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mir-3940-5p对硝苯地平作用下的牙龈干细胞增殖及成骨分化的功能影响及机制研究

MiR-3940-5p对硝苯地平作用下的牙龈干细胞增殖及成骨分化的功能...

引用

作者：韩笑天津医科大学

学位级别：硕士

目的:药物性牙龈增生(Drug-induced gingival overgrowth,DIGO)是因长期服用某种药物而引起的牙龈增生和体积的增大。但由硝苯地平(nifedipine,NIF)介导的DIGO的发生机制尚不清楚。有研究表明,NIF介导的DIGO中,细胞的增殖及细胞周期的... 详细信息

目的:药物性牙龈增生(Drug-induced gingival overgrowth,DIGO)是因长期服用某种药物而引起的牙龈增生和体积的增大。但由硝苯地平(nifedipine,NIF)介导的DIGO的发生机制尚不清楚。有研究表明,NIF介导的DIGO中,细胞的增殖及细胞周期的失衡可能与疾病的发生有关。随着mirNA的发现,越来越多的研究证明mirNA可以调控细胞的增殖、凋亡、周期。本研究初步探讨mir-3940-5p在NIF刺激牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)中的功能及机制。方法:1.临床上采集成人健康的牙龈,采用酶消化培养法体外分离培养GMSCs。2.构建稳定转染的细胞系:利用慢病毒转染的方法转染GMSCs,获得实验组过表达mir-3940-5p(mir-3940-5p mimics)及空载体对照组(Consh)。通过real-time RT-pCR法检测mir-3940-5p在转录水平的表达,测定转染效率,确定过表达的效果。3.采用流式细胞术-CFSE法检测对照组(Consh)及实验组(mir-3940-5pmimics)在0ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml浓度的NIF刺激48h后的增殖情况。4.采用流式细胞术-pI法检测对照组(Consh)及实验组(mir-3940-5p mimics)在NIF最适刺激浓度下刺激48h后的细胞周期水平的变化,并应用real-timeRT-pCR及Western Bolt技术检测细胞周期相关基因的表达。5.检测mir-3940-5p对GMSCs定向分化功能的影响。采用成骨/成牙分化诱导培养液,在体外条件下对稳定转染了mir-3940-5p mimics及Consh的GMSCs进行成骨/成牙向分化诱导,观察成骨/成牙分化的指标,包括碱性磷酸酶活性测定,茜素红染色及钙离子浓度测定,并应用real-time RT-pCR检测成骨过程中关键转录因子DLX5(Distal-Less Homeobox 5)在成骨/成牙分化中的影响,以及检测成骨/成牙分化的标志物牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSpp)、牙本质基质蛋白1(Dentin matrix acidic phosphoprotein 1,DMp1),以观察对成骨/成牙分化的影响。结果:1.流式细胞术-CFSE法检测增殖结果表明:在NIF浓度为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml时对GMSCs均有促进增殖的作用。在不同浓度NIF(0ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml)刺激下,过表达mir-3940-5p均可抑制GMSCs的增殖。2.流式细胞术-pI法检测周期结果表明:过表达mir-3940-5p在NIF浓度为0ug/ml、1ug/ml时将GMSCs细胞周期阻滞在G0/G1期。***-time RT-pCR结果显示:过表达mir-3940-5p组,p15,p18和p19在NIF浓度为0ug/ml、1ug/ml时表达均上调,p21仅在NIF浓度为1ug/ml时表达上调。Western Bolt结果显示:在NIF浓度为0ug/ml、1ug/ml时,过表达mir-3940-5p组,CyclinA的表达是上调的,CyclinE的表达是下调的而CDK2及CKD4的表达是无差异的。CyclinD的表达在NIF浓度为0ug/ml时是下调的而在NIF浓度为1ug/ml时是上调的。4.成骨/成牙诱导分化检测结果表明:过表达mir-3940-5p在体外条件下促进GMSCs的成骨/成牙分化。表现为成骨/成牙分化早期指标碱性磷酸酶活性实验组比对照组升高;晚期矿化指标茜素红染色及钙离子定量分析实验组比对照组明显增强;real-time RT-pCR检测结果表明过表达mir-3940-5p在mRNA水平促进GMSCs体外成骨/成牙向分化指标DSpp,DMp1的表达,以及成骨/成牙向分化关键转录因子DLX5的表达也升高。结论:1.不同浓度的NIF对GMSCs均有促进细胞增殖的作用。2.在不同浓度的NIF刺激下,过表达mir-3940-5p抑制GMSCs的细胞增殖。3.过表达mir-3940-5p通过上调p15、p18、p19和CyclinA以及下调CyclinD和CyclinE的表达将GMSCs细胞周期阻滞在GO/G1期;在NIF(1ug/ml)刺激下过表达mir-3940-5p通过上调p15、p18、p19、p21、CyclinA和CyclinD以及下调CyclinE的表达将GMSCs细胞周期阻滞在GO/G1期4.过表达mir-3940-5p体外促进GMSCs成骨/成牙向分化潜能

