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The mir167-OsARF12 module regulates rice grain filling and grain size downstream of mir159

Plant Communications 2023年第5期4卷 246-262页

作者： Yafan Zhao Xiaofan Zhang Yuan Cheng Xiangxiang Du Sachin Teotia Chunbo Miao Huwei Sun Guoqiang Fan Guiliang Tang Hongwei Xue Quanzhi Zhao Ting Peng Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops Henan Agricultural UniversityZhengzhou 450046China Key Laboratory of Rice Biology in Henan Province Henan Agricultural UniversityZhengzhou 450046China Henan Engineering Laboratory of Rice Henan Agricultural UniversityZhengzhou 450002China Joint Center for Single Cell Biology/School of Agriculture and Biology Shanghai Jiao Tong UniversityShanghai 200240China Department of Biotechnology Sharda UniversityGreater Noida 201306India Institute of Paulownia Henan Agricultural UniversityZhengzhou 450046China Department of Biological Sciences Michigan Technological UniversityHoughtonMI 49931USA College of Agriculture Guizhou UniversityGuiyang 550025China

Grain weight and quality are always determined by grain filling.Plant microRNAs have drawn attention as key targets for regulation of grain size and yield.However,the mechanisms that underlie grain size regulation remain largely unclear because of the complex networks that control this trait.Our earlier studies demonstrated that suppressed expression of mir167(STTM/MIM167)substantially increased grain weight.In a field test,the yield increased up to 12.90%-21.94% because of a significantly enhanced grain filling rate.Here,biochemical and genetic analyses revealed the regulatory effects of mir159 on mir167 expression.Further analysis indicated that OsARF12 is the major mediator by which mir167 regulates rice grain filling.Overexpression of OsARF12 produced grain weight and grain filling phenotypes resembling those of STTM/MIM167 plants.Upon in-depth analysis,we found that OsARF12 activates OsCDKF;2 expression by directly binding to the TGTCGG motif in its promoter region.Flow cytometry analysis of young panicles from OsARF12-overexpressing plants and examination of cell number in cdkf;2 mutants verified that OsARF12 positively regulates grain filling and grain size by targeting OsCDKF;2.Moreover,RNA sequencing results suggested that the mir167-OsARF12 module is involved in the cell development process and hormone pathways.OsARF12-overexpressing plants and cdkf;2 mutants exhibited enhanced and reduced sensitivity to exogenous auxin and brassinosteroid(BR)treatment,confirming that targeting of OsCDKF;2 by OsARF12 mediates auxin and BR signaling.Our results reveal that the mir167-OsARF12 module works downstream of mir159 to regulate rice grain filling and grain size via OsCDKF;2 by controlling cell division and mediating auxin and BR signals.

关键词： rice mir167 OsARF12 OsCDKF 2 grainﬁlling cell cycle

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半夏mir167及其靶基因响应大豆花叶病毒胁迫的表达

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中国生物化学与分子生物学报 2023年第5期39卷 724-733页

作者：王晨燕杜江马振男张丽王德富牛颜冰山西农业大学生命科学学院山西太谷030801 山西农业大学草业学院山西太谷030801

MicroRNAs(mirNAs)是一类小的非编码RNA,在植物逆境及生物胁迫中通过调节靶基因来发挥重要的调控作用。半夏内源mir167是否参与了大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)的胁迫及相互作用关系尚不清楚。本研究利用茎环法扩增半夏内源mi... 详细信息

MicroRNAs(mirNAs)是一类小的非编码RNA,在植物逆境及生物胁迫中通过调节靶基因来发挥重要的调控作用。半夏内源mir167是否参与了大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)的胁迫及相互作用关系尚不清楚。本研究利用茎环法扩增半夏内源mir167基因,命名为pt-mir167,采用生物信息学软件对其进行保守性分析,系统进化性分析及靶基因预测。在此基础上,采用qRT-PCR技术检测病毒积累量、mir167及其潜在的靶基因的表达水平,分析mir167及靶基因响应病毒侵染的表达模式。结果表明,病毒积累量在5~15 d时迅速增加,其中10 d时增加最快,随后呈现缓慢上升趋势。病毒侵染后,pt-mir167相比对照组,表达量呈下调,并且在10 d时表达量最低。进化树分析表明,pt-mir167与番茄(Solanum lycopersicum)中的sly-mir167a聚为一族,高度同源。预测的潜在主要靶基因ARF6表达量与pt-mir167表达量呈现正好相反的趋势,其在10 d时表达量达到最高。本研究表明,mirNA167参与了寄主半夏与病毒SMV的相互作用关系,研究结果有助于揭示SMV与寄主半夏之间的相互作用机制,为今后深入研究病毒与植物提供了参考,为半夏生产提供了研究的基础。

