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mirna-1/mirna-133在大鼠高位脊髓损伤早期心肌细胞凋亡中的作用

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miRNA-1/miRNA-133在大鼠高位脊髓损伤早期心肌细胞凋亡中的作用

作者：廖烨福建医科大学

学位级别：硕士

目的观察mirna-1、mirna-133在大鼠高位脊髓损伤(SCI)早期心肌中的变化,初步探讨mirna-1、mirna-133在高位脊髓损伤后早期心肌细胞凋亡中扮演的角色并研究它是否是高位脊髓损伤后大鼠心肌损伤或者保护的机制之一。方法1.清洁级健康雄性S... 详细信息

目的观察mirna-1、mirna-133在大鼠高位脊髓损伤(SCI)早期心肌中的变化,初步探讨mirna-1、mirna-133在高位脊髓损伤后早期心肌细胞凋亡中扮演的角色并研究它是否是高位脊髓损伤后大鼠心肌损伤或者保护的机制之一。方法1.清洁级健康雄性SD大鼠,8-10周龄,体重250-300 g,共42只,随机分为7组(每组n=6):空白组(CK组)、假手术组(Sham组)、高位SCI后4 h组(SCI 1组)、高位SCI后12 h组(SCI 2组)、高位SCI后24 h组(SCI 3组)、高位SCI后36 h组(SCI 4组)以及SCI后48 h组(SCI 5组);2.采用改良的Allens打击法,建立高位SCI大鼠模型,Sham组仅暴露脊髓,术后观察大鼠的表现并记录,用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法评估大鼠运动功能,标本选取同一部位的心肌组织;3.在透射电镜下观察各组大鼠心肌细胞的超微结构;***法检测各组大鼠心肌细胞的凋亡情况;***-PCR技术测定各组大鼠心肌组织mirna-1、mirna-133表达的变化;***-blot法测定各组大鼠心肌组织HSP 60、Bcl-2、Bax和Caspase-9的含量变化。结果***组大鼠术后四肢活动功能正常,与术前相比未见明显变化,BBB评分均为21分,与CK组相比无明显差异(P>0.05)。SCI各组术中打击处变灰暗,术后活动和进食显著减少,双下肢呈弛缓性瘫痪,且BBB评分均趋近于0,与Sham组相比,差异显著(P0.05);与Sham组相比,SCI 3组、SCI 4组、SCI 5组心肌细胞凋亡率均升高,差异显著(Pmirna-1、mirna-133表达量与CK组相比无明显差异(P>0.05)。与Sham组相比,SCI 2组、SCI 5组mirna-1相对表达量升高;SCI 1组、SCI 2组、SCI 3组mirna-133相对表达量升高,差异显著(P0.05)。与Sham组相比,SCI 1组、SCI 2组、SCI 3组、SCI 4组心肌组织中HSP60表达量降低,SCI 1组、SCI 2组、SCI 3组心肌组织中Bcl-2表达量降低,而SCI 1组、SCI 2组、SCI 3组心肌组织中Bax表达量及Caspase-9表达量均升高,差异显著(Pmirna-1、mirna-133表达增加,mirna-1可能作用于HSP60,促进Bcl-2减少以及Bax增加,进而促进细胞凋亡,这可能是导致高位脊髓损伤后大鼠心肌损伤机制,而mirna-133表达增加则可能是高位脊髓损伤后早期心肌代偿保护机制。

关键词：高位脊髓损伤心肌损伤细胞凋亡 mirna-1 mirna-133

mirna-1和mirna-133在鸭骨骼肌发育中的表达及功能初步研究

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miRNA-1和miRNA-133在鸭骨骼肌发育中的表达及功能初步研究

