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mir-378a-5p下调CDK1抑制结直肠癌的恶性进程

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miR-378a-5p下调CDK1抑制结直肠癌的恶性进程

作者：张洁玲皖南医学院

学位级别：硕士

目的:检测mir-378a-5p在结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）组织和细胞中的表达情况,并探究其对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响和相关分子机制。方法:采用qRT-pCR检测22对结直肠癌组织及其癌旁组织和结直肠癌细胞系中mir-378a-5p的表... 详细信息

目的:检测mir-378a-5p在结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）组织和细胞中的表达情况,并探究其对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响和相关分子机制。方法:采用qRT-pCR检测22对结直肠癌组织及其癌旁组织和结直肠癌细胞系中mir-378a-5p的表达,分别采用CCK-8实验、EDU实验、集落形成实验、伤口愈合实验、transwell实验、流式细胞术等评估细胞的增殖、迁移能力和凋亡、周期情况;结合裸鼠肿瘤形成实验评估mir-378a-5p在体内、体外对结直肠癌恶性进程的影响。结合数据库和荧光素酶报告基因检测确定CDK1为mir-378a-5p下游靶基因,TCGA数据库、q RT-pCR、免疫组织化学染色和细胞功能实验评估CDK1在结直肠癌中的表达及作用。功能回复实验验证CDK1上调是否能恢复mir-378a-5p过表达对结直肠癌细胞的影响。结果:1.mir-378a-5p在CRC组织和细胞中低表达:（1）TCGA数据库显示,与癌旁组织相比,结直肠癌组织中的mir-378a-5p表达下调（p＜0.0001）。（2）q RT-pCR显示22对癌组织中mir-378a-5p表达明显低于其癌旁组织（p＜0.001）。（3）同时q RT-pCR结果显示,结直肠癌细胞系中mir-378a-5p的表达明显低于正常肠上皮细胞系（p＜0.001）。2.mir-378a-5p抑制CRC细胞的增殖和迁移能力:（1）EDU实验显示,与对照组相比,mir-378a-5p表达上调时增殖细胞减少,mir-378a-5p表达下调时增殖细胞增多（p＜0.01）。（2）伤口愈合实验显示,mir-378a-5p过表达组48h的划痕较对照组宽,mir-378a-5p高表达组48h的划痕较对照组窄（p＜0.01）。（3）同时Transwell实验显示,与对照组相比,mir-378a-5p过表达抑制细胞迁移,mir-378a-5p敲减则促进了细胞迁移（p＜0.001）。3.mir-378a-5p促进结直肠癌细胞凋亡并在小鼠体内抑制瘤组织生长:（1）流式细胞术结果显示,与对照组相比,mir-378a-5p表达上调组细胞凋亡比率增加,而mir-378a-5p表达下调组细胞凋亡比率降低（p＜0.01）。（2）使用慢病毒构建mir-378a-5p过表达裸鼠成瘤模型,结果显示mir-378a-5p lentirvius组肿瘤体积、重量均小于control lentirvius组（p＜0.01）。4.CDK1是mir-378a-5p的下游靶基因并在结直肠癌组织和细胞中表达上调:（1）使用数据库Target Scan和RNAhybrid预测mir-378a-5p下游基因,发现mir-378a-5p和CDK1存在结合序列。进一步Luciferase实验显示,在CDK1 3’UTR野生型中,和对照组相比,过表达mir-378a-5p后荧光素酶活性显著降低（p＜0.01）,而在突变型中与对照组无明显差异。（2）Western blot实验显示,和对照组相比,CDK1蛋白表达在mir-378a-5p过表达后降低,在mir-378a-5p敲减后表达上调（p＜0.05）。（3）q RT-pCR和TCGA数据库均显示CDK1在CRC组织中表达上调（均p＜0.01）。（4）Kaplan-Meier生存分析显示,CDK1表达上调的CRC患者的OS明显低于CDK1表达下调的患者（p＜0.05）。5.CDK1促进结直肠癌细胞的增殖和迁移:（1）CCK8实验显示,和各自对照组相比,CDK1过表达增强了细胞的增殖能力,CDK1敲减减弱了细胞增殖能力（p＜0.001）。（2）Transwell实验显示,和各自对照组相比,CDK1上调增强了细胞的迁移能力,反之细胞迁移能力下降（p＜0.001）。6.CDK1上调恢复了mir-378a-5p过表达对结直肠癌细胞恶性进程的抑制作用:（1）Western blot实验显示,单独过表达mir-378a-5p后CDK1蛋白水平较对照组明显下降,同时过表达mir-378a-5p和CDK1后,CDK1蛋白水平与对照组相似（p＜0.05）。（2）克隆形成实验显示,过表达mir-378a-5p后细胞克隆数量较对照组减少,过表达CDK1后克隆数量增多（p＜0.05）,mir-378a-5p和CDK1同时过表达时细胞克隆数量和对照组相似。（3）细胞凋亡和周期检测结果发现mir-378a-5p过表达增加了在G2-M期的细胞数量,同时增加了凋亡细胞数量,而CDK1的上调则导致相反的趋势（p＜0.01）;mir-378a-5p和CDK1的共同上调后的结果趋势与对照组类似。结论:mir-378a-5p在CRC组织和细胞中低表达,能够抑制细胞的增殖和迁移;CDK1在CRC组织和细胞中高表达,能够促进细胞的增殖和迁移。且mir-378a-5p通过下调CDK1在CRC中发