关键词：半夏大豆花叶病毒 mir167 靶基因表达模式

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水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织发育过程中Auxin-mir167-ARF8信号通路的研究

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四川大学学报（自然科学版） 2013年第4期50卷 863-868页

作者：淳俊王文国王胜华陈放四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室成都610064 农业部沼气科学研究所成都610041

采用荧光定量PCR(Real-time PCR),进行mir167及其靶基因ARF8表达水平的相对定量分析,初步得出水稻愈伤组织发育过程中Auxin-mir167-ARF8信号通路的调控情况.发现经过12h～24h的积累,2mg/L的2,4-D能够明显地上调mir167的表达水平,从而导... 详细信息

采用荧光定量PCR(Real-time PCR),进行mir167及其靶基因ARF8表达水平的相对定量分析,初步得出水稻愈伤组织发育过程中Auxin-mir167-ARF8信号通路的调控情况.发现经过12h～24h的积累,2mg/L的2,4-D能够明显地上调mir167的表达水平,从而导致mir167的靶基因ARF8的表达量下降,这种变化在第7天的时候趋于平缓,直到形成愈伤组织,mir167和ARF8的表达量维持在一个相对稳定的水平.本实验为Auxin-mir167-ARF8信号通路的研究提供了切入点.

关键词：水稻愈伤组织 microRNA 2,4-D mir167 ARF8 Real-time PCR

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清见果实发育成熟过程中mir167及其靶基因ARF8的动态表达分析

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分子植物育种 2018年第22期16卷 7264-7269页

作者：罗近予荣毅熊博孙国超廖玲邱霞代琳汪志辉四川农业大学园艺学院成都611130 四川农业大学果蔬研究所成都611130

本研究以晚熟杂柑清见(Kiyomi tangor)为研究材料,测定了其果实发育成熟七个时间点的果肉及叶片中IAA的含量,并通过qRT-PCR分析了mir167及其靶基因ARF8的表达情况。结果,发现清见果肉IAA含量在果实膨大期和转色期出现一个双峰的动态变化... 详细信息

本研究以晚熟杂柑清见(Kiyomi tangor)为研究材料,测定了其果实发育成熟七个时间点的果肉及叶片中IAA的含量,并通过qRT-PCR分析了mir167及其靶基因ARF8的表达情况。结果,发现清见果肉IAA含量在果实膨大期和转色期出现一个双峰的动态变化,叶片中IAA含量在花后180 d上升到达最大值后下降,表明叶片IAA可能在果实转色期向果肉转移,参与果实着色的相关代谢;果肉中ARF8在花后90 d前的表达出现显著上调时mir167以及mir167a/mir167b/mir167c的表达出现显著下调,叶片中ARF8在花后90 d显著下调时mir167以及mir167a/mir167b/mir167c显著上调,表明此时果肉及叶片内mir167以及mir167a/mir167b/mir167c与靶基因ARF8发生了相互抑制作用,此后mir167及mir167a/mir167b/mir167c表达出现变化时ARF8表达量几乎都保持在一个很低的水平,表明这些mirNA可能参与了其他基因的调控。

关键词：清见 mir167 ARF8 果实发育成熟表达分析

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CRISPR/Cas9技术介导mir167前体序列编辑体系的建立

CRISPR/Cas9技术介导miR167前体序列编辑体系的建立

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作者：王小柯西南大学

学位级别：硕士

中国作为世界柑橘的重要生产国之一,栽培历史悠久,品种资源丰富。柑桔的无核育种目前仍然以常规育种为主,基于杂交的传统育种手段耗时长且难以满足定向改良的需求,芽变、实生选种及诱变育种的成功率较低,产生的突变有一定的随机性。近... 详细信息

