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mir-92b-3p通过靶向RAD21增强非小细胞肺癌对顺铂的化学敏感性

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实用医学杂志 2020年第14期36卷 1897-1902页

作者：潘有光傅文凡莫益俊赵健陈岗东广州医科大学附属第三医院广州510150 广州医科大学附属肿瘤医院广州510095 南方医科大学深圳医院广东深圳518000

目的检测mir-92b-3p在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞株A549及其顺铂耐药株A549/DDp中的表达,探讨其在顺铂耐药中的作用机制。方法应用实时定量反转录聚合酶联反应(qpCR)检测mir-92b-3p在A549/DDp及A549中的表达;C... 详细信息

目的检测mir-92b-3p在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞株A549及其顺铂耐药株A549/DDp中的表达,探讨其在顺铂耐药中的作用机制。方法应用实时定量反转录聚合酶联反应(qpCR)检测mir-92b-3p在A549/DDp及A549中的表达;CCK8法分别检测各细胞株转染mir-92b-3p mimics或inhibitor后对DDp敏感度的改变;生物信息学预测及双荧光素酶报告基因验证mir-92b-3p和靶基因的关系。qpCR和Western blot检测RAD21基因及蛋白的表达。结果 mir-92b-3p在A549/DDp细胞株中呈现低表达(p mir-92b-3p mimics转染A549/DDp细胞株后,DDp对转染细胞株的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)显著低于阴性对照组(p p mir-92b-3p inhibitor后,得出相反的结论。结论 mir-92b-3p在A549/DDp细胞株低表达,其通过调控RAD21 mRNA及蛋白的表达而逆转A549/DDp细胞对DDp的耐药。

关键词：非小细胞肺癌 mir-92b-3p 化疗耐药顺铂 RAD21

mir-92b-3p促进人脐带间充质干细胞的成骨分化

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基础医学与临床 2016年第5期36卷 598-603页

作者：张燕严冰浩徐辰顾道兰王越刘厚奇第二军医大学转化医学院上海200433 第二军医大学组织胚胎学教研室上海200433

目的探究mir-92b-3p在人脐带间充质干细胞(h UCMSCs)成骨分化过程中的作用及其作用机制。方法通过转染h UCMSCs过表达或抑制mir-92b-3p,qRT-pCR检测各组成骨相关基因OCN、RUNX2、OSTERIX mRNA表达以明确mir-92b-3p对h UCMSCs成骨分化的... 详细信息

目的探究mir-92b-3p在人脐带间充质干细胞(h UCMSCs)成骨分化过程中的作用及其作用机制。方法通过转染h UCMSCs过表达或抑制mir-92b-3p,qRT-pCR检测各组成骨相关基因OCN、RUNX2、OSTERIX mRNA表达以明确mir-92b-3p对h UCMSCs成骨分化的体外调控作用,用茜素红染色比较各处理组的骨化能力。通过生物信息学分析mir-92b-3p可能的靶基因,并通过双荧光素酶基因报告系统以及Western blot验证。结果 mir-92b-3p在h UCMSCs成骨过程中表达量较对照组明显升高(pmir-92b-3p能促进h UCMSCs体外成骨分化及体内的异位成骨能力(pmir-92b-3p则能降低h UCMSCs体外成骨分化(pmir-92b-3p能显著降低DKK1的表达量(ppmir-92b-3p可通过抑制DKK1表达,促进h UCMSCs成骨分化。

关键词： mir-92b-3p 人脐带间充质干细胞(hUCMSCs) 成骨分化 DKK1

mir-92b-3p通过靶向下调NOX4促进卵巢癌细胞对顺铂耐药

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miR-92b-3p通过靶向下调NOX4促进卵巢癌细胞对顺铂耐药

作者：戴春艳福建医科大学

学位级别：硕士

目的:探究NADpH氧化酶4(NADpH Oxidase 4,NOX4)在卵巢癌顺铂耐药中的作用,并进一步研究mir-92b-3p靶向NOX4调控卵巢癌顺铂耐药的机制,为临床卵巢癌化疗耐药寻求新的解决思路。方法:1利用药物浓度递增法,对SKOV3和A2780细胞实行顺铂(DDp... 详细信息