关键词： mir-378a-5p CDK1 结直肠癌细胞增殖细胞迁移

血清mir-378a-5p水平联合微血流成像的超声多模态检查对肝癌疾病进展与微血管侵犯的评估价值

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实用癌症杂志 2023年第10期38卷 1677-1681页

作者：王爱霞张东锋河南省郑州市颐和医院 450000

目的探讨血清mir-378a-5p水平联合微血流成像的超声多模态检查对肝癌疾病(HCC)进展与微血管侵犯(MVI)的评估价值。方法选取HCC患者100例作为研究对象,根据诊断结果分为MVI组(n=60)、非MVI组(n=40)。应用实时荧光定量pCR法检测血清mir-37... 详细信息

目的探讨血清mir-378a-5p水平联合微血流成像的超声多模态检查对肝癌疾病(HCC)进展与微血管侵犯(MVI)的评估价值。方法选取HCC患者100例作为研究对象,根据诊断结果分为MVI组(n=60)、非MVI组(n=40)。应用实时荧光定量pCR法检测血清mir-378a-5p mRNA相对表达量;应用philips彩超诊断仪进行微血流成像的超声多模态检查。分析HCC不同分期血清指标和超声表现差异;将MVI的危险因素进行单因素分析,将甲胎蛋白(AFp)、癌胚抗原(CEA)、mir-378a-5p进行多因素Logistic回归分析,分析血清mir-378a-5p、联合微血流成像的超声多模态检查单独及联合检测对MVI预测价值。结果HCCⅠ期、Ⅱ期、Ⅲ期动脉相、门脉相造影及血清mir-378a-5p水平比较,差异具有统计学意义(p5);单因素分析显示,两组性别、年龄、体质量、肿瘤位置比较,差异无统计学意义(p>0.05);MVI组包膜破损、无包膜、微血流Ⅱ级、Ⅲ级、门脉相高增强、肿瘤不光滑边缘、AFp、CEA、mir-378a-5p、SBp、DBp高于非MVI组,差异具有统计学意义(p5);多因素Logistic回归分析结果显示,血清CEA、微血流分级、mir-378a-5p为发生MVI的独立危险因素(p5);ROC结果显示,血清mir-378a-5p、联合微血流成像的超声多模态检查单独预测MVI的最佳截断点分别为2.655 ng/mL、44.35μg/mL,单独及联合预测MVI预后不良的AUC分别为0.731、0.697、0.852。结论HCC患者不同分期超声表现及血清mir-378a-5p水平不同,且MVI患者血清mir-378a-5p低表达,血清mir-378a-5p联合微血流成像的超声多模态检查对早期MVI检测具有较高诊断价值。

关键词：肝癌疾病微血管侵犯 mir-378a-5p 微血流成像的超声多模态评估价值

mir-378a-5p下调人肝脏星形细胞系LX-2中鞘胺醇激酶1的表达

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首都医科大学学报 2019年第1期40卷 94-100页