中国作为世界柑橘的重要生产国之一,栽培历史悠久,品种资源丰富。柑桔的无核育种目前仍然以常规育种为主,基于杂交的传统育种手段耗时长且难以满足定向改良的需求,芽变、实生选种及诱变育种的成功率较低,产生的突变有一定的随机性。近年来基因工程育种作为一种重要辅助手段在柑橘遗传改良中得到应用,基因工程育种可以根据人们的意愿定向改造生物目标遗传特性,创造出新的种质资源,但是转基因技术引发了很多争议,因有外源基因的插入问题,目前转基因技术安全性受到公众的广泛重视。CRISPR/Cas9技术作为一门新兴的第三代基因编辑技术,可以实现在基因组水平上对目标基因定点修饰,并且有研究表明其产生的突变可以遗传给下一代,近些年来CRISPR/Cas9技术逐渐成为研究基因功能的一种新方法。microRNAs(mirNAs)是一类长度约为19-26 nt的内源性非编码单链RNA分子,广泛存在于动植物细胞中,植物microRNA主要通过直接剪切或抑制翻译的方式对靶基因mRNA发挥转录后调控作用。先前的研究表明,一些mirNAs在不同物种之间都具有序列和功能上的保守性,它们主要参与调控植物器官的形态建成和生长发育、植物逆境胁迫反应、植物激素调节和信号转导以及其他重要的生物过程。植物mir167是一类保守的mirNA,它的靶基因有转录因子ARF6和ARF8,主要参与调控植物花和果实发育相关的过程。本研究初步探索了利用CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术对柑橘和番茄mir167a前体序列进行编辑,以期运用该技术开展柑橘无核种质的创制,并对mir167a的功能进行研究。本研究主要取得的研究结果如下:1、利用mirBase数据库搜索并下载出番茄sly-mir167a以及柑橘csi-mir167a的成熟序列和前体序列,分别与NCBI中柑橘和番茄基因组数据库进行BLAST比对,找到它们相应的基因组DNA序列。通过对柑橘csi-mir167a和番茄sly-mir167a成熟序列比对分析,发现两者同源性很高,说明mir167a在柑橘和番茄中的成熟序列保守性较好。同时比对两者的前体序列后发现存在一定的差异,说明mir167a在柑橘和番茄中的前体序列保守性较差。2、针对柑橘csi-mir167a前体序列和番茄sly-mir167a前体序列,利用在线软件分别设计gRNA位点,分别是csi-gRNA和sly-gRNA,并且成功构建了重组pKSE401和pP1C.1C两种类型的CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化体系,进行柑橘上胚轴茎段和番茄子叶的遗传转化试验。在番茄的遗传转化中,经过抗性筛选和PCR检测,鉴定到67株转pKSE401载体的再生植株,经过PCR产物测序分析,与野生型植株的基因序列进行对比,靶标位点区域未发现碱基差异。对于转pP1C.1C载体的番茄材料,得到含荧光标记的愈伤组织,测序结果显示靶标位点区域仍然没有发生基因编辑。进一步通过gRNA靶点效率体外检测试验,发现gRNA靶标位点体外酶切效率不高,由此推测番茄的遗传转化材料中没有发生基因编辑情况,原因在于gRNA位点的设计有缺陷。3、改进试验后,我们使用在线软件和体外检测相结合的方式设计gRNA靶标位点,在线软件对番茄sly-mir167a前体的同源序列设计多个gRNA靶标位点,再通过体外切割效率检测,最终验证得到体外切割成功的gRNA——G1。构建pP1C.1C表达载体后,通过农杆菌介导法转化番茄,得到3个有荧光标记的突变体材料。测序分析结果表明,3个突变体材料在基因组靶标位点区域均出现不同类型的碱基突变,主要是碱基缺失和单碱基插入。本研究通过在线设计结合体外检测gRNA靶点切割效率的方法,在本实验室创建了高效的CRISPR/Cas9体系,并且使用该体系已成功引起特定基因的编辑,说明该方法是可行的。在以后的研究工作中,我们可以利用这个系统来编辑柑橘的mir167a前体序列,从而获得柑橘的突变材料并研究mir167a在柑橘中的功能。

关键词： mir167 CRISPR/Cas9技术载体构建遗传转化

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草莓ARF基因家族的生物信息学分析及mir167与靶基因ARF6的功能鉴定