目的:探究NADpH氧化酶4(NADpH Oxidase 4,NOX4)在卵巢癌顺铂耐药中的作用,并进一步研究mir-92b-3p靶向NOX4调控卵巢癌顺铂耐药的机制,为临床卵巢癌化疗耐药寻求新的解决思路。方法:1利用药物浓度递增法,对SKOV3和A2780细胞实行顺铂(DDp)耐药性诱导,CCK-8实验,细胞集落形成实验验证。2通过蛋白印迹法(Western blot,Wb)、实时荧光定量pCR(Quantitative Real-time pCR,q pCR)方法检测NOX4在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和顺铂耐药的细胞株SKOV3/DDp、A2780/DDp中的表达量。3设计并合成人源NOX4基因的干扰片段siRNA-1、siRNA-2及阴性对照NC-siRNA,在基因敲低的基础上重新表达以观察细胞对DDp敏感性的变化。Western blot检测蛋白的敲低与回补。4运用Starbase、Target Scan、mirDb等生物信息学网站,分析与NOX4有关的mirNAs,筛选出可能对NOX4-3’UTR有靶向作用的mirNAs。5化学合成NOX4-3’UTR,连接于pmir GLO载体,构建重组质粒pmir GLO-NOX4-3’UTR WT,通过脂质体转染法将通过软件预测分析出的mirNA mimic或阴性对照(NC mimic)与pmir GLO-NOX4-3’UTR WT重组质粒分别共转染SKOV3、A2780细胞中,转染48 h后,通过双荧光素酶报告基因实验对其荧光素酶活性进行检测,与阴性对照组相比,筛选出对NOX4-3’UTR可能起调控作用的mirNAs。6通过初筛并结合生物信息学分析,选择mir-92b-3p作为研究对象,找到其与NOX4-3’UTR的配对碱基,突变配对碱基并构建重组质粒pmir GLO-NOX4-3’UTR Mut,由脂质体转染法与mir-92b-3p mimic共转染SKOV3、A2780细胞,48 h后,通过双荧光素酶报告基因实验对其荧光素酶活性进行检测。7通过实时荧光定量pCR(Quantitative Real-time pCR,q pCR)方法检测mir-92b-3p在卵巢癌亲本细胞株和顺铂耐药的细胞株中的表达量差异。8脂质体转染法把mir-92b-3p mimic、NC mimic、mir-92b-3p inhibitor和NC inhibitor瞬时转染到SKOV3、A2780细胞株中,24 h后通过Real-time pCR检测转染效率;并进一步通过Western blot、Real-time pCR法检测mir-92b-3p对SKOV3、A2780细胞株中NOX4表达影响。9通过CCK-8实验,流式细胞术方法,代谢分析实验验证mir-92b-3p是否通过靶向调控NOX4表达影响卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。结果:1成功构建顺铂耐药的卵巢癌细胞株,并发现与卵巢癌亲本株相比,在顺铂耐药的卵巢癌细胞株中基因NOX4下调。NOX4敲低能显著抑制卵巢癌细胞对顺铂的敏感性而回补NOX4后卵巢癌细胞恢复对顺铂的敏感性。2通过软件预测及数据库分析,发现mir-25-3p、mir-32-5p、mir-92a-3p、mir-92b-3p、mir-363-3p、mir-367-3p能降低荧光素酶活性,其中mir-92b-3p的作用最明显。并发现在这6个候选mirNAs中mir-92b-3p在顺铂耐药的卵巢癌细胞株中显著上调。实验结果显示,mir-92b-3p mimic能显著抑制卵巢癌细胞对顺铂的敏感性而mir-92b-3p inhibitor可恢复卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。结论:mir-92b-3p通过靶向下调NOX4的表达促进卵巢癌细胞对顺铂产生耐药。

关键词：卵巢癌顺铂 NOX4 mir-92b-3p 化疗耐药

mir-92b-3p抑制C2C12细胞增殖和迁移及机理初探

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miR-92b-3p抑制C2C12细胞增殖和迁移及机理初探

作者：石佳华南农业大学

学位级别：硕士

骨骼肌在维持身体正常机能中发挥重要作用,骨骼肌的生长发育过程可以由成肌细胞的成肌发育过程阐明。C2C12细胞作为成肌细胞功能研究的经典模型被广泛用于科学研究中。mi RNA是一种长度为20bp左右的短链非编码RNA,通过靶向调控m RNA的表... 详细信息