作者：祁长波常娜杨琳李丽英首都医科大学细胞生物学系‘肝脏保护与再生调节’北京市重点实验室北京100069

目的预测、筛选并探究是否存在特定的microRNA能够影响人肝脏星形细胞LX-2中鞘胺醇激酶1(sphingosine kinase1,SphK1) mRNA的表达。方法采用生物信息学数据库预测microRNA,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polym... 详细信息

目的预测、筛选并探究是否存在特定的microRNA能够影响人肝脏星形细胞LX-2中鞘胺醇激酶1(sphingosine kinase1,SphK1) mRNA的表达。方法采用生物信息学数据库预测microRNA,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qpCR)检测SphK1 mRNA的表达。结果预测筛选出的mir-378a-5p、mir-92a-2-5p和mir-708-5p中,只有mir-378a-5p能够抑制LX-2中由转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)介导的SphK1 mRNA表达上调这一过程。而在LX-2中转染mir-378a-5p的抑制剂阻断其作用后,SphK1 mRNA的表达上调。结论 mir-378a-5p参与LX-2中Sph K1 mRNA表达的调控,并且能够抑制由TGF-β1介导的SphK1 mRNA表达上调。

关键词： mir-378a-5p 鞘胺醇激酶1 转化生长因子β1

mir-378a-5p调节血管平滑肌细胞增殖和迁移的机制研究

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MiR-378a-5p调节血管平滑肌细胞增殖和迁移的机制研究

作者：刘少燕青岛大学

学位级别：硕士

目的支架治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病是目前常用的方式,但植入支架引发血管壁损伤,内皮功能障碍,血管平滑肌细胞高度分化,血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells)异常的增殖和迁移是导致动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)和支... 详细信息

目的支架治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病是目前常用的方式,但植入支架引发血管壁损伤,内皮功能障碍,血管平滑肌细胞高度分化,血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells)异常的增殖和迁移是导致动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)和支架再狭窄(In-stent stenosis,IRS)发生的重要因素;本研究旨在探究mir-378a-5p在调节血管平滑肌细胞功能的作用和分子机制。方法(1)载脂蛋白E缺失型小鼠(Apolipoprotein E,ApoE-/-)给予高脂喂养构建动脉粥样硬化模型组,健康基础饲料喂养的C57BL/6J小鼠构建对照组,获取两组小鼠的心脏血,应用荧光定量聚合酶链反应(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-pCR)测定两组中mir-378a-5p表达;(2)获取临床支架再狭窄患者和健康个体临床血样,应用RT-pCR测定两个组中mir-378a-5p的表达;(3)培养人血管平滑肌细胞,使用瞬时转染技术,lipo2000转染试剂将mir-378a-5p的过表达物及抑制物转染到VSMCs中并检测表达情况;(4)分别应用Edu(5-Ethynyl-2’-deoxyuridi)和CCK-8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖检测试剂盒来测定血管平滑肌细胞的增殖情况;(5)应用划痕实验和Transwell细胞迁移实验测定血管平滑肌细胞的迁移情况;(6)蛋白印迹法(Western blot,WB)检测细胞中p21和CDK1蛋白的表达;(7)使用TargetScan软件预测靶基因,并通过生物信息学分析探究潜在基因的生物学功能;(8)进行RNA免疫沉淀实验(RNA Immunoprecipitation,RIp)和免疫荧光实验(Immunofluorescence,IF)分析mirNA与蛋白质的相互作用及mirNA与下游靶CDK1的结合特性,定位和表达。结果(1)荧光定量聚合酶链式反应结果显示,mir-378a-5p在动脉粥样硬化小鼠和人支架再狭窄血样中表达均上调,差异有统计学意义(p5);(2)经血小板源性生长因子(platelet Derived Growth Factor,pDGF)刺激的VSMC较NC组mir-378a-5p表达增加,差异有统计学意义(p5);(3)CCK-8实验和EdU实验检测转染mir-378a-5p过表达物24h后,与NC相比,细胞具有更强的增殖能力,差异具有统计学意义(p5);用划痕实验检测对细胞迁移的影响,我们观察到与NC相比mir-378a-5p mimic组显著促进细胞迁移,差异具有统计学意义(p5);(4)抑制CDK1的表达,显示血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力均增加,蛋白印迹法检测显示转染了siCDK1的VSMC表型转化蛋白smMHC2表达下降;(5)CDK1是mir-378a-5p的功能靶标,在免疫荧光实验显示mir-378a-5p mimic转染的VSMC中CDK1表达减低,而mir-378a-5p inhibitor组结果相反,荧光强度增强,差异具有统计学意义(p5);RIp实验示表达mir-378a-5p的质粒富集CDK1的效率比不表达mir-378a-5p组明显提高,差异具有统计学意义(p5);(6)mir-378a-5p作用于CDK1和p21的表达,从而促进VSMC的增殖和迁移。结论mir-378a-5p参与调控VSMCs增殖和迁移;mir-378a-5p通过靶向CDK1/p21信号通路调节VSMC增殖和迁移;mir-378a-5p有预防和治疗动脉粥样硬化和支架再狭窄的的潜能。

