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Amphibian-derived peptide homodimer OA-GL17d promotes skin wound regeneration through the mir-663a/TGF-β1/Smad axis

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Burns & Trauma 2022年第1期10卷 416-431页

作者： Yue Zhang Ying Wang Lin Zeng Yixiang Liu Huiling Sun Shanshan Li Siyu Wang Longjun Shu Naixin Liu Saige Yin Junsong Wang Dan Ni Yutong Wu Ying Yang Li He Buliang Meng Xinwang Yang Department of Anatomy and Histology&Embryology Faculty of Basic Medical ScienceKunming Medical UniversityKunming 650500YunnanChina Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources&Key Laboratory of Natural Products Synthetic Biology of Ethnic Medicinal Endophytes State Ethnic Affairs Commission&Ministry of EducationSchool of Ethnomedicine and EthnopharmacyYunnan MinZu UniversityKunming 650504YunnanChina Endocrinology Department of Affiliated Hospital of Yunnan University Kunming 650021YunnanChina Institutional Center for Shared Technologies and Facilities of Kunming Institute of Zoology Chinese Academy of SciencesKunming 650223YunnanChina Department of Dermatology First Affiliated Hospital of Kunming Medical UniversityKunming650500YunnanChina

Background:Amphibian-derived peptides exhibit considerable potential in the discovery and development of new therapeutic interventions for clinically challenging chronic skin wounds.MicroRNAs(mirNAs)are also considered promising targets for the development of effective therapies against skin wounds.However,further research in this field is anticipated.This study aims to identify and provide a new peptide drug candidate,as well as to explore the underlying mirNA mechanisms and possible mirNA drug target for skin wound healing.Methods:A combination of Edman degradation,mass spectrometry and cDNA cloning were adopted to determine the amino acid sequence of a peptide thatwas fractionated from the secretion of Odorrana andersonii frog skin using gel-filtration and reversed-phase high-performance liquid chromatography.The toxicity of the peptide was evaluated by Calcein-AM/propidium iodide(PI)double staining against human keratinocytes(HaCaT cells),hemolytic activity against mice blood cells and acute toxicity against mice.The stability of the peptide in plasma was also evaluated.The prohealing potency of the peptide was determined by MTS,scratch healing and a Transwell experiment against HaCaT cells,full-thickness injury wounds and scald wounds in the dorsal skin of mice.mirNA transcriptome sequencing analysis,enzyme-linked immunosorbent assay,real-time polymerase chain reaction and western blotting were performed to explore the molecular mechanisms.Results:A novel peptide homodimer(named OA-GL17d)that contains a disulfide bond between the 16th cysteine residue of the peptide monomer and the sequence‘GLFKWHPRCGEEQSMWT’was identified.Analysis showed that OA-GL17d exhibited no hemolytic activity or acute toxicity,but effectively promoted keratinocyte proliferation and migration and strongly stimulated the repair of full-thickness injury wounds and scald wounds in the dorsal skin of mice.Mechanistically,OA-GL17d decreased the level of mir-663a to increase the level of transforming growth factor-β1(TGF-β1)and activate the

关键词： MicroRNA mir-663a Wound healing Peptide Amphibian Human keratinocytes OA-G17d Chronic wound Skin Transforming growth factor-β1 Smad

LncRNA C9orf139 can regulate the growth of pancreatic cancer by mediating the mir-663a/Sox12 axis

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World Journal of Gastrointestinal Oncology 2020年第11期12卷 1272-1287页

作者： Jin-Nian Ge Di Yan Chun-Lin Ge Min-Jie Wei Department of General Surgery The First Affiliated Hospital of China Medical UniversityShenyang 110001Liaoning ProvinceChina Intensive Care Unit The Central Affiliated Hospital of Shenyang Medical CollegeShenyang 110024Liaoning ProvinceChina Department of Pharmacology School of PharmacyChina Medical UniversityShenyang 110122Liaoning ProvinceChina

