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沉默INHBA-AS1靶向mir-335-3p抑制外阴鳞状细胞癌细胞增殖、迁移

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现代肿瘤医学 2022年第20期30卷 3648-3654页

作者：周丽媛施喆苗国英河北工程大学附属医院河北邯郸056002

目的:探讨沉默长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)INHBA反义RNA1(INHBA antisense RNA1,INHBA-AS1)对外阴鳞状细胞癌细胞SW954生物学行为的影响及机制。方法:37例外阴鳞状细胞癌组织中INHBA-AS1、mir-335-3p表达运用qRT-pCR检测,高迁移率族蛋白2(high mobility group AT-hook 2,HMGA2)蛋白的表达运用Western blotting检测。实验分为con组、si-NC组、si-INHBA-AS1组、mir-NC组、mir-335-3p mimic组、si-INHBA-AS1+mir-335-3p inhibitor组。应用CCK-8实验检测SW954细胞增殖抑制率,克隆形成实验检测SW954细胞克隆形成,Transwell实验和划痕实验检测SW954细胞迁移,流式细胞术检测SW954细胞凋亡。双荧光素酶报告实验鉴定INHBA-AS1与mir-335-3p、mir-335-3p与HMGA2的靶向关系。结果:外阴鳞状细胞癌组织中INHBA-AS1、HMGA2蛋白的表达水平远高于癌旁组织,mir-335-3p的表达水平低于癌旁组织(p mir-335-3p mimic过表达mir-335-3p后,mir-335-3p表达水平、SW954细胞抑制率及凋亡率升高,HMGA2蛋白的表达水平、SW954细胞克隆形成数、迁移细胞数及划痕愈合率降低(p mir-335-3p,mir-335-3p靶向HMGA2。沉默INHBA-AS1处理的SW954细胞增殖、迁移、凋亡的影响被抑制mir-335-3p所逆转。结论:沉默外阴鳞状细胞癌细胞SW954中的INHBA-AS1通过mir-335-3p靶向HMGA2,抑制SW954细胞增殖、迁移,并诱导其凋亡。

关键词：外阴鳞状细胞癌细胞SW954 INHBA反义RNA1 mir-335-3p 高迁移率族蛋白2 增殖迁移

LINC00518/mir-335-3p/CTHRC1轴促进肺腺癌增殖、迁移及侵袭能力的机制硏究

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LINC00518/miR-335-3p/CTHRC1轴促进肺腺癌增殖、迁移及侵袭能力...

作者：沈若怡苏州大学

学位级别：硕士

背景和目的:肺癌是全球常见的癌症死亡原因且患者的总体生存率较低,这迫切要求我们寻找新的生物标志物和靶点,用于肺癌的早期诊断、治疗和生存预后分析。近年来,有大量研究表明,在一些人类实体肿瘤中长非编码蛋白RNA 518(long intergeni... 详细信息

