mig-14缺陷株,经PCR及序列分析证实,mig-14变异株中mig-14基因的编码区有390个碱基缺失,且没有发生极性突变。2.基因表达谱比较分析结果表明,在高渗应激早期mig-14变异株与野生株相比有77个基因表达下调和72个基因表达上调,其中包括鞭毛蛋白、侵袭蛋白、外膜蛋白、代谢酶类以及一些未知功能的蛋白。选取其中部份差异表达基因cydA、invF、pagP和treC,利用实时荧光定量RT-PCR进行验证,结果显示所选基因的mRNA水平与基因芯片分析的结果情况一致。3.在中性培养基条件下,多粘菌素B对三种菌株的杀伤效果基本相同。在酸性条件下mig-14缺陷株确实对多粘菌素B的敏感性比野生株稍高,但敏感程度比phoP缺陷株低很多。结论伤寒沙门菌mig-14为一种内膜结合的调节蛋白,在高渗应激早期主要参与调节鞭毛装配过程以及细菌的物质和能量代谢。

关键词：伤寒沙门菌 mig-14 高渗应激基因芯片基因表达调节

伤寒沙门菌mig-14抵抗多粘菌素B杀伤机制研究

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伤寒沙门菌Mig-14抵抗多粘菌素B杀伤机制研究

作者：汪伟伟江苏大学

学位级别：硕士

目的:mig-14是沙门菌属水平转移获得的毒力基因,在沙门菌入侵宿主和抵抗多粘菌素B(简称PB)的杀伤作用等方面有着重要作用,但其具体作用机制尚不明确。本论文旨在研究mig-14参与伤寒沙门菌抵抗PB杀伤的分子机制。方法:(1)多粘菌素B作用下... 详细信息

目的:mig-14是沙门菌属水平转移获得的毒力基因,在沙门菌入侵宿主和抵抗多粘菌素B(简称PB)的杀伤作用等方面有着重要作用,但其具体作用机制尚不明确。本论文旨在研究mig-14参与伤寒沙门菌抵抗PB杀伤的分子机制。方法:(1)多粘菌素B作用下mig-14基因表达谱分析体外普通LB中加入PB致终浓度为0.1μg/ml,分别培养伤寒沙门菌野生株(WT)和mig-14基因缺陷变异株(△mig-14)5 h(37oC,250 r/min)后,提取WT和△mig-14的总RNA,反转录成c DNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较WT和△mig-14在PB作用下的基因表达谱差异;选择部分差异表达基因进行荧光实时定量RT-PCR分析,验证DNA芯片分析结果。(2)WT与△mig-14的Omp C::3×Flag,Omp F::3×Flag标签融合菌株制备采用自杀质粒p GMB151介导的同源片段重组方法,在伤寒沙门菌WT与△mig-14的omp C、omp F基因的终止密码子前分别插入3×Flag标签,制备WT-Omp C::3×Flag、WT-Omp F::3×Flag标签变异菌株,△mig-14-Omp C::3×Flag、△mig-14-Omp F::3×Flag标签变异菌株。(3)Western Blot免疫印迹法检测WT和△mig-14中Omp F和Omp C的表达量PB刺激条件下培养WT-Omp C::3×Flag、WT-Omp F::3×Flag标签变异菌株与△mig-14-Omp C::3×Flag、△mig-14-Omp F::3×Flag标签变异菌株,收集全菌蛋白,以抗Flag单克隆抗体进行Western Blot免疫印迹分析WT与△mig-14变异株孔道蛋白Omp C、Omp F表达的差异。(4)基因缺陷变异株的制备采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌各基因缺陷变异株。根据***的omp C基因碱基序列,设计相应引物,并在5′末端加上Bam H I的特异性酶切位点。扩增omp C基因片段,利用粘性末端特性连接成omp C基因的不完全同源性核苷酸片段。胶回收后热击入***,筛选阳性质粒,然后电转导入伤寒沙门菌野生株WT、omp F缺陷株(简称△omp F)(实验室保存)、mig-14缺陷株(简称△mig-14)(实验室保存),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将相应完全重组的菌株作为omp C基因的缺陷变异株、omp C/omp F、mig-14/omp C双缺陷变异株(分别简称△omp C,△omp C/omp F、△mig-14/omp C)。将本实验室保存的含omp F同源缺失片段的阳性质粒电转至△mig-14和△mig-14/omp C,进行同源重组,制备mig-14/omp F及mig-14/omp C/omp F三缺陷变异株(分别简称为△mig-14/omp F、△mig-14/omp C/omp F),并通过PCR及序列分析鉴定技术加以确定。(5)各菌株抵抗PB杀伤能力分析以横坐标为培养时间,OD600吸光度值为纵坐标绘制生长曲线,对比各个基因缺陷变异株与野生株在PB杀伤作用下的生存情况。(6)mig-14对生物膜形成能力的影响把野生株、△mig-14、△mig-14(空p BAD)、△mig-14回补株分别培养至OD6000.6后取等量的菌放置96孔板30oC静置培养3天后,甲醇30分钟固定,结晶紫对生物膜染色,用乙酸溶解后酶标仪测定OD570紫外吸收值,紫外吸收值代表生物膜生成量,比较伤寒沙门菌WT与△mig-14生物膜生成能力。结果:(1)PB刺激下mig-14基因表达谱分析基因表达谱比较分析结果表明,与野生株相比伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株在PB刺激5小时后,有768个基因表现出明显的表达差异。其中,鞭毛相关基因、外膜孔道蛋白相关基因omp C、omp F表达上调、侵袭和毒力相关基因表达下调。RT-PCR验证结果显示,与基于DNA芯片的基因表达谱分析数据相比,两者变化情况趋势一致。(2)WT与△mig-14的Omp C::3×Flag,Omp F::3×Flag标签融合菌株制备经PCR及序列分析证实成功在伤寒沙门菌WT与△mig-14缺陷株的omp C、omp F基因终止密码子前插入3×Flag标签,成功制备WT-Omp C::3×Flag,WT-Omp F::3×Flag融合标签变异株以及△mig-14-Omp C::3×Flag,△mig-14-Omp F::3×Flag融合标签变异株。(3)Western Blot免疫印迹法分析WT和△mig-14中Omp F和Omp C的表达差异Western-bo