BACKGROUND Recent studies have proved the important role of many oncogenic long noncoding RNAs(lncRNAs) in the progression of pancreatic cancer, but little is known about the mechanisms of tumor suppression in pancreatic cancer.AIM To evaluate the function of tumor suppressor lncRNA C9orf139 in pancreatic cancer progression and to study the underlying mechanism.METHODS We assigned 54 patients with pancreatic ductal adenocarcinoma treated at our hospital to the patient group and 30 normal subjects undergoing physical examination to the control group. RT-qPCR was used to measure the relative expression of C9orf139 in the tissue and serum of patients, in an attempt to investigate the prognostic value of C9orf139 in pancreatic cancer patients. The luciferase reporter gene assay was performed to determine the interaction between C9orf139 and mir-663 a. The biological function of C9orf139 was assessed by in vitro assays and in vivo subcutaneous tumor formation tests in animal models. To figure out the molecular mechanism of C9orf139 to act on mir-663 a/Sox12, RNA pull-down, Western blot assay, RNA immunoprecipitation assay, and co-immunoprecipitation assay were performed.RESULTS C9orf139 level significantly increased in the tissue and serum of patients, which had clinical diagnostic value for pancreatic cancer. Patients with high C9orf139 expression had a higher risk of progressing to stage Ⅲ + Ⅳ, lymph node metastasis, and poor differentiation. Cox regression analysis suggested that C9orf139, tumor-node-metastasis stage, and lymph node metastasis were independent prognostic factors in patients. The underlying mechanism of C9orf139 was that it promoted the growth of pancreatic cancer cells by modulating the mir-663 a/Sox12 axis.CONCLUSION C9orf139 is highly expressed in pancreatic cancer, qualified to be used as a potential diagnostic and prognostic marker for pancreatic cancer. Its promotion of pancreatic cancer cell growth is achieved by mediating the mir-663 a/Sox12 axis.

关键词： C9orf139 mir-663a Sox12 Pancreatic cancer Prognosis Tumor formation in nude mice

外泌体介导的mir-663a通过调控TGF-β1/Smad信号通路影响结肠癌细胞侵袭和迁移

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中国老年学杂志 2023年第17期43卷 4313-4317页

作者：任俊宇周锐泽雷梓许宁黄凤昌李文亮昆明医科大学第一附属医院肿瘤科云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院病理科云南昆明650032

目的探讨外泌体介导的mir-663a通过调控转化生长因子(TGF)-β1/Smad信号通路对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响。方法从人骨髓间充质干细胞(BMSC)培养液上清中分离外泌体,透射电子显微镜观察外泌体结构,Western印迹检测外泌体中CD63、CD81... 详细信息

目的探讨外泌体介导的mir-663a通过调控转化生长因子(TGF)-β1/Smad信号通路对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响。方法从人骨髓间充质干细胞(BMSC)培养液上清中分离外泌体,透射电子显微镜观察外泌体结构,Western印迹检测外泌体中CD63、CD81蛋白表达;将mir-NC、mir-663a mimics分别转染于外泌体,并分组为:EXO组(未转染的外泌体)、EXO-mir-NC组、EXO-mir-663a组,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各组外泌体中mir-663a的表达;将上述各组外泌体分别与SW480细胞共培养,并分别命名为SW480+EXO组、SW480+EXO-mir-NC组、SW480+EXO-mir-663a组,在SW480+EXO-mir-663a组中加入TGF-β1/Smad信号通路激活剂SRI-011381,命名为SW480+EXO-mir-663a+SRI组,另取SW480细胞记为SW480组作为对照,激光共聚焦显微镜观察SW480细胞内吞外泌体;Transwell实验检测各组细胞的侵袭与迁移;Western印迹检测各组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达。结果透射电子显微镜观察到BMSC细胞的外泌体均呈现出直径为30~100 nm的囊泡状结构,Western印迹结果表明,CD63和CD81蛋白在BMSC细胞的外泌体中高表达,而在细胞裂解液中几乎不表达;EXO组中mir-663a的表达水平显著高于BMSC细胞(Pmir-NC组比较,EXO-mir-663a组中mir-663a的表达水平显著升高(Pmir-NC组比较,SW480+EXO-mir-663a组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达进一步显著降低(Pmir-663a+SRI组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达显著高于SW480+EXO-mir-663a组(Pmir-663a通过抑制TGF-β1/Smad信号通路来抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移。

关键词：外泌体 mir-663a 结肠癌转化生长因子β1/Smad信号通路细胞侵袭细胞迁移

夏枯草通过mir-663a调控ILK对BRAF阳性甲状腺乳头状癌细胞侵袭的影响

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中国老年学杂志 2022年第11期42卷 2761-2765页