作者：吴宁昭扬州大学

学位级别：硕士

microRNAs(mirnas)是一类非编码RNA,短单链,长度约22 bp,且在进化过程中高度保守。mirnas在单细胞和多细胞生物中广泛存在,在转录后水平对基因表达进行调控。现有研究表明mirna-1和mirna-133来源于同一对双顺反子(Bicistronic pairs),... 详细信息

microRNAs(mirnas)是一类非编码RNA,短单链,长度约22 bp,且在进化过程中高度保守。mirnas在单细胞和多细胞生物中广泛存在,在转录后水平对基因表达进行调控。现有研究表明mirna-1和mirna-133来源于同一对双顺反子(Bicistronic pairs),并对骨骼肌的发生发育有重要的调控作用,而关于鸭mirna-1和mirna-133对骨骼肌发育的研究还尚未见有报道。本实验以体型大小不同的樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)作为实验对象,通过实时荧光定量技术构建鸭mirna-1和mirna-133的组织表达谱和发育性表达谱;并通过转染mirna的模拟物或抑制物,采用双荧光素酶报告基因系统对鸭mirna-1和mirna-133的功能进行初步探讨,以了解其在鸭骨骼肌发育中的调控作用。主要研究结果如下:1.为探明樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)的肌肉生长发育与肌纤维发育规律,分别对38、42、45、49、56等不同日龄胸肌重、腿肌重、肌纤维面积等表型进行了测定。结果显示,樱桃谷鸭42日龄胸肌重达205 g,腿肌重达238 g,其肌纤维面积分别是5835 μm2和12406μm2,而莆田黑鸭(白羽系)42日龄胸肌重仅为129g,腿肌重175g,其肌纤维面积分别是926 μm2和4089 μm2,表明樱桃谷鸭与莆田黑鸭(白羽系)在胸肌、腿肌发育和肌纤维发育等方面差异显著。2.为构建鸭mirna-1和mirna-133的组织表达谱和发育性表达谱,本文通过实时荧光定量检测樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)的mirna-1和mirna-133表达量。检测结果显示,mirna-1和mirna-133在心肌、胸肌和腿肌等肌肉中呈特异性表达。同时检测胚胎期和早期生长发育过程中的肌肉组织mirna的表达量,发现鸭胸肌和腿肌mirna-1和mirna-133的表达呈现出类似的变化趋势,即在胚胎期后期mirna表达急剧上升,而在整个生长发育期mirna的表达基本恒定。樱桃谷鸭中表达量分别在胚胎期28天和生长期42天达到峰值,且在这两个时间点,樱桃谷鸭的表达量显著高于莆田黑鸭(Pmirna-1和mirna-133对骨骼肌发育的作用,将mirna-1 mimic或inhibitor和mirna-133 mimic或inhibitor转染至鸭成肌细胞,实时荧光定量检测结果显示,mirna mimic或inhibitor可有效促进或抑制其表达;且过表达mirna-1可促进相邻成肌细胞相互融合,而过表达mirna-133细胞融合现象很少;CCK-8细胞增殖检测结果表明,降低mirna-1表达可促进成肌细胞增殖,而降低mirna-133则可抑制成肌细胞增殖;成肌细胞分化标记标志基因表达检测结果显示,转染mirna-1 mimic,分化标记标志基因MEF2d、Myod表达量显著地上升,而转染mirna-133 inhibitor,MEF2d、Myod基因的表达量显著地上升。以上结果充分说明mirna-1可促进鸭成肌细胞分化,mirna-133可促进成肌细胞增殖。4.为进一步阐明mirna-1和mirna-133在鸭骨骼肌发育中的作用机制,通过文献检索和生物信息学预测,确定mirna-1和mirna-133的候选靶基因。实时荧光定量检测转染mirna的模拟物和抑制物之后候选靶基因的表达量,结果显示mirna-1可显著降低其候选靶基因HDAC4的表达(Pmirna-133也可降低其候选靶基因SRF、TGFBR1的表达(Pmirna-1可抑制pGL-Basic-HDAC4荧光素酶报告基因活性;而mirna-133并未降低pGL-Basic-SRF,pGL-Basic-TGFBR1荧光表达强度。因此,鸭mirna-1可通过靶向HDAC4促进鸭成肌细胞分化;而mirna-133可影响SRF、TGFBR1的表达,并促进鸭成肌细胞增殖。