关键词：伤寒沙门菌 mig-14 PB 基因芯片 Omp F Omp C 生物膜

mig-14对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的调节

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江苏大学学报（医学版） 2009年第3期19卷 192-196页

作者：夏秋风邹昕杜鸿高宇琳黄新祥江苏大学基础医学与医学技术学院生物化学系江苏镇江212013

目的:探查伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对若干基因表达的调节作用。方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株,用基因芯片分析高渗应激早期野生株和mig-14缺陷株基因表达差异,并对部分结果采用实时荧光定... 详细信息

目的:探查伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对若干基因表达的调节作用。方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株,用基因芯片分析高渗应激早期野生株和mig-14缺陷株基因表达差异,并对部分结果采用实时荧光定量PCR进行验证。结果:成功制备伤寒沙门菌mig-14缺陷株,高渗应激早期mig-14变异株与野生株相比有77个基因表达下调和72个基因表达上调。结论:mig-14可能是一种调节基因,主要参与调节细菌的物质和能量代谢。

关键词：伤寒沙门菌 mig-14 高渗应激基因芯片分析

伤寒沙门菌virK和mig-14基因在拮抗多黏菌素B杀伤作用中的差异

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江苏大学学报（医学版） 2012年第4期22卷 295-298页

作者：夏秋风生秀梅徐顺高黄新祥江苏大学附属医院检验科江苏镇江212001 江苏大学基础医学与医学技术学院江苏镇江212013

目的:比较伤寒沙门菌virK和mig-14基因在拮抗多黏菌素B杀伤作用中的差异,探讨两者在拮抗多黏菌素B杀伤作用中的关系。方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌virK缺陷变异株和virK/mig-14双缺陷变异株,在弱酸性环境下对缺陷... 详细信息

目的:比较伤寒沙门菌virK和mig-14基因在拮抗多黏菌素B杀伤作用中的差异,探讨两者在拮抗多黏菌素B杀伤作用中的关系。方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌virK缺陷变异株和virK/mig-14双缺陷变异株,在弱酸性环境下对缺陷菌株做多黏菌素B杀伤试验,比较mig-14缺陷株、virK缺陷株和virK/mig-14双缺陷株对多黏菌素B的耐受情况。结果:成功制备伤寒沙门菌virK缺陷变异株和virK/mig-14双缺陷变异株,在弱酸性环境下mig-14缺陷株、virK缺陷株和virK/mig-14双缺陷株对多黏菌素B的耐受情况基本一致。结论:virK在伤寒沙门菌GIFU10007中也发挥对多黏菌素B的拮抗作用,与mig-14对多黏菌素B的拮抗作用有相似效果。

关键词：伤寒沙门菌 virK mig-14 多黏菌素B

多黏菌素B刺激下伤寒沙门菌mig-14基因的表达特性

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江苏大学学报（医学版） 2017年第3期27卷 243-247页

作者：陈龙杨璐璐李敏殷灵莉徐顺高黄新祥生秀梅江苏大学医学院江苏镇江212013

目的:研究多黏菌素B(polymyxin,PB)刺激下,伤寒沙门菌mig-14基因的表达是否受调节因子Fis、OmpR、IHF、HilD激活。方法:用自杀质粒法分别制备hilD及IHF的α亚基编码基因(himA)和β亚基编码基因(himD)的缺陷株;然后通过实时定量PCR和lac... 详细信息

目的:研究多黏菌素B(polymyxin,PB)刺激下,伤寒沙门菌mig-14基因的表达是否受调节因子Fis、OmpR、IHF、HilD激活。方法:用自杀质粒法分别制备hilD及IHF的α亚基编码基因(himA)和β亚基编码基因(himD)的缺陷株;然后通过实时定量PCR和lacZ融合实验比较PB刺激下mig-14在伤寒沙门菌各缺陷株(himA、himD、hilD、fis、ompR)与野生株中的转录水平差异,筛选出作用于mig-14的调控因子。结果:成功制备伤寒沙门菌himA、himD及hilD缺陷株;在多黏菌素B刺激下,实时定量PCR结果显示fis、ompR、himA、himD及hilD缺陷株中mig-14 mRNA水平明显低于野生株;lac Z融合实验中,fis、ompR、himA、himD及hilD缺陷株Miller Units值明显低于野生株。结论:在多黏菌素B刺激下,调节因子Fis、OmpR、IHF、HilD可激活伤寒沙门菌mig-14表达。

关键词：伤寒沙门菌多黏菌素B mig-14 基因调控