作者：陈红跃武红园娄永庆杨萌萌栗粟河南省中医院甲状腺乳腺科河南郑州450000 河南中医药大学第二临床医学院

目的探讨夏枯草(PV)对鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)阳性甲状腺乳头状癌细胞侵袭的影响及分子机制。方法用浓度0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml PV培养TPC-1细胞,作为不同浓度PV组,其中2.0 mg/ml PV组为PV组;不作任何处理的细胞作为对... 详细信息

目的探讨夏枯草(PV)对鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)阳性甲状腺乳头状癌细胞侵袭的影响及分子机制。方法用浓度0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml PV培养TPC-1细胞,作为不同浓度PV组,其中2.0 mg/ml PV组为PV组;不作任何处理的细胞作为对照(Control)组。将anti-mir-con、anti-mir-663a、整合素连接激酶(ILK)过表达质粒转染至TPC-1细胞中,再用2.0 mg/ml PV处理,记为PV+anti-mir-con组、PV+anti-mir-663a组、PV+ILK组。细胞计数试剂盒(CCK)-8检测细胞增殖活力;Transwell检测细胞侵袭;Western印迹检测基质金属蛋白酶(MMP)-9、血管内皮生长因子(VEGF)、ILK蛋白表达;实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测mir-663a和ILK mRNA表达水平;双荧光素酶报告实验验证mir-663a和ILK的靶向关系。结果与Control组细胞活力比较,0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml PV组均显著降低(Pmir-663a表达水平显著降低,ILK mRNA和蛋白表达水平均显著升高(Pmir-con组相比,mir-663a组转染野生型表达载体WT-ILK的TPC-1细胞荧光素酶活性显著降低(Pmir-663a表达水平显著升高,ILK mRNA和蛋白表达水平显著降低(均Pmir-con组相比,PV+anti-mir-663a组mir-663a表达水平显著降低,ILK mRNA和蛋白表达水平显著升高(Pmir-663a组和PV+ILK组细胞活力显著升高,侵袭细胞数、MMP-9、VEGF表达水平均显著升高(Pmir-663a进而下调ILK抑制BRAF阳性PTC细胞侵袭。

关键词：夏枯草 mir-663a 整合素连接激酶甲状腺乳头状癌侵袭

两栖动物来源的多肽二聚体OA-GL17d通过mir-663a/TGF-β1/Smad轴促进皮肤损伤修复

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两栖动物来源的多肽二聚体OA-GL17d通过miR-663a/TGF-β1/Smad轴...

作者：张悦昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]皮肤作为人体最大的器官,极易受到来自外环境的物理、化学以及生物因素损伤。皮肤伤口不仅给患者带来身体上的痛苦,而且给社会带来沉重的经济负担,如何快速修复受损皮肤是一个重要的临床问题。当前常用的治疗手段包括生长因子、... 详细信息