草莓ARF基因家族的生物信息学分析及MIR167与靶基因ARF6的功能鉴定

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作者：王少希沈阳农业大学

学位级别：硕士

生长素参与调控植物生长发育的许多阶段,是十分重要的植物激素。同时,ARF家族对生长素信号进行调控,是一类重要的转录因子。迄今为止,拟南芥、葡萄、番木瓜、苹果等许多物种ARF家族生物信息学的研究相继被报道,但关于草莓ARF家族鲜有报... 详细信息

生长素参与调控植物生长发育的许多阶段,是十分重要的植物激素。同时,ARF家族对生长素信号进行调控,是一类重要的转录因子。迄今为止,拟南芥、葡萄、番木瓜、苹果等许多物种ARF家族生物信息学的研究相继被报道,但关于草莓ARF家族鲜有报道。本研究对草莓ARF基因家族进行生物信息学鉴定并构建了mir167及ARF6过表达载体,ARF6干扰载体,获得了转基因草莓植株,通过转基因植株的表型观察揭示出草莓mir167、ARF6基因的功能。主要结果如下:(1)从NCBI数据库中获得12个草莓ARF家族基因(FvARFs),分别是FvARF1、FvARF2、FvARF3、FvARF4、FvARF5、FvARF6、FvARF8、FvARF9、FvARF17、FvARF18、FvARF19和FvARF23。对家族基因进行系统进化分析,12个基因在进化树中被分为四个分支,FvARF6与AtARF6、FvARF3与MdARF3、FvARF23与MdARF23、FvARF1与MdARF1等为同一分支的姐妹基因对,进化关系较近。FvARFs不平均的分布在五条染色体上,FvARFs都含有三个保守的结构域,只有FvARF3、FvARF17、FvARF18是截断的CTD结构域。家族基因外显子、内含子结构不同,内含子的数量从1-16不等。利用MEME数据库分析显示,除FvARF17之外,家族基因保守基序分布及结构相似。(2)以‘艳丽’草莓为试材,采用qRT-PCR的方法对其不同器官、不同发育时期的果实进行基因表达量分析发现:FvARFs在所有器官中均有表达;在不同的果实发育阶段FvARFs的相对表达量均是随着果实的成熟表达量逐渐降低。(3)对‘Ruegen’草莓试管苗采用10μmol·L的IAA分别处理0 h,6 h,12 h,24 h,48 h和不同IAA浓度(0μmol·L,0.1μmol·L,1μmol·L,10μmol·L,25μmol·L)处理12 h。qRT-PCR结果显示,10μmol·LIAA处理12 h时ARF家族基因表达量最高。(4)利用RT-PCR的方法从‘艳丽’草莓中克隆出mir167及靶基因ARF6,获得ARF6基因的编码区全长2646 bp,编码882个氨基酸,与NCBI数据库中二倍体ARF6序列相似度高达98.68%,克隆出的mir167基因长度为305 bp。(5)构建了ARF6突变基因的过表达载体、mir167基因过表达载体、ARF6干扰载体,采用农杆菌介导的遗传转化将其转入‘Ruegen’草莓苗中。得到mir167过表达植株4个株系和ARF6干扰植株3个株系。表型观察发现mir167过表达植株和ARF6干扰植株都表现出分枝数和根系数量的增加,ARF6干扰植株叶片深绿狭长并呈现出向内卷曲皱缩的现象。(6)构建了pGBKT7-ARF6融合载体并与pGBKT7空载体同时转化酵母菌感受态,通过一缺、三缺培养基的长势分析,鉴定出ARF6为转录激活因子。

关键词：草莓生长素响应因子 ARF6 mir167 基因功能

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玉米苗期耐低氮杂种优势及mir167基因等位变异分析

玉米苗期耐低氮杂种优势及MIR167基因等位变异分析

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作者：王建海四川农业大学

学位级别：硕士

玉米是最重要的粮食和饲料作物。玉米苗期根部对低氮的生理反应与耐低氮杂种优势是品种全生育期营养与水分吸收、生物量和产量建成的关键,具有重要意义。本研究以81565等8个亲本自交系及其组配的28个不完全双列杂交组合为材料,在低氮与... 详细信息