背景和目的:肺癌是全球常见的癌症死亡原因且患者的总体生存率较低,这迫切要求我们寻找新的生物标志物和靶点,用于肺癌的早期诊断、治疗和生存预后分析。近年来,有大量研究表明,在一些人类实体肿瘤中长非编码蛋白RNA 518(long intergenic nonprotein coding RNA 518,LINC00518)能够促进肿瘤的增殖和转移。目前,有少数报道称LINC00518在非小细胞肺癌内可能起到促癌作用,但其在肺腺癌中的具体分子机制尚未明确。本次研究旨在对LINC00518在肺腺癌中的作用机制进行深入研究,为靶向治疗肺腺癌发生发展的治疗策略提供新思路。方法:(1)利用TCGA数据库筛选出肺腺癌组织中的具有差异表达的lncRNA并对其进行生存预后分析,发现LINC00518为肺腺癌患者不良预后的危险因素。(2)通过在线网站,预测LINC00518能够海绵吸附mir-335-3p,并经过实时定量pCR、RNA结合蛋白免疫共沉淀、双荧光素酶实验进行验证。(3)借助数据库网站,预测mir-335-3p能够干扰CTHRC1的表达,并通过实时定量pCR、双荧光素酶实验对其进行验证。(4)利用CCK-8、克隆形成、划痕愈伤实验、Transwell实验、细胞周期实验检测LINC00518/mir-335-3p/CTHRC1轴能够影响肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。并构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察其体内效应。(5)运用TCGA数据库分析发现CTHRC1能够影响整合素β3/FAK信号通路,并通过蛋白印迹实验、免疫共沉淀技术、免疫组化等进行验证。(6)CCK8、Transwell实验验证干扰LINC00518能够与FAK抑制剂VS6063起协同作用结果:LINC00518在肺腺癌组织中表达上调,而LINC00518异常表达与LUAD患者预后不良相关,高表达的LINC00518患者的总体生存期(Overall survival,OS)、无病生存期(Disease-free interval,DFI)、疾病特异性生存期(Disease-specific Survival,DSS)、无进展生存期(progression-free interval,pFI)均低于低表达的患者。LINC00518通过内源性竞争RNA发挥作用,其通过海绵吸附mir-335-3p从而影响CTHRC1,而CTHRC1通过调节细胞周期CyclinD1和整合素β3/FAK信号通路来影响肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。并且发现LINC00518可能成为FAK抑制剂VS6063潜在的协同治疗靶点,干扰LINC00518的同时加入VS6063能够更好地抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论:LINC00518在肺腺癌中高表达,且与患者的不良预后相关。本研究报道了LINC00518/mir-335-3p/CTHRC1对肺腺癌细胞影响的具体机制,发现其可通过调节细胞周期和整合素β3/FAK信号通路来影响细胞增殖、迁移和侵袭。此外,本研究发现干扰LINC00518的同时加入FAK抑制剂VS6063能够起到协同作用,为肺腺癌的治疗策略提供了新思路。

关键词：肺腺癌 LINC00518 mir-335-3p CTHRC1 FAK

沉默FOXD3-AS1调控mir-335-3p/pTEN对H_(2)O_(2)作用的神经细胞损伤的影响

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河北医药 2022年第15期44卷 2254-2258页

作者：刘秀竹刘鸿渊李宗平廖英王晓毅电子科技大学医学院附属绵阳医院神经外科四川省绵阳市621000

目的探讨FOXD3-AS1对过氧化氢(H_(2)O_(2))作用的神经细胞损伤的影响及分子机制。方法pC12细胞随机分为Control组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+si-FOXD3-AS1组、H_(2)O_(2)+si-NC组、H_(2)O_(2)+mir-335-3p组、H_(2)O_(2)+mir-NC组、H_(2)O_(2)+si-FOXD3-AS1+anti-mir-335-3p组;实时荧光定量pCR(RT-qpCR)检测FOXD3-AS1和mir-335-3p的表达水平;蛋白质印迹法检测pTEN蛋白表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;试剂盒检测细胞中CAT、SOD的活性以及MDA的含量;双荧光素酶报告实验检测FOXD3-AS1、mir-335-3p、pTEN的靶向关系。结果H_(2)O_(2)作用的神经细胞中FOXD3-AS1及pTEN表达水平升高,mir-335-3p表达水平降低,细胞活力降低,细胞凋亡率升高,CAT、SOD活性降低,MDA含量升高(p3-AS1或过表达mir-335-3p后,pTEN表达水平降低,细胞活力升高,细胞凋亡率降低,CAT、SOD活性升高,MDA含量降低(pmir-335-3p可逆转沉默FOXD3-AS1对H_(2)O_(2)处理的pC12细胞损伤的作用。FOXD3-AS1靶向mir-335-3p,mir-335-3p靶向pTEN。结论沉默FOXD3-AS1通过调控mir-335-3p/pTEN轴减轻H_(2)O_(2)作用的神经细胞损伤。