骨骼肌在维持身体正常机能中发挥重要作用,骨骼肌的生长发育过程可以由成肌细胞的成肌发育过程阐明。C2C12细胞作为成肌细胞功能研究的经典模型被广泛用于科学研究中。mi RNA是一种长度为20bp左右的短链非编码RNA,通过靶向调控m RNA的表达,在转录水平和转录后水平参与多种生命过程的调控。mi RNA在成肌细胞增殖、迁移和分化过程中同样发挥重要的功能,研究mi RNA功能对于阐明成肌细胞的发育过程,完善其调控机理,进一步了解肌肉发育过程具有重要的意义。本研究以C2C12细胞为模型,通过过表达和干扰mi R-92b-3p研究其对C2C12细胞增殖、迁移和分化的影响。并通过生物信息学预测和双荧光素酶报告系统检测得知,其在增殖期可能通过调控Sgk3表达来发挥功能,通过构建Sgk3过表达载体和合成干扰片段,研究Sgk3对C2C12细胞增殖的影响。获得主要研究结果如下:1)mi R-92b-3p抑制C2C12细胞增殖C2C12细胞过表达和干扰mi R-92b-3p后24 h和48 h,通过流式细胞技术检测发现过表达后G1期的细胞数量显著增加,S期细胞数量显著降低。定量检测细胞周期蛋白和p21表达,结果显示过表达24 h后Ccna、Ccnb表达量显著降低,p21表达量显著增加,48 h后Ccnb表达量显著降低,干扰后结果相反。蛋白水平检测结果与m RNA水平结果一致。2)mi R-92b-3p抑制C2C12细胞迁移过表达和干扰mi R-92b-3p后24 h,进行划痕试验,通过活细胞工作站观察发现,迁移6 h,过表达mi R-92b-3p后迁移距离极显著降低,12 h显著降低,干扰后有相反的结果。定量检测迁移相关基因表达发现过表达mi R-92b-3p后Mmp2的表达量显著降低,干扰后结果相反。表明mi R-92b-3p可能是通过影响Mmp2的表达,抑制C2C12细胞迁移。3)mi R-92b-3p对C2C12细胞分化无影响C2C12细胞过表达mi R-92b-3p后诱导分化3、5、7、9天,通过Myosin免疫荧光发现,过表达mi R-92b-3p后Myosin阳性率无显著变化。定量检测Myosin和Myogenin的表达发现过表达mi R-92b-3p后其表达量也无显著变化。表明mi R-92b-3p对C2C12细胞分化无影响。4)靶基因预测通过生物信息学分析及双荧光素酶报告系统分析检测发现mi R-92b-3p可抑制包含Sgk3野生型3’UTR区的pmir GLO载体荧光素酶活性;在C2C12细胞中,过表达mi R-92b-3p后可降低Sgk3在m RNA水平和蛋白水平的表达,干扰后结果相反。表明Sgk3是mi R-92b-3p潜在的靶基因。5)Sgk3促进C2C12细胞增殖通过构建pc DNA3.1-Sgk3过表达载体和合成干扰片段,在增殖期24 h和48 h进行流式细胞技术检测,结果显示,过表达Sgk3后24和48h位于G1期细胞数量显著降低,S期细胞数量显著增加,干扰后有相反的结果。定量检测细胞周期蛋白和p21表达发现,过表达Sgk3后24 h Ccnb表达量显著增加,48 h后Ccnb、Ccnd表达量显著增加。干扰后24 h Ccna、Ccnb表达量显著降低,48 h后Ccnb表达量显著降低,p21表达量显著增加。在蛋白水平与m RNA水平趋势一致。表明Sgk3可能通过促进G1期向S期的转换,促进C2C12细胞的增殖。6)mi R-92b-3p通过靶向Sgk3调控细胞增殖pc DNA3.1+NC、pc DNA3.1+mimics、pc DNA3.1-Sgk3+NC、pc DNA3.1-Sgk3+mimics分别转染C2C12细胞,研究mi R-92b-3p与Sgk3的相互作用,通过流式细胞周期检测、定量和Wb检测发现mi R-92b-3p可以降低Sgk3促进C2C12细胞增殖的效果。综上所述,mi R-92b-3p可以通过靶向Sgk3抑制C2C12细胞增殖,可能通过抑制Mmp2表达抑制C2C12细胞迁移。

关键词： C2C12细胞增殖迁移 mir-92b-3p Sgk3

mir-92b-3p通过靶向CDKN1C调节细胞周期和凋亡，影响人结直肠癌多药耐药作用研究

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miR-92b-3p通过靶向CDKN1C调节细胞周期和凋亡，影响人结直肠癌多...