玉米是最重要的粮食和饲料作物。玉米苗期根部对低氮的生理反应与耐低氮杂种优势是品种全生育期营养与水分吸收、生物量和产量建成的关键,具有重要意义。本研究以81565等8个亲本自交系及其组配的28个不完全双列杂交组合为材料,在低氮与正常供氮水培条件下,鉴定了亲本及其杂交种对低氮逆境处理的反应,分析了其耐低氮的杂种优势,并分析侧根发育重要调节因子mir167基因(mir167)的遗传等位变异及其与靶基因互作。本研究为玉米遗传育种苗期耐低氮杂种优势效应、分子生物学中mir1 67等位变异与侧根低氮反应等功能鉴定奠定了研究基础。主要研究结果如下：(1)建立了水培条件下玉米苗期耐低氮鉴定与评价技术体系。采用该技术体系对供试亲本及其杂交组合进行分析。分析表明,与正常供氮对照相比,低氮胁迫处理15天后,玉米自交系及杂交种幼苗表现出明显的缺氮表型：生物量降低,根茎比增加：侧根数、根系表面积、.根系体积和根系分叉数增多;叶绿素含量降低;茎干中花青素含量升高：下部叶片呈现早衰现象。(2)通过对亲本自交系和杂交种在两种供氮水平下根系表面积、根系分叉数、根系总体积、根系直径、根尖数、根茎比、花青苷、生物量和SPAD值这9个不同性状的遗传力、亲子关系、一般配合力和特殊配合力以及杂种优势分析发现：不同材料在对低硝酸盐响应时存在广泛的基因型差异,而且在一般配合力和特殊配合力方面也存在很大的差异。由于根系直径、生物量、花青苷和SPAD值存在很大的遗传力,因此在研究玉米苗期自交系和杂交种耐低氮性状时这几个性状显得非常重要。玉米苗期耐低氮性状中根尖数和生物量存在明显的杂种优势效应,而且根尖数的杂种优势很大程度上是由于一般配合力效应,而生物量的杂种优势是由于一般配合力和特殊配合力共同作用的结果。因此遗传改良是提高玉米品种耐低氮重要而有效的途径。(3)通过对亲本自交系和杂交种在两种供氮水平下9个不同性状氮敏感差异分析。根系总体积、根尖数、花青苷和根系直径以及根系总体积、根尖数、花青苷和根冠比对低氮较为敏感可以分别作为玉米自交系和杂交种苗期耐低氮筛选的生理指标。(4)利用重测序方法开展了mir167家族等位变异分析,结果表明,mir167家族的10个成员中mir167c最保守,总体来讲mir167b/e变异较大,mir167j变异较小。对mir167各成员在低氮和正常氮条件下分别构建的根与茎小RNA库中表达量分析发现,mir167在玉米中表达存在组织特异性,而且.对低硝酸盐胁迫存在响应。通过对mir167靶基因降解组测序进行分析,并利用5’-RACE技术对预测的mir167的靶基因进行验证,证实GRMZM2G035405和GRMZM2G078274是玉米mir167的靶基因。

关键词：玉米幼苗低氮 mir167 靶基因

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Bna-novel-mir36421调节拟南芥株型和花器官发育的功能验证

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作物学报 2022年第7期48卷 1635-1644页

作者：戴丽诗常玮张赛钱明超黎小东张凯李加纳曲存民卢坤西南大学农学与生物科技学院重庆400715 南方山地农业教育部工程研究中心重庆400715 西南大学农业科学研究院重庆400715

MicroRNA参与油菜种子发育、胁迫响应和胚胎发育等多种生物学过程,但其在油菜株型和花器官发育方面的报道还较少。本研究以高/低收获指数油菜中显著差异表达的Bna-novel-mir36421为对象,通过转基因植株表型、靶基因预测、表达量和双荧... 详细信息