关键词： FOXD3-AS1 mir-335-3p pTEN 神经细胞氧化应激损伤

mir-335-3p通过靶向FOXD1发挥对骨肉瘤细胞肿瘤生物学行为的抑制作用

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中国卫生检验杂志 2023年第6期33卷 651-655页

作者：韩交玲于雅丽刘寒江郑州市骨科医院检验科河南450000

目的探讨mir-335-3p通过靶向调控FOXD1基因抑制骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞的增殖和迁移的作用及机制。方法使用RT-pCR法评估mir-335-3p在OS组织和临近组织,正常人成骨细胞系(hFOB1.19f)和OS细胞系(SAOS2、U2OS、MG63)中的表达;使用细... 详细信息

目的探讨mir-335-3p通过靶向调控FOXD1基因抑制骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞的增殖和迁移的作用及机制。方法使用RT-pCR法评估mir-335-3p在OS组织和临近组织,正常人成骨细胞系(hFOB1.19f)和OS细胞系(SAOS2、U2OS、MG63)中的表达;使用细胞增殖实验测定研究mir-335-3p过表达对U2OS、MG63的活力的影响;EDU染色和DApI染色评估mir-335-3p过表达对U2OS、MG63迁移和侵袭的影响;荧光素酶报告基因测定法确定mir-335-3p靶向调控FOXD1编码基因发挥作用;蛋白质免疫印迹法检测OS细胞中FOXD1蛋白表达;pcDNA-FOXD1转染OS细胞,并评估细胞增殖、迁移和侵袭的水平。结果mir-335-3p在OS癌组织和细胞中低表达;利用mir-335-33p mimic转染细胞后,可在体外抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭;mir-335-3p通过直接结合FOXD1 mRNA的3'-UTR发挥抑制作用,从而负面调节FOXD1的表达;mir-335-3p通过靶向调节FOXD1的表达,进而抑制OS癌细胞的增殖、迁移和侵袭。结论mir-335-3p可通过靶定FOXD1来抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭,并且可能是抗癌治疗中有前景的治疗方向。

关键词： mir-335-3p FOXD1 骨肉瘤

肿瘤相关成纤维细胞外泌体中miR-335-3p对卵巢癌顺铂敏感性作用机...

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作者：张丹青岛大学

学位级别：硕士

目的:卵巢癌（ovarian cancer,OC）是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,耐药是卵巢癌治疗的瓶颈。最近的研究表明在肿瘤细胞对化疗药物的敏感性变化中,除了肿瘤细胞本身的遗传学改变,局部微环境在调控肿瘤细胞耐药中也有着重要的作用。肿瘤相... 详细信息