关键词：鸭 mirna-1 mirna-133 骨骼肌增殖分化

真武汤对心肾阳虚CHF大鼠mirna-1、mirna-133调控细胞凋亡的影响

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真武汤对心肾阳虚CHF大鼠miRNA-1、miRNA-133调控细胞凋亡的影响

作者：杨婷湖南中医药大学

学位级别：硕士

目的:研究真武汤是否通过影响心肾阳虚CHF大鼠mirna-1、mirna-133的表达调控心肌细胞凋亡。方法:SD大鼠50只,随机分为3组(假手术组10只,模型组20只,真武汤组20只),雌雄各半,模型组、真武汤组大鼠,分离双侧甲状腺并切除,术后10天,各鼠腹... 详细信息

目的:研究真武汤是否通过影响心肾阳虚CHF大鼠mirna-1、mirna-133的表达调控心肌细胞凋亡。方法:SD大鼠50只,随机分为3组(假手术组10只,模型组20只,真武汤组20只),雌雄各半,模型组、真武汤组大鼠,分离双侧甲状腺并切除,术后10天,各鼠腹腔注射阿霉素2mg/kg体重(用注射用水配置成2mg/ml,即0.1ml/100g体重),每周2次,共3周;假手术组大鼠,切开皮肤、剥离肌肉,暴露甲状腺,然后缝合肌肉、皮肤,术后10天,各鼠腹腔注射生理盐水0.1ml/100g体重,每2次,共3周。造模结束后,真武汤组予以真武汤汤剂灌胃(相当饮片量4.26g/(kg·d),每天1次,共8周;假手术组、模型组予以等剂量生理盐水灌胃,每天1次,共8周。治疗结束后,检测大鼠心功能、血流动力学,取材行HE染色观察心肌细胞;TUNEL法计算心肌细胞凋亡率;Real-time PCR法检测左心室 mirna-1、mirna-133 的表达;免疫组化法检测 Caspase-3、Caspase-9蛋白表达。结果:(1)真武汤能改善心肾阳虚CHF大鼠的心功能,提高LVEF、LVFS值;(2)真武汤能改善心肾阳虚CHF大鼠的血流动力学,下调LVEDP,升高LVAP、±dp/dtmax;(3)真武汤能改善心肾阳虚CHF大鼠心肌细胞的形体结构;(4)真武汤能降低心肾阳虚CHF大鼠心肌组织凋亡率;(5)真武汤对心肾阳虚CHF大鼠心肌细胞中mirna-1、mirna-133、caspase-3、caspase-9的表达无明显影响。结论:真武汤可以抑制心肾阳虚CHF大鼠心肌细胞凋亡,改善其心功能及血流动力学,但并未通过影响心肌细胞中mirna-1、mirna-133的表达调控心肌细胞凋亡,其相关作用机制还待进一步研究。

关键词：真武汤心肾阳虚心衰心肌细胞凋亡 mirna-1 mirna-133

不同猪品种肌肉组织mirna-1和mirna-133基因的表达分析

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不同猪品种肌肉组织miRNA-1和miRNA-133基因的表达分析

作者：周莲莲吉林大学

学位级别：硕士

MicroRNAs(mirnas)是一类长约205个碱基的小分子非编码RNA,可通过引发靶mRNA降解或/和翻译抑制来介导转录后的基因沉默。microRNA作为一种真核生物体内的重要的调节因子,近年来在动物和植物中被广泛的研究。 mirna-1和mirna-133在人、... 详细信息