作者：赵芳卿华东师范大学

学位级别：硕士

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是全球第三大常见的恶性肿瘤,并且是癌症死亡的第二大原因,扩散后5年生存率仅为13%。化疗是结直肠癌治疗的标准方案,但耐药特别是多药耐药（multidrug resistance,MDR）已经成为临床治疗CRC的一大障碍... 详细信息

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是全球第三大常见的恶性肿瘤,并且是癌症死亡的第二大原因,扩散后5年生存率仅为13%。化疗是结直肠癌治疗的标准方案,但耐药特别是多药耐药（multidrug resistance,MDR）已经成为临床治疗CRC的一大障碍,有近90%的患者在治疗过程中出现了一定程度的MDR,这使得临床治疗无法取得预期的效果,从而引起肿瘤的复发和转移,并最终死于癌症。然而,MDR的明确分子机制十分复杂,其他潜在机制和生物标志物还有待确定。研究表明,微小RNA（micro RNA,mirNA）参与多种生物学过程,以癌基因或抑癌基因的形式在肿瘤的增殖、迁移、侵袭、血管生成和耐药中发挥重要作用。为了寻找可能参与CRC MDR表型的mirNA靶点,本研究利用转录组学和小RNA组学分析CRC HCT8细胞系及其耐药细胞系HCT8/T中mirNA的表达谱,筛选发现mir-92b-3p在HCT8/T细胞中高表达,可能在CRC MDR中发挥重要作用。研究结果显示,mir-92b-3p在HCT8/T和HCT8/V MDR细胞株中高表达,且可受pTX的诱导表达上调。此外,mir-92b-3p的过表达可以在化疗环境中维持细胞活力,促进细胞的迁移和对化疗药的耐药性,而mir-92b-3p的敲低在体外可降低MDR HCT8/T细胞对多种化疗药物的耐药性,在体内则可使肿瘤对pTX和NVb产生致敏作用。双荧光素酶报告基因分析和Western blotting分析表明,mir-92b-3p直接靶向CDKN1C（编码p57Kip2蛋白）并抑制其表达。CDKN1C的沉默可提高HCT8细胞对化疗药的耐药性,而CDKN1C的过表达则可恢复HCT8/T细胞对化疗药的敏感性。另外,mir-92b-3p与CDKN1C共表达可削弱mir-92b-3p过表达对HCT8细胞的减敏作用,而mir-92b-3p与CDKN1C共沉默则可逆转mir-92b-3p沉默对HCT8/T细胞的增敏作用。提示mir-92b-3p通过靶向CDKN1C调控CRC细胞对化疗药的敏感性,而敲减mir-92b-3p则可上调CDKN1C的表达,显著逆转体内外CRC细胞对化疗药的敏感性。通过对其内在生物学机制的进一步研究可以发现,CDKN1C编码的蛋白p57Kip2可诱导细胞G1期阻滞,同时在化疗环境下发挥促凋亡作用,增强化疗药物诱导的细胞凋亡,从而调节结直肠癌细胞对化疗药的敏感性。综上所述,本研究结果提示化疗药可以刺激结直肠癌细胞上调mir-92b-3p的表达并使细胞对化疗药产生耐药性,且mir-92b-3p通过靶向CDKN1C调节细胞周期和凋亡,从而影响细胞对化疗药的敏感性。据我们所知,本研究揭示了结直肠癌中一种新型的MDR机制,将mir-92b-3p确定为CRC药物敏感性的关键调节因子,阐明了mir-92b-3p/CDKN1C/p57Kip2与化疗耐药的直接联系,揭示了mir-92b-3p介导的分子机制在MDR发生发展过程中发挥重要的作用,提示mir-92b-3p可作为减轻临床化疗MDR的潜在治疗靶标和预测化疗疗效的候选生物标志物。

关键词：多药耐药结直肠癌 mir-92b-3p CDKN1C p57Kip2 细胞周期细胞凋亡

mir-92b-3p在bMp-2诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用和机制研究

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miR-92b-3p在BMP-2诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用和机制研究

作者：林灿福建医科大学

学位级别：硕士

背景与目的MicroRNA(mirNA)是一类广泛存在于生物中,长度在22个核苷酸左右的单链小分子RNA。近年来,研究发现mirNA在成骨分化和骨形成中起到了重要作用。有文献报道mir-92b-3p可以促进人脐带间充质干细胞的成骨分化,但mir-92b-3p在小鼠... 详细信息