关键词： mir-378a-5p 血管平滑肌细胞动脉粥样硬化 CDK1 支架再狭窄

mir-378a-5p抑制鼻咽癌细胞系CNE-1细胞增殖以及肿瘤生长的初步研究（英文）

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现代生物医学进展 2016年第1期16卷 1-6页

作者：吕青武冰黄努努张雅鸥清华大学生命科学学院北京100084 清华大学深圳研究生院广东深圳518055 中国解放军总医院第一附属医院北京100048

目的：mir-378a-5p是一种被认为在多种肿瘤发生过程中具有抑制肿瘤生长的微小RNA。然而mir-378a-5p在鼻咽癌中的作用尚未见报道。因此,本文旨在通过临床样本的mirNA表达谱分析以及细胞学实验从而揭示mir-378a-5p在鼻咽癌肿瘤发生过程中... 详细信息

目的：mir-378a-5p是一种被认为在多种肿瘤发生过程中具有抑制肿瘤生长的微小RNA。然而mir-378a-5p在鼻咽癌中的作用尚未见报道。因此,本文旨在通过临床样本的mirNA表达谱分析以及细胞学实验从而揭示mir-378a-5p在鼻咽癌肿瘤发生过程中的作用。方法与结果：我们通过生物信息学的方法获取了鼻咽癌临床样本中mir-378a-5p的表达信息并通过与正常组织的对比发现mir-378a-5p在鼻咽癌肿瘤组织中表达水平显著降低（p〈0.01）。其次,我们发现高表达mir-378a-5p的鼻咽癌CNE-1细胞增殖速度显著较对照组降低（约40%~50%）。克隆形成实验证实了瞬时转染mir-378a-5p的鼻咽癌CNE-1细胞的克隆形成数量显著减弱。我们通过将稳定表达mir-378a-5p的CNE-1细胞注射到裸鼠体内形成移植瘤并记录肿瘤生长曲线,结果显示mir-378a-5p高表达组的裸鼠移植瘤体积明显较对照组小约50%,肿瘤重量显著降低（对照组0.33 g,处理组0.15 g）。结论：本研究通过对临床样本的分析以及在细胞和动物水平的实验验证揭示了mir-378a-5p具有抑制鼻咽癌肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的作用。

关键词： mir-378a-5p 鼻咽癌细胞增殖

mir-378a-5p促进肝癌细胞增殖和侵袭及其在早期肝癌诊断中的作用

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包头医学院学报 2021年第7期37卷 17-22页

作者：何勇勇方长英张青松宣城职业技术学院内科教研室安徽宣城242000 宣城市中心医院检验科

目的:探讨血清mir-378a-5p表达对早期肝癌诊断价值及其对Huh-7细胞增殖和侵袭影响。方法:应用Real-time pCR检测64例早期肝癌患者和64例常规体检健康志愿者血清中mir-378a-5p表达量,应用受试者工作特征曲线(Receiver operating characte... 详细信息