MicroRNAs(mirnas)是一类长约205个碱基的小分子非编码RNA,可通过引发靶mRNA降解或/和翻译抑制来介导转录后的基因沉默。microRNA作为一种真核生物体内的重要的调节因子,近年来在动物和植物中被广泛的研究。 mirna-1和mirna-133在人、小鼠等骨骼肌细胞分化成熟过程中表达呈现一定的时空特异性,在骨骼肌中,mirna-1以HDAC4为靶点促进肌发生(myogenesis),而mirna-133通过抑制血清反应因子(serum response factor,SRF)而提高成肌细胞的增殖速度,这表明二者在调节骨骼肌增殖与分化过程中扮演了十分重要的角色。本实验依据人和鼠等动物的mirna-1和mirna-133的成熟序列,根据mirna高度保守性的特点,设计了特定的RT引物和PCR引物,采用PCR方法获得正确的序列,构建TA质粒载体,确定了猪的mirna-1和mirna-133成熟序列与人、鼠一致。建立了一个特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快的实时定量荧光RT-PCR方法,研究了mirna-1和mirna-133在猪背最长肌组织中的表达情况,对不同品种的成熟猪的背最长肌组织中mirna-1和mirna-133的表达进行检测,通过测定三个品种猪的mirna-1在背最长肌中的表达量,结果显示,mirna-1在长白猪的2-△CT平均值是1.5216±0.3846,蓝塘猪的2-△CT平均值是7.2453±0.5975,大花白猪的2-△CT平均值1.1391±0.1713,这些数值说明,mirna-1在蓝塘猪中的表达量最高,达到7.2453±0.5975,是长白猪表达量的4.7倍,大花白猪的6.4倍,因此蓝塘猪与长白猪和大花白猪表达有极显著的差异(Pmirna-1表达量差异不显著(P>0.05)。对mirna-133在背最长肌中的表达结果分析显示,mirna-133在蓝塘猪中的表达量同样是最高,达到1.6989±0.2086,蓝塘猪与长白猪mirna-133表达量差异是不明显的(长白猪的2-△CT平均值是1.3416±0.1042)(P>0.05),蓝塘猪与长白猪与大花白猪表达量(0.2337±0.0358)差异极显著(Pmirna-133的表达量分别是大花白猪的7.2倍和5.7倍。因此蓝塘猪和长白猪与大花白猪表达有极显著的差异(Pmirna-133表达量差异不显著(P>0.05)。

关键词：荧光定量PCR 猪肌肉发育 mirna-1 mirna-133 表达分析

成纤维细胞源外泌体mirna-133可促进成纤维细胞成心肌分化

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成纤维细胞源外泌体miRNA-133可促进成纤维细胞成心肌分化

作者：许亚平新乡医学院

学位级别：硕士

背景外泌体是一种纳米级别的生物膜结构,其中包含蛋白质、mirna、细胞因子受体等多种生物活性物质,mirna可在转录水平调节基因的表达,来调控细胞的增殖和凋亡,外泌体源性的mirna目前发现具有生物学特性,参与很多疾病的生理病理过程,有... 详细信息

背景外泌体是一种纳米级别的生物膜结构,其中包含蛋白质、mirna、细胞因子受体等多种生物活性物质,mirna可在转录水平调节基因的表达,来调控细胞的增殖和凋亡,外泌体源性的mirna目前发现具有生物学特性,参与很多疾病的生理病理过程,有望成为疾病的分子诊断标志物。外泌体中的mirna-133是否可促进心肌分化迄今并未见报道。目的探讨心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)分泌的外泌体mirna-133对成纤维细胞成心肌分化的作用。方法1.体外培养新生大鼠心脏成纤维细胞,利用免疫荧光技术和透射电镜技术对成纤维细胞及其外泌体进行鉴定。2.将培养的细胞分为3组:(1)诱导组(Control group,CONT);(2)mirna-133高表达组(mirna-133转染,mirna-133 high expression group,mirna-133H);(3)mirna-133抑制组(mirna-133抑制剂转染,mirna-133 inhibitor group,mirna-133I)。3.以慢病毒为载体,将mirna-133转染CFs,mirna-133inhibitor转染CFs,分别于转染后3d、8d、14d用Western Blotting、免疫荧光染色、real-time qPCR检测心肌细胞的标记物心肌肌钙蛋白(cardiac troponin T,cTnT)和心肌肌动蛋白(cardiac actin,α-actin)的表达,real-time qPCR检测成纤维细胞外泌体中mirna-133的表达量。结果1.免疫荧光染色显示体外培养的CFs表达成纤维细胞的标记物vimentin和DDR2。***分泌的外泌体为3000nm的小囊泡,外泌体囊泡表达外泌体特异性蛋白CD63和CD9。3.与诱导组相比,mirna-133高表达组在不同时间段cTNT,α-actin和分泌到上清中的外泌体mirna-133表达量逐渐升高,14d达到最高,mirna-133抑制组最低。结论心肌成纤维细胞来源的外泌体mirna-133能促进成纤维细胞成心肌分化。