MicroRNA参与油菜种子发育、胁迫响应和胚胎发育等多种生物学过程,但其在油菜株型和花器官发育方面的报道还较少。本研究以高/低收获指数油菜中显著差异表达的Bna-novel-mir36421为对象,通过转基因植株表型、靶基因预测、表达量和双荧光素酶报告系统等解析其调控机制。Bna-novel-mir36421与植物mir167家族成员高度同源,可能为油菜新的mir167成员。Bna-novel-mir36421能靶向并抑制Bna.C03ARF6、Bna.C06ARF8、Bna.A09PATL2和Bna.C03DUF581的表达。过表达拟南芥植株中,Bna-novel-mir36421的表达量显著上调,而上述4个靶基因的拟南芥同源基因表达量极显著下降。过表达拟南芥植株株型矮小,茎间缩短,叶片高度卷曲;花器官发育异常,雌蕊膨大,雄蕊花丝缩短,花药不开裂,花粉败育。推测Bna-novel-mir36421可能通过抑制Bna.C03ARF6、Bna.C06ARF8、Bna.A09PATL2和Bna.C03DUF581基因表达,进而对油菜株型和花器官的发育起到重要的调控作用。研究结果对解析mirNA介导的植物株型和花器官发育分子机制,挖掘重要发育性状关键基因奠定了重要基础。

关键词：甘蓝型油菜 Bna-novel-mir36421 mir167 株型花器官

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大豆花叶病毒诱导半夏内源microRNA的差异表达分析

大豆花叶病毒诱导半夏内源microRNA的差异表达分析

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作者：王晨燕山西农业大学

学位级别：硕士

半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)是天南星科(Araceae)半夏属(Pinellia Tenore)的传统重要药用植物。随着半夏的药用价值不断被发掘和认可,对半夏的需求日益增多,人们对野生资源过度采伐,致使野生半夏出现供不应求的现象,规模化人... 详细信息

半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)是天南星科(Araceae)半夏属(Pinellia Tenore)的传统重要药用植物。随着半夏的药用价值不断被发掘和认可,对半夏的需求日益增多,人们对野生资源过度采伐,致使野生半夏出现供不应求的现象,规模化人工种植半夏势在必行。在人工种植过程中,半夏面临严重的病毒病害问题,影响其产量和质量的提升,课题组前期研究发现,半夏饱受大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)侵染的危害。SMV是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)典型的成员,是引起大豆,半夏等花叶、曲叶症状的重要病毒病原。大量研究表明,当病毒侵染植物时,植物会通过调控其内源mi RNA的表达来抵御病毒的侵染。本研究以感病半夏为试验材料,利用Gibson组装法构建SMV侵染性克隆(pSMV-SXBX);并将pSMV-SXBX接种寄主半夏,采集接种一定时期后的半夏系统叶进行small RNA测序。利用生物信息学方法对small RNA测序结果进行分析,并对半夏内源mi R167成熟体序列、靶基因序列进行分析鉴定,利用q RT-PCR技术分析mi R167及靶基因pt ARF6响应SMV胁迫的表达模式。主要研究结果如下:1.以表现病毒侵染症状的半夏为试验材料,利用Gibson组装法成功构建SMV侵染性克隆(pSMV-SXBX)。利用Gibson组装法将扩增获得的SMV基因组片段和线性化载体(p GreenⅡ-35S)一步组装,构建的侵染性克隆命名为pSMV-SXBX;pSMV-SXBX农杆菌浸润法接种半夏,症状学观察半夏系统叶表现出明显黄化症状;经RT-PCR检测半夏叶片被SMV侵染。2.pSMV-SXBX农杆菌浸润法接种半夏10 d时,采集处理组(SMV侵染)半夏系统叶和对照组(重悬液)半夏系统叶分别进行small RNA测序。测序数据分析表明,共鉴定到150个mi RNA,其中132个已知mi RNA,18个新预测的Novel-mi RNA。利用生物信息学的方法对高通量测序结果进行分析,并以|log2(SMV/CK)|≥1且P-value167、mi R159和mi R168等6个显著差异表达mi RNA。其中,mi R167、mi R482和mi R168是在SMV侵染半夏后表现为下调模式,而mi R5059、mi R393和mi R159表现为上调模式。进一步利用q RT-PCR的方法鉴定差异mi RNA的表达量,结果表明与高通量测序结果表达模式相同。对差异表达mi RNA的靶基因进行GO功能注释分析,发现靶基因在生物过程中主要注释到信号转导(GO:0007156)和防御反应(GO:0006952)等过程;在细胞组分中主要注释到核(GO:0005634)和叶绿体(GO:0009507)等组分;在分子功能中主要注释到蛋白结合(GO:0005515)及ATP结合(GO:0005524)等功能。3.利用small RNA测序技术和q RT-PCR分别检测了pSMV-SXBX侵染半夏5 d、10 d、15 d和20 d时mi R167和靶基因(pt ARF6)的表达量以及SMV的积累量。结果表明,SMV的积累量在5 d～10 d增长最快;而mi R167的表达量在10 d时最低,且仅为对照组的1%。利用靶基因预测软件结合转录组测序数据,分析表明pt ARF6为mi R167的靶基因,并通过q RT-PCR技术检测靶基因pt ARF6在5 d、10 d、15 d和20 d时的表达量。结果表明,靶基因pt ARF6在pSMV-SXBX侵染半夏10 d时表达量最高,约为对照组的2.7倍。本研究表明,将构建的SMV侵染性克隆(pSMV-SXBX)接种半夏后,不仅会导致半夏叶片出现黄化的症状,还致使大量内源mi RNA的表达发生变化。借助高通量测序技术和q RT-PCR方法分析表明,mi R167的表达量在pSMV-SXBX侵染半夏5 d、10 d、15 d和20 d时均受到抑制,且在10 d时mi R167表达量最低,仅为对照组的1%;同时对mi R167靶基因(pt ARF6)分析表明,pt ARF6的表达量在pSMV-SXBX侵染半夏的5d、10 d、15 d和20 d时均高于对照组,且在10 d时表达量达到最高,约为对照组的2.7倍;同样对SMV的积累量进行检测,发现在pSMV-SXBX侵染半夏的5 d、10 d、15 d和20 d时SMV的积累量不断增长,且在5 d～10 d时SMV积累量增长最快。综合分析表明,mi R167及其靶基因(pt ARF6)参与调控了SMV侵染半夏的过程,该研究结果将为半夏抗病毒育种奠定一定基础。