背景与目的MicroRNA(mirNA)是一类广泛存在于生物中,长度在22个核苷酸左右的单链小分子RNA。近年来,研究发现mirNA在成骨分化和骨形成中起到了重要作用。有文献报道mir-92b-3p可以促进人脐带间充质干细胞的成骨分化,但mir-92b-3p在小鼠成骨样细胞系MC3T3-E1中的作用和机制尚未见报道。bMp-2是骨形成蛋白家族中重要的亚型,可以通过调控TGF-β/bMp等信号通路起到促进成骨分化的作用。本研究的目的在于探讨mir-92b-3p在bMp-2诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用及其可能的机制。方法1 mir-92b-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用(1)MC3T3-E1分别在完全培养基和添加了bMp-2的培养基中培养,RT-qpCR检测诱导前后mir-92b-3p的表达、碱性磷酸酶(ALp)染色检测诱导前后ALp活性。(2)在MC3T3-E1细胞中转染mir-92b-3p mimic或inhibitor,RT-qpCR检测过表达、干扰效率和ALp的表达,ALp染色检测诱导前后ALp活性。2 mir-92b-3p调控MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制研究(1)利用star base数据库和DAVID数据库预测、分析mir-92b-3p的靶基因。(2)MC3T3-E1细胞转染mir-92b-3p mimic或inhibitor,RT-qpCR和western blot检测靶基因的表达,分析mir-92b-3p对靶基因的作用。结果1 mir-92b-3p对MC3T3-El细胞成骨分化的影响(1)使用400 ng/m L的bMp-2诱导的MC3T3-E1细胞与对照组相比,mir-92b-3p表达升高(pp)活性升高。(2)MC3T3-El细胞转染mir-92b-3p mimic后,mir-92b-3p、ALp表达水平升高(pp活性升高。转染mir-92b-3p inhibitor后,mir-92b-3p、ALp表达水平降低(pp活性降低。2 mir-92b-3p调控MC3T3-El细胞成骨分化的作用机制研究(1)通过star base数据库预测并筛选出mir-92b-3p下游204个靶基因,KEGG分析显示靶基因与Fox O信号通路等10条代谢通路相关,GO分析显示靶基因功能与Smad蛋白家族有关。结合富集分析结果和文献报道,发现mir-92b-3p下游存在靶基因Smad7,其是重要的成骨负向调控因子。(2)MC3T3-El细胞转染mir-92b-3p mimic后,Smad7 mRNA和蛋白表达水平降低(pmir-92b-3p inhibitor后,Smad7 mRNA和蛋白表达水平升高(pmir-92b-3p促进了bMp-2诱导的MC3T3-E1细胞的成骨分化,同时mir-92b-3p可以抑制成骨负向调控因子Smad7的表达,mir-92b-3p促进MC3T3-E1细胞成骨分化的机制可能是其抑制了成骨负向调控因子Smad7的表达。

关键词： mir-92b-3p Smad7 MC3T3-E1 成骨分化 bMp-2

模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体转运mir-92b-3p抑制成骨细胞分化功能的研究

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模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体转运miR-92b-3p抑制成骨细胞分...

作者：张晓雁中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

【研究背景】机械刺激对维持骨形成和骨吸收之间的平衡至关重要。航天失重环境可破坏骨稳态,导致持续的骨丢失现象,严重危害航天员的健康。目前我国天宫空间站的在轨组装建造已经完成,长期在轨飞行已成为我国航天员的工作常态。因此,进... 详细信息