关键词： mirna-133 cTNT α-actin 外泌体心脏成纤维细胞心肌细胞

mirna-133与高血压左心室肥厚的相关性及预测价值

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中华临床医师杂志（电子版） 2016年第8期10卷 51-55页

作者：黄雨晴余雪菊李捷周颖玲陈纪言冯颖青广东省心血管病研究所心内科广东省人民医院广东省医学科学院广州510080

目的先前国内外实验研究均表明mirna-133 可通过调控RhoA 蛋白、细胞分化周期蛋白-42、参与心脏发生的核因子基因和结缔组织生长因子的表达而影响高血压左心室肥厚,但是上述实验并没有在临床上验证mirna-133 对高血压左心室肥厚的预测... 详细信息

目的先前国内外实验研究均表明mirna-133 可通过调控RhoA 蛋白、细胞分化周期蛋白-42、参与心脏发生的核因子基因和结缔组织生长因子的表达而影响高血压左心室肥厚,但是上述实验并没有在临床上验证mirna-133 对高血压左心室肥厚的预测价值,因此本研究旨在验证mirna-133 对高血压左心室肥厚的预测价值.方法收集未服用降压药物且发生左心室肥厚的单纯高血压患者和年龄性别相匹配的正常人外周血浆-80 ℃保存,采用RT-PCR 技术验证差异表达mirna 的稳定性;组间比较用t 检验,采用受试者工作特征（ROC）曲线验证mirna-133 对高血压左心室肥厚的预测价值.结果 66 例高血压左心室肥厚和33 例正常人入选,血压和左心室质量指数有统计学差异（P〈0.05）,而年龄、血脂等基线资料无统计学差异（P〉0.05）;RT-PCR 结果显示mirna-133 在正常人和高血压左心室肥厚组相对表达量分别为0.04±0.005、0.30±0.44,差异有统计学意义（P〈0.05）;调整年龄、性别和体质量指数后,mirna-133 表达水平与左心室肥厚具有相关性（ORs=1.654,95% CI 1.273～2.146,P〈0.05）;mirna-133 对高血压心肌肥厚预测的ROC曲线下面积（AUC）为0.860（P=0.000）,95% CI 0.786～0.934（P〈0.05）.结论 mirna-133 对高血压左心室肥厚有较好的预测价值.

关键词：高血压肥大,左心室微RNAs mirna-133

体外反搏治疗对急性心肌梗死患者血浆mirna-133水平的影响

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现代中西医结合杂志 2016年第1期25卷 25-27页

作者：黄颖赵春丽韦永强广西壮族自治区民族医院广西南宁530001

目的观察急性心肌梗死患者血浆mirna-133(miR-133)表达情况和体外反搏治疗(ECP)对其水平的影响。方法将60例急性心肌梗死经皮冠状动脉介入(PCI)术后患者随机分为治疗组和对照组各30例,并选择同期门诊健康体检者30例作为空白组。所有受... 详细信息

目的观察急性心肌梗死患者血浆mirna-133(miR-133)表达情况和体外反搏治疗(ECP)对其水平的影响。方法将60例急性心肌梗死经皮冠状动脉介入(PCI)术后患者随机分为治疗组和对照组各30例,并选择同期门诊健康体检者30例作为空白组。所有受试者均于入院时抽血,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血浆miR-133水平。治疗组和对照组给予常规冠心病二级预防药物治疗,治疗组在PCI术后第3周加用ECP,1 h/(次·d),每周5次,为期7周;2组均于治疗9周后分别测定患者血浆miR-133表达水平,评估心绞痛症状改善情况,同时观察超声心动图心功能各项指标变化情况。结果与空白组比较,治疗组急性心肌梗死患者血浆miR-133表达水平明显升高(P133含量明显低于对照组(P133水平可作为急性心肌梗死患者发病和病情进展的一项新型标志物;ECP治疗可降低急性心肌梗死患者血浆miR-133表达水平,明显改善患者心功能。