目的:探讨血清mir-378a-5p表达对早期肝癌诊断价值及其对Huh-7细胞增殖和侵袭影响。方法:应用Real-time pCR检测64例早期肝癌患者和64例常规体检健康志愿者血清中mir-378a-5p表达量,应用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)分析血清mir-17-5p和AFp表达对早期肝癌的筛查效能,t检验分析其与患者临床病理参数的关系。采用pcDNA3.1构建过表达mir-378a-5p质粒(pcDNA-mir-378a-5p),实现Huh-7细胞mir-378a-5p过表达后,运用CCK-8和Transwell实验观察Huh-7细胞增殖和侵袭能力变化。结果:早期肝癌患者血清中mir-378a-5p表达量高于健康人(2.263±0.964 vs 0.936±0.645,t=9.155,p5cm)、肝癌细胞分级较差(Ⅲ级和Ⅳ级)、TNM分期Ⅰb期的早期肝癌患者血清mir-378a-5p表达水平升高(p均5)。ROC分析结果显示血清mir-378a-5p表达预测早期肝癌的曲线下面积为0.868(95%CI:0.806-0.931,p5,其敏感性和特异性为71.9%和91.6%;血清AFp预测早期肝癌的ROC曲线下面积为0.851(95%CI:0.776-0.925,p5,其敏感性和特异性为75%和100%;血清mir-378a-5p联合AFp检测对早期肝癌预测的曲线下面积为0.950(95%CI:0.914-0.986,p52,其敏感性和特异性为81.3%和100%,Z检验显示两者联合检测筛选早期肝癌的效能优于血清mir-378a-5p(Z=2.233,p=0.026)和AFp(Z=2.354,p=0.019)独立检测。CCK-8和Transwell实验结果表明Huh-7细胞mir-378a-5p过表达后其增殖和侵袭能力增强(p均5)。结论:mir-378a-5p在早期肝癌患者血清中显著升高,并促进了肝癌细胞生长和侵袭,与AFp联合检测可有效提高早期肝癌的筛查效果。

关键词： mir-378a-5p 肝癌受试者工作特征曲线增殖侵袭

HucMSC-Ex调控巨噬细胞NLRp3炎症小体修复炎症性肠病的机制研究

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HucMSC-Ex调控巨噬细胞NLRP3炎症小体修复炎症性肠病的机制研究