【研究背景】机械刺激对维持骨形成和骨吸收之间的平衡至关重要。航天失重环境可破坏骨稳态,导致持续的骨丢失现象,严重危害航天员的健康。目前我国天宫空间站的在轨组装建造已经完成,长期在轨飞行已成为我国航天员的工作常态。因此,进一步揭示失重性骨丢失的分子机制,为失重环境下航天员的骨丢失提供有效的对抗措施,是目前航天医学领域亟待解决的主要问题。骨骼是高度血管化的组织,研究表明骨内微血管在骨稳态中发挥关键作用,其中的血液循环和血管再生对于骨骼的生长与发育、塑形与重塑、损伤愈合至关重要。在时间上,血管生成先于骨形成,是骨化的先决条件;在空间上,骨内微血管是骨与邻近组织的沟通网络,提供营养物质,清除代谢废物,表明血管生成和骨形成之间存在紧密的时空联系,这种联系被称为“血管新生-骨形成耦联”。骨内微血管及血管生成减少可导致骨形成障碍、骨量减少、骨折愈合能力降低。已有文献报道,模拟失重下微血管内皮细胞的条件培养基可抑制成骨细胞功能,但具体机制尚未阐明。外泌体是细胞间通讯的重要途径,可通过转运核酸、蛋白质和其他调控因子到受体细胞中发挥调控作用,参与体内免疫应答、骨重建、血管生成等多种生理活动。在骨重塑微环境中,外泌体可向成骨细胞递送mi RNAs进而影响骨形成。然而,模拟失重下微血管内皮细胞能否通过外泌体调控成骨细胞及其可能的机制尚无研究报道。【目的】本研究旨在从“血管新生-骨形成耦联”的角度,探索模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体对成骨细胞功能的影响及其分子机制,丰富失重性骨丢失发生机制的理论体系,并为失重性骨丢失的防治提供潜在的干预靶点。【方法】1.为探究模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体对成骨细胞的调控作用,采用以下实验方法。对微血管内皮细胞进行2D回转器模拟失重处理48 h,采用超速离心法提取细胞培养上清中的外泌体,并对外泌体进行鉴定:透射电镜观察外泌体形态,纳米流式分析外泌体直径分布,western blotting检测外泌体和细胞中的外泌体标志物和细胞标志物。通过免疫荧光实验观察成骨细胞能否摄取微血管内皮细胞源外泌体。将对照组和失重组微血管内皮细胞源外泌体分别与成骨细胞孵育48 h,检测微血管内皮细胞源外泌体对成骨细胞分化功能的调控作用:q RT-pCR检测成骨细胞分化标志物Alp、Osx、Runx2和Ocn的m RNA表达变化,western blotting检测OSX、RUNX2和OCN的蛋白表达变化,ALp染色及ALp活性检测ALp的酶功能。2.为筛选模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体中差异表达显著的mi RNAs,采用以下实验方法。利用2D回转器使微血管内皮细胞模拟失重48 h后,收集细胞培养上清,利用超速离心法提取外泌体,对两组微血管内皮细胞源外泌体进行mi RNA测序,筛选差异表达的mi RNAs。利用q RT-pCR分别在模拟失重下微血管内皮细胞中及其来源的外泌体中进一步验证差异表达的mi RNAs,从而明确候选mi RNA分子。成骨细胞分别与对照组和失重组微血管内皮细胞源外泌体共培养48 h,通过q RT-pCR检测成骨细胞中mi R-92b-3p的表达变化。3.为探究mi R-92b-3p在模拟失重下微血管内皮细胞调控成骨细胞功能中的作用,采用以下实验方法。利用mi R-92b-3p mimic或inhibitor及相应NC转染MC3T3-E1细胞后,检测mi R-92b-3p对成骨细胞分化功能的调控作用。将mi R-92b-3p inhibitor及NC分别电转到失重组微血管内皮细胞源外泌体中,两组电转外泌体分别与成骨细胞共培养,采用q RT-pCR、western blotting、ALp染色及ALp活性的方法,检测微血管内皮细胞源外泌体能否通过转运mi R-92b-3p调控成骨细胞分化功能。4.为探究mi R-92b-3p调控成骨细胞功能的作用机制,采用以下实验方法。根据生物信息学分析预测mi R-92b-3p的靶基因。q RT-pCR和western blotting检测mi R-92b-3p及失重组微血管内皮细胞源外泌体是否调控ELK4的m RNA和蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验进一步验证mi R-92b-3p能否与Elk4 m RNA3’UTR靶向结合。在MC3T3-E1细胞中转染si RNA-Elk4及NC,检测ELK4对成骨细胞分化功能的调控作用。mi R-92b-3p inhibitor和si RNA-Elk4双转染实验验证mi R-92b-3p是否通过ELK4调控成骨细胞分化功能。【结果】1.通过超速离心法提取模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体并鉴定。模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体可被成骨细胞摄取并抑制成骨细胞分化功能。2.模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体中mi RNA表达谱发生显著改变。mi R-92

关键词：模拟失重外泌体成骨分化微血管内皮细胞成骨细胞 mir-92b-3p ELK4

bACH1通过调控mir-92b-3p/NOX4促进肺腺癌糖酵解和迁移的机制研究

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BACH1通过调控miR-92b-3p/NOX4促进肺腺癌糖酵解和迁移的机制研究