[目的]皮肤作为人体最大的器官,极易受到来自外环境的物理、化学以及生物因素损伤。皮肤伤口不仅给患者带来身体上的痛苦,而且给社会带来沉重的经济负担,如何快速修复受损皮肤是一个重要的临床问题。当前常用的治疗手段包括生长因子、组织工程、小分子化合物以及抗生素等,但由于其储存要求高、稳定性差、合成获取困难以及容易造成瘢痕增生等缺点限制了它们的实用性,因此,开发新的皮肤创伤治疗手段、发现新的治疗靶标对干预皮肤损伤修复与再生发展具有一定的研究意义。两栖动物来源活性肽因为其活性强、特异性高、毒副作用小,受到了研究人员的关注,本研究主要对两栖动物来源的天然同源多肽二聚体OA-GL17d的结构、功能和机制进行一定的探索,以期为新型促皮肤创面愈合药物的发展提供新的多肽分子和机制解析。[方法]从野外捕捉成年的云南臭蛙并采集其皮肤分泌物,通过分离纯化并从中鉴定促修复活性多肽,通过质谱、Edman降解、cDNA文库等方法确定该肽的氨基酸序列,然后商业合成了高纯度样品。通过Calcein-AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂检测该肽在体外的毒性,通过小鼠腹腔注射方式检测肽在体内的毒性,通过与小鼠红细胞共孵育检测该肽的溶血活性。通过MTS实验检测该肽对人永生化角质形成细胞（HaCaT）的增殖活性,通过细胞划痕实验和Transwell实验检测了其对HaCaT的迁移活性,并检测了多肽对小鼠全皮层损伤皮肤和小鼠烫伤皮肤的促修复效果。为了继续探索促创伤修复的可能机制,我们进行了 HaCaT细胞的mirNA转录组测序分析,选择显著差异表达的mirNA进行结果验证,通过RT-PCR和ELISA检测多肽调控mirNA与靶基因,进而通过MTS和细胞划痕实验进一步检测mirNA在创伤修复中发挥的功能,最后通过蛋白印迹检测多肽以及mirNA对相关信号通路的影响。[结果]1.通过分离纯化我们成功从云南臭蛙的皮肤分泌物中鉴定出了一种新型天然同源多肽二聚体OA-GL17d分子量为4180.74 Da,其单体为GLFKWHPRCGEEQSMWT,两个单体之间以第16位半胱氨酸残基形成的二硫键连接;2.通过序列比对,我们发现“GLFKWHPRCGEEQSMWT”序列与NCBI数据库中报道的多肽没有明显的结构相似性,因此被认为是一个新的多肽,OA-GL17d前体的整体结构与蛙类其他肽类似,包括信号肽、酸性片段、酶切位点“KR”和成熟肽;3.OA-GL17d（0.5 nM、5 nM和50 nM）对HaCaT细胞无细胞毒性,在体外,OA-GL17d在100 μg/mL、500 μg/mL和1 mg/mL剂量下对小鼠红细胞没有明显的溶血活性,而在小鼠腹腔注射100μg/kg、500 μg/kg、1 mg/kg剂量的OA-GL17d也没有造成急性死亡;4.OA-GL17d浓度依赖性促进HaCaT细胞增殖、划痕修复和细胞迁移;5.OA-GL17d显著促进了小鼠全皮层和伤口愈合和小鼠烫伤伤口愈合,通过HE染色发现相比模型组,OA-GL17d加速了伤口再上皮化和肉芽组织的形成;6.HaCaT细胞mirNA转录组测序结果分析显示OA-GL17d显著下调mir-663a的表达,我们通过RT-PCR验证了这个结果;7.通过将mir-663a模拟物和抑制物转染到HaCaT细胞中后,通过RT-PCR发现mir-663a抑制物组显著促进了转化生长因子（TGF-β1）的表达,而mir-663a模拟物组得到了相反的结果,而通过RT-PCR和ELISA结果发现OA-GL17d在HaCaT细胞中显著促进了 TGF-β1的表达;8.通过MTS和细胞划痕实验发现,mir-663a抑制物组显著促进了细胞的增殖和划痕修复,而mir-663a模拟物组得到了相反的结果;9.通过WB实验结果发现,OA-GL17d激活了 Smad信号通路,mir-663a抑制物组也激活了 Smad信号通路,而mir-663a模拟物组则得到了相反的结果。[结论]从云南臭蛙皮肤分泌物中鉴定出一种新型天然同源多肽二聚体OA-GL17d无急性毒性和溶血活性,其促进细胞的迁移和增殖并在HaCaT中通过下调mir-663a的表达上调靶基因TGF-β1的表达,激活下游TGF-β1/Smad信号通路,进而加速皮肤伤口的再上皮化和肉芽组织组织的形成。这些结果提示OA-GL17d可能是一种有前景的促进皮肤创伤修复候选药物。更重要的是,这些结果强调了外源性多肽作为分子探针在探索竞争性内源性RNA（ceRNA）机制中的重要性,并提示mir-663a可能是促进皮肤损伤修复的潜在靶点。

关键词： mir-663a 伤口愈合多肽两栖动物人角质形成细胞

mir-663a在炎症和肿瘤中的表达及作用机制

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生命的化学 2020年第11期40卷 2000-2005页

作者：周文倩林琳王啟华王俊杰三峡大学附属仁和医院三峡大学妇科肿瘤研究所宜昌443002

MicroRNAs(mirNAs)是一类长度为22 nt左右的高度保守的内源性小分子非编码RNA,广泛表达于动物、植物等真核细胞生物内,通过影响mRNAs的稳定性和翻译,参与多细胞生物基因表达的转录后调控。mir-663a作为mirNAs中的一员,对生物的生长,发育... 详细信息

MicroRNAs(mirNAs)是一类长度为22 nt左右的高度保守的内源性小分子非编码RNA,广泛表达于动物、植物等真核细胞生物内,通过影响mRNAs的稳定性和翻译,参与多细胞生物基因表达的转录后调控。mir-663a作为mirNAs中的一员,对生物的生长,发育,衰老,细胞增殖、分化、凋亡起到调控作用,甚至与恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关。现就mir-663a在多种疾病中的表达及调控机制作一综述。

关键词： mir-663a 肿瘤免疫炎症

Lnc-C18orf26-1/mir-663a/TGF-β/Smad信号通路在肝星状细胞中的作用及黄芪汤抑制肝星状细胞活化的机理研究

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Lnc-C18orf26-1/miR-663a/TGF-β/Smad信号通路在肝星状细胞中的...