关键词： mir-3940-5p 牙龈干细胞成骨/牙分化硝苯地平细胞增殖

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E3泛素连接酶CUL7激活NF-κB通路促进胶质瘤恶性进展的机制研究

E3泛素连接酶CUL7激活NF-κB通路促进胶质瘤恶性进展的机制研究

引用

作者：徐建业山东大学

学位级别：硕士

背景与目的:胶质瘤作为颅内恶性肿瘤中最常见的类型,即使经过手术以及放化疗等系统治疗,高级别胶质瘤(WHO Ⅲ-Ⅳ)患者仍然预后极差。Cullin-7(CUL7)是E3泛素连接酶Cullin家族的成员,参与细胞生物学行为的调控。本研究旨在分析CUL7在脑... 详细信息

背景与目的:胶质瘤作为颅内恶性肿瘤中最常见的类型,即使经过手术以及放化疗等系统治疗,高级别胶质瘤(WHO Ⅲ-Ⅳ)患者仍然预后极差。Cullin-7(CUL7)是E3泛素连接酶Cullin家族的成员,参与细胞生物学行为的调控。本研究旨在分析CUL7在脑胶质瘤中的临床意义并探索其促进脑胶质瘤恶性进展的分子机制,并给胶质瘤的靶向治疗提供新的理论依据。资料与方法:1.收集中国脑胶质瘤基因组图谱(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)以及癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中患者的基因测序结果并通过免疫组化获取山东大学齐鲁医院收治的38例胶质瘤患者组织标本的蛋白表达数据;比较不同WHO级别患者的CUL7表达水平。2.汇总患者的性别、KpS评分、年龄、IDH1突变、1p/19q共缺失、TERT表达、ATRX突变、MGMT启动子甲基化以及生存期等临床信息及分子遗传特征。使用χ2检验的统计学方法,对临床信息及CUL7表达量进行相关性分析,生存分析使用Kaplan-Meier以及COX比例风险回归模型实现。3.利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)研究CUL7促癌的可能通路。4.在胶质瘤细胞系U87MG以及U251中使用siRNA或慢病毒敲低CUL7,使用GV141-CUL7质粒进行CUL7的过表达。5.应用 5-ethynyl-2’-deoxyuridine(EdU)、流式细胞术和 Transwell 实验,在体外对细胞功能进行鉴定,以评估其细胞增殖、侵袭以及迁移能力。6.利用裸鼠构建颅内原位成瘤模型,通过生存分析以及小动物成像的方法探究敲减CUL7对胶质瘤成瘤及恶性进展的影响。7.免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,co-Ip)和 Western blot 检测 CUL7 与 MST1的相互作用关系对NF-κB信号通路的激活机制。8.使用Targetscan网站推定CUL7上游直接抑制分子mir-3940-5p;并使用双荧光素酶报告基因等实验对两者的相互关系进行验证。9.应用EdU、流式细胞术和Transwell等方法探究mir-3940-5p在胶质瘤中的生物学作用。结果:1.在CGGA及TCGA数据库患者中,高级别胶质瘤CUL7的表达增加,在38例山东大学齐鲁医院收治患者中,CUL7表达量同样随着WHO级别的升高而增加。2.在617例TCGA数据库中的患者中,CUL7表达量高低与患者的年龄、KpS评分、IDH1突变、MGMT启动子甲基化、lp/19q共缺失、TERT表达以及ATRX突变相关,而与性别无相关关系。单因素COX 比例风险回归模型发现,高表达CUL7的患者存在高风险,而多因素COX比例风险回归模型分析同样发现高表达CUL7的患者存在高风险。***分析发现CUL7与胶质瘤的发生与进展密切相关。4.针对胶质瘤细胞系U87MG以及U251的体外实验,敲低CUL7显著抑制胶质瘤的增殖,侵袭以及迁移能力;过表达CUL7促进了胶质瘤的增殖,侵袭以及迁移能力。***分析显示CUL7与NF-κB通路正相关,Western blot结果显示CUL7促进胶质瘤细胞NF-κB通路的激活。6.通过免疫共沉淀实验,我们发现CUL7与MST1相互结合,进一步导致泛素介导的MST1蛋白降解,从而促进NF-κB通路激活。7.分别将阴性对照及敲低CUL7的U87MG细胞系种入裸鼠颅内后,发现敲低CUL7后肿瘤进展受到了抑制,并且动物生存期延长。***-3940-5p可以直接结合CUL7的3’UTR区域导致CUL7表达量降低。***-3940-5p的过表达抑制了胶质瘤的增殖、侵袭以及迁移能力。结论:1.高表达CUL7与胶质瘤的级别正相关,并提示患者预后不佳。***7通过促进MST1泛素化降解进一步激活NF-κB通路。***7在促进脑胶质瘤恶性进展中发挥重要作用,可能是治疗脑胶质瘤的重要靶点。

关键词：脑胶质瘤 CUL7 MST1 NF-κB信号通路 mir-3940-5p

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