作者：熊腾中国医科大学

学位级别：硕士

目的:有氧糖酵解是癌症细胞获取能量的一种独有方法。近年来,靶向肿瘤糖酵解的治疗受到广泛关注。肿瘤氧化应激微环境与糖酵解相互串联。NADpH氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADpH oxidase,NOX）是肿瘤... 详细信息

目的:有氧糖酵解是癌症细胞获取能量的一种独有方法。近年来,靶向肿瘤糖酵解的治疗受到广泛关注。肿瘤氧化应激微环境与糖酵解相互串联。NADpH氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADpH oxidase,NOX）是肿瘤细胞中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的重要来源之一,而NADpH氧化酶4（NOX4）是NOX中的一个亚型。已有研究证实NOX4通过Akt信号通路影响肺腺癌的糖酵解,但NOX4调控肺腺癌糖酵解的上游机制目前尚不清楚。bACH1在各种恶性肿瘤中高表达且可影响肿瘤细胞ROS的产生,因此,本研究亟待探究bACH1与NOX4间的调控关系以及影响肺腺癌糖酵解的作用机制。研究方法:本研究通过TCGA数据库的测序信息分析bACH1在肺腺癌中的表达,并进行预后分析。应用q RT-pCR和Western blot检测bACH1在人肺腺癌细胞系H1299、A549和正常支气管上皮细胞HbE中的表达。运用一系列生物信息学数据库预测bACH1、mir-92b-3p和NOX4这三者间的作用关系,并通过体外和体内实验来证实这一预测。将si-RNA转染入H1299和A549中下调bACH1的表达,CCK8和Ed U实验检测bACH1敲减后细胞的增殖能力,Transwell实验检测bACH1敲减后细胞的迁移能力。用ATp生成实验、F-FDG摄取实验和乳酸生成实验来评估bACH1敲减后细胞糖酵解的变化。用Western blot检测bACH1敲减后NOX4和GLUT1、HK2、pKM2、LDHA等糖酵解酶的表达,用活性氧试剂盒检测bACH1敲减后细胞ROS的变化。利用生物信息学预测bACH1与mir-92b-3p间的靶向结合位点。用q RT-pCR检测敲减bACH1后mir-92b-3p的表达。通过染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch Ip）和双荧光素酶实验验证转录因子bACH1与mir-92b-3p的启动子区域结合。利用生物信息学预测mir-92b-3p与NOX4间的靶向结合位点。将mir-92b-3p inhibitor和mir-92b-3p mimic转染入H1299和A549,然后用q RT-pCR和Western blot检测NOX4的表达水平。通过双荧光素酶实验证明mir-92b-3p结合在NOX4的3′-UTR（3′-untranslated region,3′-UTR）。将mir-92b-3p inhibitor和mir-92b-3p mimic转染入H1299和A549,并分别与NOX4的si-RNA和过表达质粒共转染,并利用回复实验来验证mir-92b-3p通过调控NOX4影响肺腺癌增殖、迁移和糖酵解。最后将经sh-NC和sh-bACH1感染处理过的A549细胞注射到裸鼠右侧腋下,构建皮下移植瘤模型,应用免疫组化染色技术检测bACH1、NOX4和糖酵解酶的表达水平。同时对皮下移植瘤进行Micro pET显像,影像学验证bACH1对糖酵解的影响。结果:1、TCGA数据库的测序信息表明bACH1在肺腺癌中高表达,且bACH1高表达患者生存时间更短。应用q RT-pCR和Western blot检测bACH1在人肺腺癌细胞系H1299和A549及正常支气管上皮细胞HbE中的表达,结果表明,无论是RNA水平还是蛋白水平,bACH1在H1299和A549中的表达水平均高于HbE。2、应用CCK8和Ed U实验检测H1299和A549细胞的增殖,Transwell检测细胞的迁移,ATp生成、F-FDG摄取和乳酸生成实验检测细胞糖酵解,活性氧试剂盒检测细胞ROS生成水平,结果表明敲减bACH1后细胞的增殖、迁移、糖酵解和ROS的生成水平均降低。3、生物信息学预测发现bACH1与mir-92b-3p呈负向调控关系且存在靶向结合位点。敲减bACH1应用q RT-pCR检测mir-92b-3p的表达水平,研究结果表明敲减组的mir-92b-3p的表达水平升高。根据JASpAR数据库预测的bACH1和mir-92b-3p结合位点序列设计五对Ch Ip-q pCR引物,其中两对为包含特定结合区域的引物,其余三对均为非特异性引物。在H1299细胞中,利用Ch Ip实验收集纯化下来的DNA片段进行q-pCR检测,结果显示bACH1可与mir-92b-3p的启动子区域的特定序列结合,其对应预测的结合位点序列为AGTGAGGCAGCGA。通过双荧光素酶实验验证在mir-92b-3p启动子区域存在bACH1的结合位点。4、生物信息学预测发现mir-92b-3p与NOX4呈负向调控关系且存在靶向结合位点。将mir