作者：蔡秀江苏大学

学位级别：硕士

目的:建立人脐带间充质干细胞来源的外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes,hucMSC-Ex)修复葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的小鼠炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的模型,明确巨噬细胞NLRp3炎症小体在hucMSC-Ex缓解小鼠炎症性肠病中的作用,深入探讨hucMSC-Ex通过调控巨噬细胞NLRp3炎症小体延缓细胞焦亡从而修复结肠炎症的作用机制,为临床应用hucMSC-Ex治疗IBD提供新的理论依据。方法:1)HucMSC-Ex的提取与鉴定:收集超离后的胎牛血清培养的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hucMSC)的培养上清液,超速离心法提取hucMSC-Ex,通过透射电镜扫描、纳米颗粒分析和免疫印迹(western blot)检测膜表面蛋白标志物鉴定外泌体。2)采取喂养3%DSS水的方法构建小鼠IBD模型。将BALB/c雄性小鼠随机分配到3组中:NEG组、IBD组、hucMSC-Ex组,其中IBD组与hucMSC-Ex组小鼠饮用3%DSS水,造模期间hucMSC-Ex组小鼠尾静脉注射1 mg hucMSC-Ex。每天对小鼠进行称重并分析疾病活动指数(disease activity index,DAI),于第11天处死所有小鼠,对其进行结肠组织学评分并提取结肠黏膜蛋白及总RNA。苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin staining,H&E)分析小鼠结肠微观结构;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantification pCR,q RT-pCR)检测结肠组织中炎症因子及NLRp3炎症小体相关分子的表达水平;western blot和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测结肠组织中NLRp3炎症小体蛋白的表达水平。3)采用人髓系白血病单核细胞(THp-1)和小鼠原代腹腔巨噬细胞(MpMs)进行体外验证实验,将细胞分为3组:Ctrl组、LpS+NIG组、hucMSC-Ex组。LpS+NIG组和hucMSC-Ex组细胞在脂多糖(lipopolysaccharide,LpS)和尼日利亚菌素(Nigericin)刺激下诱导NLRp3炎症小体,同时hucMSC-Ex组细胞加入200μg/m L hucMSC-Ex。酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测上清液中白介素(IL)-1β的释放量;q RT-pCR和western blot分析细胞中NLRp3炎症小体相关分子的表达水平;免疫荧光(immunofluorescence,IF)分析检测细胞中ASC斑点样蛋白的形成。4)为明确hucMSC-Ex是否调控巨噬细胞焦亡,我们通过免疫组化检测小鼠结肠组织中Caspase-1 p45和Caspase-1 p20的表达,western blot检测小鼠结肠黏膜蛋白中焦亡底物GSDMD的裂解。在体外细胞实验中,CCK8实验用于细胞活力检测;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒用于细胞培养液中LDH活性检测;western blot检测细胞中GSDMD的裂解蛋白;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测碘化丙啶(propidium iodide,pI)阳性细胞比例;通过显微镜观察小鼠腹腔巨噬细胞的形态变化。5)为探寻hucMSC-Ex调控NLRp3炎症小体的关键分子,我们比对数据库中预测的靶向NLRp3 m RNA 3’UTR的mirNA和hucMSC-Ex mirNA测序结果并筛选出重合的mirNA,q RT-pCR检测筛选出来的mirNA表达水平并确定mir-378a-5p为关键分子。设计mir-378a-5p mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC分别转染THp-1细胞,q RT-pCR检测转染后巨噬细胞中mir-378a-5p的表达,western blot分析巨噬细胞中NLRp3分子的蛋白含量。结果:1)成功提取hucMSC-Ex,透射电镜拍摄和Nano Sight纳米颗粒浓度粒径分析显示hucMSC-Ex直径为110 nm,western blot检测外泌体表面蛋白标记,结果显示hucMSC-Ex中CD9、CD63、CD81、HSp70、Alix为阳性表达,Calnexin呈阴性表达。2)与NEG组小鼠体重相比,IBD组小鼠从第8天开始出现体重急剧下降和DAI评分的上升,而hucMSC-Ex组小鼠体重下降较IBD组小鼠有所缓解,DAI评分也较低。IBD组小鼠结肠明显缩短且肠腺结构紊乱

关键词：炎症性肠病人脐带间充质干细胞来源的外泌体 NLRp3炎症小体焦亡 mir-378a-5p

KLF4在二甲双胍改善肝脏脂肪变性中的作用及其机制研究

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KLF4在二甲双胍改善肝脏脂肪变性中的作用及其机制研究

作者：岳南希河北医科大学

学位级别：硕士

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）指的是除酒精及其他明确的损伤肝脏因素所致的,以肝细胞内过度脂肪沉积为主要特征的一种临床病理综合征。21世纪以来,随着科技的进步和人民生活水平提高,NAFLD的发病率... 详细信息

