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Microarray-based identification of tomato microRNAs and time course analysis of their response to Cucumber mosaic virus infection

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Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology) 2011年第2期12卷 116-125页

作者： Qiu-lei LANG Xiao-chuan ZHOU Xiao-lin ZHANG Rafal DRABEK Zhi-xiang ZUO Yong-liang REN Tong-bin LI Ji-shuang CHEN Xiao-lian GAO College of Life Sciences Zhejiang University Hangzhou 310058 China Institute of Bioengineering Zhejiang Sci- Tech University Hangzhou 310018 China LC Sciences 2575 W. Bellfort Suite 270 Houston ZY 77054 USA Department of Biology and Biochemistry University of Houston Houston TX 77004 USA

A large number of plant microRNAs (mirnas) are now documented in the miRBase, among which only 30 are for Solanum lycopersicum (tomato). Clearly, there is a far-reaching need to identify and profile the expression of mirnas in this important crop under various physiological and pathological conditions. In this study, we used an in situ synthesized custom microarray of plant mirnas to examine the expression and temporal presence of mirnas in the leaves of tomato plants infected with Cucumber mosaic virus (CMV). Following computational sequence homology search and hairpin structure prediction, we identified three novel tomato mirna precursor genes. Our results also show that, in accordance with the phenotype of the developing leaves, the tomato mirnas are differentially expressed at different stages of plant development and that CMV infection can induce or suppress the expression of mirnas as well as up-regulate some star mirnas (mirna*s) which are normally present at much lower levels. The results indicate that developmental anomalies elicited by virus infection may be caused by more complex biological processes.

关键词： Solanum lycopersicum Plant mirna Cucumber mosaic virus mirna array mirna response

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mirna在EV71感染与复制中的作用初步研究

miRNA在EV71感染与复制中的作用初步研究

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作者：夏巨峰复旦大学

学位级别：硕士

手足口病是婴幼儿的常见疾病,病原体以新型肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)最为常见。近来世界各地大范围手足口病的爆发性疫情主要由EV71引起。EV71属小RNA病毒科、人肠道病毒属成员。虽然EV71感染患者大多数症状轻微,... 详细信息

手足口病是婴幼儿的常见疾病,病原体以新型肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)最为常见。近来世界各地大范围手足口病的爆发性疫情主要由EV71引起。EV71属小RNA病毒科、人肠道病毒属成员。虽然EV71感染患者大多数症状轻微,但也有部分患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经性肺水肿和心肌炎等重症症状。重症患儿病情进展快,易导致死亡。鉴于目前并没有针对EV71感染的抗病毒药物,只能对一般患者及重症疑似病例进行跟踪,出现症状对症治疗。因此加强对EV71感染的基础性研究,包括EV71复制的分子生物学特性、影响病毒复制的重要因素等显得十分必要。尽管国内外有关EV71的研究工作取得很大进展,但深入了解EV71病毒复制的关键环节仍然十分迫切。最近研究发现,细胞编码的microRNA(mirna)分子与许多病毒复制关系密切。mirna影响病毒的复制,一方面可通过影响与病毒复制密切相关的关键细胞分子,如免疫应答分子、信号转导蛋白等而调控病毒的复制进程,另外还可能通过直接作用病毒mRNA,调节病毒的复制。由于mirna分子在转录后水平对基因调控具有普遍意义,并且细胞编码的mirna种类众多,同一：niRNA可能有多个潜在靶点,同时单一基因可能受多个mirna分子作用,形成复杂的调控网络。因此推测,EV71感染致病过程极有可能与mirna分子发挥作用相关。所以,我们从mirna对EV71感染后的变化为出发点,结合生物信息学分析,对可能影响EV71感染和复制的mirna分子及其作用靶点进行分析,试图寻找影响EV71致病的关键因素。在本研究中,我们从手足口病患儿粪便中分离了一株EV71病毒并进行了全基因组测序分析。由于EV71病毒形成噬斑形状不规则,难于鉴定。为了准确检测实验中所用病毒的滴度,我们建立了优于常用的蚀斑分析(Plaque assay)的MTT病毒滴度检测法。然后,根据EV71病毒复制生长曲线,我们使用mirna芯片检测了EV71感染细胞后细胞内mirna的表达水平变化,发现了38个mirna分子表达水平比在未感染细胞中表达水平上调2倍以上,35个mirna分子表达水平比在未感染细胞中表达水平下调2倍以上。通过生物信息学分析这些mirna作用的靶基因,发现这些mirna的靶点主要为细胞结构蛋白相关基因和免疫调节相关基因,初步探讨了与EV71感染后细胞中异常表达的基因的关系。此外,我们利用mirna数据库和软件分析可能直接作用于EV71-3’-UTR的mirna分子,通过种子序列匹配和结合自由能阈值设定,共找到了12个可能直接结合到EV71-3’-UTR区域从而影响EV71感染与复制的mirna。通过mirna芯片筛选和软件预测后,将这些可能影响EV71感染和复制的mirna基因克隆入带有报告基因的载体。我们共选取30个芯片筛选得到的mirna和10个软件预测得到的mirna,构建了可能影响EV71感染和复制的微型mirna表达库。之后,为了验证miiRNA抑制EV71感染与复制的能力,我们选择了报告基因表达水平较高的mirna-3620表达载体进行初步测试。将EV71-3’-UTR的报告基因GFP载体与mirna-3620表达载体共转染细胞检测mirna-3620分子是否影响EV71的感染与复制。

关键词： EV71病毒 mirna mirna array mirna library

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