关键词：体外反搏 mirna-133 急性心肌梗死

慢性心衰大鼠心肌mirna-1、mirna-133/Caspases表达差异研究

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湖南中医药大学学报 2017年第12期37卷 1326-1330页

作者：刘蓉芳谭雄张辉毛湘屏杨柳陈志成毛以林湖南中医药大学湖南长沙410208 湖南中医药大学第二附属医院湖南长沙410005

目的探讨慢性心衰大鼠心肌mirna-1、mirna-133/Caspases表达差异。方法 30只SD大鼠随机分为正常组10只,模型组20只。正常组等容量生理盐水腹腔注射,模型组予阿霉素腹腔注射造模;采用心脏彩超检测心功能,采用生理记录仪记录血流动力学,... 详细信息

目的探讨慢性心衰大鼠心肌mirna-1、mirna-133/Caspases表达差异。方法 30只SD大鼠随机分为正常组10只,模型组20只。正常组等容量生理盐水腹腔注射,模型组予阿霉素腹腔注射造模;采用心脏彩超检测心功能,采用生理记录仪记录血流动力学,心脏切片行Tunel染色检测细胞凋亡,采用Real-time PCR法检测mirna-1、mirna-133、Caspase-3mRNA、Caspase-9mRNA表达;采用Western blot及免疫组化法检测心肌组织Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平。结果与正常组比,模型组大鼠左室舒张期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVESD)、左心室终末舒张压(LVEDP)明显增大(Pmirna-1、Caspase-3mRNA、Caspase-9mRNA、Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白表达增加(Pmirna-133表达下降(Pmirna-1、Caspase-3、Caspase-9在心肌凋亡中表达增加,mirna-133表达下降。

关键词：慢性心衰心肌凋亡 mirna-1 mirna-133 Caspase-3 Caspase-9

mirna-1和mirna-133过表达对诱导性多能干细胞心肌分化的影响

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中国医药导报 2018年第31期15卷 4-7,15页

作者：王芳芳白宝宝曾迪楚轶李雪中国人民解放军空军军医大学第二附属医院心内科陕西西安710038

目的探讨mirna-1和mirna-133过表达对诱导性多能干细胞(iPSC)心肌分化的影响。方法取2周龄美国国家癌症研究所(ICR)孕鼠的胚胎,0.5 g/L胰酶消化接种,传至3代后采用丝裂霉素进行处理,37℃孵育培养小鼠诱导性多能干细胞(miPSC),将生长于... 详细信息

目的探讨mirna-1和mirna-133过表达对诱导性多能干细胞(iPSC)心肌分化的影响。方法取2周龄美国国家癌症研究所(ICR)孕鼠的胚胎,0.5 g/L胰酶消化接种,传至3代后采用丝裂霉素进行处理,37℃孵育培养小鼠诱导性多能干细胞(miPSC),将生长于胚胎成纤维细胞上的miPSC消化传代;更换培养基,加入对照mirna (U6)(10 nmol/L,记为对照组),mirna-1 (10 nmol/L,记为mirna-1组)、mirna-133 (10 nmol/L,记为mirna-133组)、mirna-1和mirna-133(分别为10 nmol/L,记为mirna-1+133组)转染24 h后PBS洗涤,加入miPSC分化培养基,观察每日变化并计算细胞搏动率以表示分化效率。RT-PCR检测mirna-1、mirna-133及心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达。结果未分化的miPSC中较少表达cTnT,与分化0 d时比较,分化5 d后mirna-1组及mirna-133组内cTnT的表达水平明显升高(P mirna-1+133组cTnT表达水平较mirna-1组及mirna-133组更高(P mirna-1组及mirna-133组细胞搏动率无变化(P> 0.05),但mirna-1+133组搏动率显著提升(P mirna-1或mirna-133对心肌的分化无促进作用,共表达mirna-1、mirna-133可显著提高miPSC向心肌细胞定向分化的效率。

关键词：过表达诱导性多能干细胞心肌分化 mirna-1 mirna-133