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）指的是除酒精及其他明确的损伤肝脏因素所致的,以肝细胞内过度脂肪沉积为主要特征的一种临床病理综合征。21世纪以来,随着科技的进步和人民生活水平提高,NAFLD的发病率逐年上升,现已成为当今全球范围内最常见的慢性肝脏疾病。流行病学显示NAFLD的全球患病率为25%左右,截至2018年,NAFLD在我国的发病率高达29.2%,已成为我国第一大慢性肝病。NAFLD的发病机制具有多样性和复杂性特点,胰岛素抵抗,脂代谢紊乱,氧化应激,炎症等因素都可能导致NAFLD的发生发展。除此之外,遗传、环境也会对其产生影响,然而人们对NAFLD发病机制的研究仍略知一二。目前针对NAFLD的治疗方法也较为局限,主要在控制饮食,增加运动等对患者生活方式方面进行干预指导,专属治疗NAFLD的一线药物仍未被发现。二甲双胍是治疗2型糖尿病的首选一线药物,已在临床使用近60年,大约70%的2型糖尿病患者伴有NAFLD,众多研究证实二甲双胍能有效降低患者血清低密度脂蛋白胆固醇,游离脂肪酸,甘油三酯等脂类物质水平,改善肝脏脂肪变性,但其降脂机制仍未明确。Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）是一种含锌指结构的多能转录因子,参与调控多种细胞生物学过程,有研究提示KLF4在胰岛素抵抗中起到重要作用。本研究旨在以KLF4为切入点,探讨二甲双胍的降脂作用机制,对NAFLD发病机制进行深入的研究,选择有效的药物进行针对性治疗,为临床上制订出有效的治疗方案提供理论基础。目的:探究KLF4在二甲双胍改善肝脏甘油三酯蓄积中的作用及其机制研究方法:1.将C57BL/6N雄性8周小鼠分为对照组、模型组和实验组。对照组小鼠常规饲料喂养,模型组和实验组小鼠均给予高脂饮食喂养,喂养16周,成功建立小鼠脂肪肝模型。实验组给予二甲双胍（300mg/kg.day）灌胃治疗4周,对照组和模型组均予等体积生理盐水灌胃处理,每周记录小鼠体重变化。最后采用眼球取血方式取出并分离小鼠血清,称取肝脏重量,检测血清及肝脏中甘油三酯变化,并对肝组织冰冻切片进行油红O染色,动物水平证明二甲双胍的降脂作用。2.采用0.5m M油酸处理肝细胞24小时建立脂肪肝细胞模型。并用1m M二甲双胍处理模型24小时,运用油红O染色及TG含量测定来证明细胞水平上二甲双胍降脂作用。3.将C57BL/6N雄性8周小鼠分为2组,高脂饮食喂养16周后,经尾静脉注射介导KLF4敲低的腺相关病毒（AAV-Sh KLF4）对照病毒（AAV-GFp）处理12天后,2组小鼠同时给予二甲双胍灌胃（300mg/kg.day）4周,采用油红O染色及TG含量检测KLF4对二甲双胍降脂作用的影响。4.采用过表达KLF4的腺病毒载体（Ad-GFp-KLF4）和敲低KLF4表达的si RNA转染脂肪肝细胞模型,通过测定细胞内甘油三酯的含量和油红O染色,分析KLF4的表达对肝细胞脂肪变性的调控作用。随后使用1m M二甲双胍处理,从细胞水平上证明KLF4介导二甲双胍降脂作用。5.采用western blot、实时荧光定量pCR等方式分别检测小鼠和细胞脂肪肝模型及二甲双胍干预后的KLF4、CpT-1a的表达。6.采用western blot、实时荧光定量pCR等方式检测mir378a-5p与KLF4及二甲双胍之间的相互作用。结果:1.二甲双胍可以显著减轻体内、体外脂肪肝模型中的TG蓄积肝脏进行大体形态学观察与油红O染色结果显示,二甲双胍处理组小鼠体重、肝脏指数以及肝脏TG含量降低,表明二甲双胍可显著减轻HFD诱导的小鼠肝细胞脂肪变性。细胞油红O染色及TG含量表明,二甲双胍可明显改善油酸诱导的肝细胞脂肪变性。2.KLF4是肝脏TG代谢的重要调控因子。在体内、体外脂肪肝模型中KLF4的表达均明显降低;过表达KLF4可改善肝细胞脂肪变性Western blot结果显示,与对照组相比,HFD组小鼠肝脏中KLF4的表达明显降低,而二甲双胍喂养4周后,KLF4的表达则明显增加。在油酸诱导的脂肪肝细胞模型中,KLF4的表达明显降低,二甲双胍处理则提高了KLF4的表达。3.二甲双胍可上调KLF4的表达,敲低KLF4的表达则衰减二甲双胍的降脂作用通过KLF4过表达的腺病毒载体（Ad-GFp-KLF4）和敲低KLF4表达的si RNA分别过表达和敲低KLF4的表达。油红O染色和TG含量检测可以发现,KLF4过表达可显著改善肝细胞脂肪变性,敲低KLF4的表达可衰减二甲双胍的降脂作用。通过对肝脏进行大体形态学观察与油红O染色结果显示,发现在体内水平敲低KLF4的表达也可衰减二甲双胍的降脂作用。4.二甲双胍通过下调mir-378a-5p,进而促进KLF4的表达,导致CpT1a表达增加,促进脂肪酸氧化分解qRT-pCR结果显示,在脂肪肝细胞模型中mir

关键词： NAFLD 二甲双胍 KLF4 CpT-1a mir-378a-5p