作者：董本生上海中医药大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在探明lnc-C18orf26-1/mir-663a/TGF-β3/Smad信号通路在肝星状细胞（HSC）活化中作用及分子机制,并以此阐释黄芪汤（HQT）治疗肝纤维化的作用机理。方法:1.TGF-β1诱导HSC-LX2活化;2.实时定量PCR（RT-qPCR）技术,检测mir-... 详细信息

目的:本研究旨在探明lnc-C18orf26-1/mir-663a/TGF-β3/Smad信号通路在肝星状细胞（HSC）活化中作用及分子机制,并以此阐释黄芪汤（HQT）治疗肝纤维化的作用机理。方法:1.TGF-β1诱导HSC-LX2活化;2.实时定量PCR（RT-qPCR）技术,检测mir-663a、lncRNA及相关基因的表达;3.MTS法检测细胞增殖情况;4.LncRNA芯片检测HSC中lncRNA和mRNA表达情况;5.生物信息学方法预测mir-663a调控的潜在靶基因和相关lncRNA;6.蛋白质印迹法（Western Blot）检测相关基因蛋白表达情况;7.荧光素报告基因实验验证lnc-C18orf26-1与mir-663a间是否存在直接关联;8.网络药理学预测HQT抗肝纤维化的分子机制。结果:1.与正常肝细胞（LO2）比较,HSC中mir-663a呈低表达,TGF-β1诱导HSC活化后mir-663a表达量减少。2.过表达mir-663a能抑制HSC增殖,下调TGF-β1诱导活化的HSC中α-SMA和COLlA2蛋白表达,并能抑制TGF-β1/TGF-βR/Smads信号通路。3.Lnc-C18orf26-1在TGF-β1诱导活化后HSC中表达上调,竞争性结合mir-663a。敲低lnc-C18orf26-1能够有效抑制HSC增殖/活化,下调α-SMA 和 COL1A2 表达,并阻滞 mir-663a 介导的 TGF-β1/Smads。4.HQT 能抑制HSC增殖,且呈浓度依赖性;HQT能促进肝正常细胞增殖,但中低浓度的效果较佳。HQT能促进TGF-β1诱导活化后HSC中TGF-β1对mir-663a的表达且呈浓度依赖性;HQT亦能抑制TGF-β1诱导活化后HSC中lnc-C18orf26-1的表达,低浓度抑制效果最佳。HQT明显抑制活化后HSC中α-SMA、COL1A2、p-Smad2/3及TGF-βRI的表达。mir-663a抑制剂能逆转HQT对TGF-β1诱导HSC活化的抑制作用。5.网络药理学预测分析研究显示:HQT抗肝纤维化的主要作用靶点包括TERT、MET和TNF、TGF-β和MMPs等炎症因子;能影响受体、转录因子、酶和酶调节剂等功能性分子;调控癌症通路、癌症mirNAs、蛋白聚糖和PI3K-Akt等通路;影响激酶活性、NO合成、细胞增殖、细胞迁移、信号转导、DNA复制、磷酸化等生物进程。体现了“HQT抗肝纤维化”药理作用是通过多靶点和多途径的作用特点实现。同时,提示我们肝纤维化可能与TERT基因突变有关,且HQT有利于基因修复。结论:TGF-β1诱导HSC活化后mir-663a低表达,lnc-C18orf26-1高表达,lnc-C18orf26-1作为mir-663a的ceRNA而调控TGF-β1和TGF-βRI的表达而激活HSC。HQT能抑制 lnc-C18orf26-1 而促进 mir-663a 表达,并调控 TGF-β1/TGF-βRI/p-Smad2轴来抑制HSC活化,这或许是其抑制肝纤维化的主要作用机理之一。

关键词： mir-663a Lnc-C18orf26-1 肝星状细胞 TGF-β/Smad信号通路黄芪汤分子机制