关键词： bACH1 mir-92b-3p NOX4 糖酵解活性氧迁移

TGF-β/mir-92b-3p/ITGAV信号轴参与特发性肺纤维化的机制研究

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TGF-β/miR-92b-3p/ITGAV信号轴参与特发性肺纤维化的机制研究

作者：张玉彤吉林大学

学位级别：硕士

目的:(1)研究TGF-β1通过SMAD3下调呼吸道上皮细胞中mir-92b-3p表达水平的具体机制;(2)研究mir-92b-3p靶向抑制ITGAV的具体机制,明确mir-92b-3p在介导上皮间质转化和肺纤维化中发挥的作用。方法:通过TGF-β1刺激呼吸道上皮细胞系A549细... 详细信息

目的:(1)研究TGF-β1通过SMAD3下调呼吸道上皮细胞中mir-92b-3p表达水平的具体机制;(2)研究mir-92b-3p靶向抑制ITGAV的具体机制,明确mir-92b-3p在介导上皮间质转化和肺纤维化中发挥的作用。方法:通过TGF-β1刺激呼吸道上皮细胞系A549细胞,建立肺纤维化体外模型,同时收集9例健康成人及7例特发性肺纤维化患者肺组织,利用q RT-pCR技术检测mir-92b-3p在体内、体外模型中的表达水平。分别将A549细胞和MLE12细胞分为三组:Control组、SMAD3 siRNA组和NC组。Control组为空白对照,不进行任何干预常规培养细胞;SMAD3 siRNA组加入TGF-β1和SMAD3 siRNA,使细胞SMAD3沉默;NC组加入TGF-β1和SMAD3 siRNA的阴性对照序列,在转染后使用q RT-pCR检测mir-92b-3p含量。借助生物信息学技术,预测mir-92b-3p的靶基因,并在A549和MLE12两种细胞系中分别转染mir-92b-3p的模拟物,建立过表达mir-92b-3p的细胞株,最后通过western blot检测对靶基因ITGAV表达的调控作用。通过A549细胞构建体外肺纤维化细胞模型,western blot检测mir-92b-3p对TGF-β1介导的EMT相关基因表达的影响。将40只小鼠随机分成四组:Control组、pbS组、mir-92b-3p组和NC组。其中,Control组小鼠接受常规饲养,pbS组经尾静脉注射pbS,mir-92b-3p组注射r AAV-mir-92b-3p载体;NC组注射r AAV-GFp阴性空白对照载体。经过r AAV载体注射3天后,pbS组、mir-92b-3p组和NC组均采用bLM诱导肺纤维化小鼠模型,通过HE染色技术观察小鼠肺组织结构形态的变化,通过Masson染色技术检测肺组织内胶原的沉积情况。结果:TGF-β1刺激的A549细胞中mir-92b-3p与其他差异性表达的mirNAs相比,表达下降程度最显著,IpF患者的肺组织中也观察到mir-92b-3p的含量下降,大约是健康成人对照组含量的1/4。与阴性对照组相比,在细胞中转染SMAD3 siRNA可使受TGF-β1刺激的呼吸道上皮细胞中mir-92b-3p表达明显上调。转染mir-92b-3p mimic可下调A549和MLE12两种细胞系中的ITGAV蛋白水平。通过在A549细胞中过表达mir-92b-3p,可显著提高上皮标志物E-钙黏蛋白表达水平,而降低了N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白等间质标志物表达水平。pbS组小鼠肺组织呈纤维化改变,NC组小鼠肺纤维化程度与pbS组相似;与pbS组、NC组相比,mir-92b-3p组小鼠肺组织的纤维化程度明显降低。结论:mir-92b-3p在肺纤维化体外模型和IpF患者中表达均下调,TGF-β1激活后通过SMAD3下调mir-92b-3p的表达,抑制mir-92b-3p对ITGAV的负性调节作用,促进IpF发生发展。过表达mir-92b-3p可拮抗EMT过程,减轻肺纤维化。

关键词：特发性肺纤维化微小RNA mir-92b-3p 上皮间质转化