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mir-92a-1-p5对蚜虫翅发育的调控研究

miR-92a-1-p5对蚜虫翅发育的调控研究

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作者：常美玲南阳师范学院

学位级别：硕士

孤雌蚜在发育过程中呈现翅二型性。营养状况和虫口密度等外界条件都会刺激孤雌蚜后代从无翅型态转化为有翅型态。近年来研究表明,微小RNA（microRNA,mirNA）在有翅和无翅个体中存在差异表达,并参与蚜虫翅二型性分化。课题组于前期研究... 详细信息

孤雌蚜在发育过程中呈现翅二型性。营养状况和虫口密度等外界条件都会刺激孤雌蚜后代从无翅型态转化为有翅型态。近年来研究表明,微小RNA（microRNA,mirNA）在有翅和无翅个体中存在差异表达,并参与蚜虫翅二型性分化。课题组于前期研究中预测到mir-92a-1-p5的靶标基因可能为飞行肌flightin基因,但它们参与蚜虫翅发育的分子机制尚不清楚。为进一步研究mirNA及其靶基因在蚜虫翅发育过程的调控机制,本研究以豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）为研究对象,首先利用纳米载体介导的RNA干扰（RNAi）方法,筛选mirNA的模拟物、抑制剂及编码基因双链RNA（double strandRNA,dsRNA）导入蚜虫的最佳方式。其次在豌豆蚜个体中干涉mir92a-1-p5的靶标基因flightin,验证其对蚜虫翅发育的影响。最后在蚜虫个体中干涉和过表达mir-92a-1-p5,检测其对靶基因flightin的调控及对蚜虫翅发育的影响,探索mirNA参与蚜虫翅型发育的分子机制。主要研究结果如下:1.mirNA靶基因验证。成功构建flightin-CDS的过表达载体pmir Glo[flightin-CDS]与flightin-CDS-mutant的过表达载体pmir Glo[flightin-CDS-mutant]。在HEK293细胞系中,使用双荧光素酶报告系统检测mir-92a-1-p5与靶标基因flightin的互作关系。结果表明,共转染pmir Glo[flightin-CDS]过表达载体与mir-92a-1-p5模拟物后,细胞荧光素酶活性与共转染pmir Glo-[flightin-CDS-mutant]过表达载体和mir-92a-1-p5模拟物相比下降43.3%,差异达极显著水平。表明flightin是mir-92a-1-p5的真实靶标。2.编码基因dsRNA导入豌豆蚜个体的最佳方式。选择蚜虫表皮蛋白相关基因CHS2,肠道特异表达基因Vha Ac、Gut-specific水通道蛋白基因Wsa、组成型表达基因METTL14作为验证对象,在4龄蚜虫中注射不同浓度dsRNA,实时荧光定量pCR（q RT-pCR）检测干涉效果。结果发现当dsRNA浓度为50 ng/μL时,CHS2相对表达量下降47.1%,差异达极显著水平。当dsRNA浓度为50 ng/μL与200 ng/μL时,METTL14相对表达量分别下调79.9%与80.9%,差异达极显著水平。结合二者的干涉效果,后续以50 ng/μL浓度干涉Vha AC39基因和Wsa基因。结果显示,Vha AC39相对表达量下降53.4%,Wsa基因无显著干涉效果。综上,编码基因RNAi导入蚜虫个体的最佳浓度于50 ng/μL较适宜。随后,将4个编码基因的dsRNA以50 ng/μL浓度注射4龄无翅若虫后于6个不同时间点取样,q pCR法检测其相对表达量,结果发现与对照注射EGFp dsRNA的个体相比,注射CHS2、METTL14、Vha AC39dsRNA后,3个基因相对表达量均在注射后48 h下调最显著。而Wsa基因在注射后60 h下调最显著。表明dsRNA发挥干涉作用最佳时间在注射dsRNA后48 h至60 h。3.mirNA导入蚜虫的最佳方式。通过个体注射、饲喂、纳米材料介导三种不同形式将mir-92a-1-p5抑制剂导入4龄无翅若虫体内,筛选mirNA导入豌豆蚜体内的最佳方式。结果发现,由于蚜虫特殊的体壁结构,直接刺破体壁容易致使蚜虫体液大量溢出而死亡,不能作为注射方法使用。以饲喂的形式将2μM的mir-92a-1-p5抑制剂介导进4龄无翅若虫体内48 h时mirNA表达量下调56.5%,达显著水平。以纳米材料/变性剂携带的形式将mir-92a-1-p5抑制剂介导进豌豆蚜后发现,mir-92a-1-p5表达量显著下调83%,达极显著水平。因此,纳米材料/变性剂携带为mirNA导入蚜虫的最佳方式。通过将不同浓度的mir-92a-1-p5模拟物与抑制剂分别注射4龄有翅与无翅若虫个体,对mirNA导入蚜虫的最适浓度进行筛选。结果表明,mir-92a-1-p5模拟物注射有翅4龄若虫后,mirNA显著上调。而将mir-92a-1-p5抑制剂注射4龄无翅若虫后,只在160 ng/μL时mirNA相对表达量显著下调,差异达极显著水平。由此推测mir-92a-1-p5抑制剂在体内发挥干涉效果的最佳浓度为160 ng/μL。综合以上结果,以纳米材料介导的形式将160ng/μL浓度的mirNA模拟物和抑制剂导入豌豆蚜虫体内的效果最佳。4.翅发育相关基因flightin的功能研究。通过在有翅孤雌蚜中使用纳米材料介导的dsRNA注射法干涉flightin基因的表达,从蚜虫翅表型变化及内部组织形态变化中探索其参与翅发育的机制。首先检测不同时间点dsRNA干涉效果,结果发现,在4

关键词：豌豆蚜 mir-92a-1-p5 有翅型

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