关键词：半夏大豆花叶病毒 small RNA测序 mir167 靶基因

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水稻草状矮化病毒对水稻氮代谢的影响

水稻草状矮化病毒对水稻氮代谢的影响

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作者：黄丽萍福建农林大学

学位级别：硕士

水稻草状矮缩病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)属纤细病毒属,可引起水稻草状矮化病。20世纪70年代曾在南亚、东南亚大面积流行RGSV,造成了严重的经济损失,其由介体褐飞虱进行持久性方式,不经卵传播。RGSV采用双义编码策略,由6种ssRN... 详细信息

水稻草状矮缩病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)属纤细病毒属,可引起水稻草状矮化病。20世纪70年代曾在南亚、东南亚大面积流行RGSV,造成了严重的经济损失,其由介体褐飞虱进行持久性方式,不经卵传播。RGSV采用双义编码策略,由6种ssRNA组成,编码12个蛋白。对RGSV的研究在基因组结构、功能、抗病育种等方面略有研究但并不深入,然而在RGSV的致病机制,症状形成机理仍是空白领域,为此本研究着眼于RGSV症状形成机理与植物营养代谢的新视角来展开研究。利用real-timePCR方法检测受RGSV侵染的水稻植株氮素转运蛋白基因的表达水平,显示高亲和与低亲和的硝态氮转运子都有出现上调但不是全部,OsNRT1.1和OsNRT2.1分别上调2.4倍和2.8倍,同样的铵态氮的转运子OsAMT1.3、0sAMT3.1、OsAMT3.2明显上调了3.1、10.9、14.8倍。测定了RGSV侵染的水稻的全氮含量,结果表明全氮含量上升,这与real-timePCR的结果一致。如此我们证实了RGSV调控水稻氮代谢,使得水稻的吸收和同化增强。已有研究表明mir167/ARF8和mir393/AFB3是种特异的N应答模式,低硝态氮条件下受诱导而控制根系起始和延伸去响应内部和外部可用氮源,从而影响水稻硝态氮和铵态氮的吸收。构建载体以农杆菌介导法获得mir167和mir393的转化T0代植株,分析生长表型。阳性植株出现叶片黄化,不规则斑驳及叶片扭曲。这与RGSV感病植株的典型症状存在一定的相似,我们推测RGSV的致病机制与水稻中mir167/ARF8和mir393/AFB3的作用模式机制是一致的。

关键词：草状矮缩病毒 mir167 mir393 N-转运子转基因

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