目的:卵巢癌（ovarian cancer,OC）是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,耐药是卵巢癌治疗的瓶颈。最近的研究表明在肿瘤细胞对化疗药物的敏感性变化中,除了肿瘤细胞本身的遗传学改变,局部微环境在调控肿瘤细胞耐药中也有着重要的作用。肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）作为肿瘤微环境中最主要的间质细胞之一,主要来源于正常成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）的活化,可通过外泌体和肿瘤细胞相互作用,调控肿瘤耐药的发生。Micro RNAs（mirNAs）是一类非编码小RNA分子,在在多种肿瘤的发生、发展及化疗耐药中发挥着重要作用。研究表明mir-335-3p在多种肿瘤中的表达水平均降低,并发挥抑制肿瘤发展的作用。但mir-335-3p在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究目的是探讨CAFs分泌的外泌体中mir-335-3p在卵巢癌细胞对顺铂敏感性中的作用。方法:（1）从OC组织和正常的卵巢组织中分离培养CAFs和NFs,并提取其培养上清液的外泌体,分别与卵巢癌细胞SKOV3共培养后,用CCK8检测SKOV3在顺铂作用下细胞活性的变化。同时,流式细胞仪检测在顺铂作用下,外泌体对SKOV3细胞凋亡的影响,并检测凋亡相关蛋白与耐药相关蛋白mRNA表达水平。（2）用qRT-pCR的方法检测对比两种外泌体中的mir-335-3p的表达水平;（3）过表达CAFs中的mir-335-3p,并与SKOV3间接共培养,应用CCK8检测SKOV3对顺铂的敏感性;同时,用qRT-pCR的方法检测过表达mir-335-3p的CAFs中α-SMA和FAp mRNA的表达水平;（4）用荧光标记的方法,检测SKOV3细胞是否通过外泌途径摄取mir-335-3p。（5）将mir-335-3p mimic直接转染SKOV3细胞,用CCK8检测顺铂对SKOV3细胞活性的影响;用流式细胞仪检测顺铂作用下的凋亡情况。（6）数据库预测mir-335-3p下游靶基因可能为ERH,用qRT-pCR和Western blot（WB）分析在SKOV3细胞中mir-335-3p是否影响ERH的表达水平;并用双荧光素酶实验验证。（7）选取卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer,EOC）患者手术切除的病变组织,用免疫组织化学染色检测其ERH蛋白的表达水平,并用WB和qRT-pCR的方法验证;分析ERH的表达水平与患者临床病理特征的关系;CCK8检测mir-335-3p是否通过抑制ERH表达来调控SKOV3细胞对顺铂的敏感性。结果:1、从OC组织中分离培养的成纤维细胞高表达α-SMA、FAp;与CAFs/CAFs-exo共培养的SKOV3细胞对顺铂的敏感性较与NFs/NFs-exo共培养的显著降低,而且CAFs-exo显著SKOV3细胞的凋亡,同时使耐药相关蛋白的mRNA的表达水平明升高,凋亡相关蛋白的mRNA降低;2、CAFs分泌的外泌体中mir-335-3p的表达水平明显低于NFs分泌的;细胞功能试验结果显示:CAFs转染mir-335-3p mimic后可提高SKOV3细胞对顺铂的敏感性,且α-SMA和FAp的表达水平也显著降低;3、荧光标记结果显示mir-335-3p通过外泌体从CAFs转移至SKOV3细胞。4、转染mir-335-3p mimic后可以显著下调SKOV3细胞中ERH的表达水平。过表达ERH能够部分逆转mir-335-3p mimic导致的SKOV3细胞顺铂敏感增高。双荧光素酶结果显示mir-335-3p可特异性调控ERH的表达。5、卵巢癌中ERH的表达水平与EOC患者不良预后因素相关;干扰SKOV3细胞ERH的表达可显著提高其对顺铂敏感性并促进其凋亡。结论:本研究中,我们发现卵巢癌CAFs分泌的外泌体通过传递mir-335-3p至卵巢癌细胞中,而mir-335-3p可以通过靶向ERH来增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性;揭示了肿瘤微环境中CAFs调控卵巢癌顺铂耐药的新机制,为靶向CAFs提高卵巢癌细胞顺铂敏感性提供了理论依据。

关键词：卵巢癌肿瘤相关成纤维细胞外泌体 mir-335-3p ERH

mir-335-3p影响非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性及增殖、迁移、侵袭能力的相关性研究

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MiR-335-3p影响非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性及增殖、迁移...

作者：姚雨婷苏州大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:几乎所有的EGFR突变非小细胞肺癌患者在使用EGFR-TKIs治疗后最终会出现获得性耐药,目前引起EGFR-TKIs获得性耐药的机制仍未完全阐明。大量研究表明microRNAs的异常表达在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用,也有越来越... 详细信息

研究背景和目的:几乎所有的EGFR突变非小细胞肺癌患者在使用EGFR-TKIs治疗后最终会出现获得性耐药,目前引起EGFR-TKIs获得性耐药的机制仍未完全阐明。大量研究表明microRNAs的异常表达在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用,也有越来越多的研究证实microRNAs与EGFR-TKIs获得性耐药相关。本研究旨在探讨mir-335-3p是否影响非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性,是否通过负向调控RAp1B、CTHRC1、SMYD2的表达抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,为非小细胞肺癌患者出现EGFR-TKIs获得性耐药后治疗的新方向提供实验依据。方法:(1)构建HCC827GR细胞株,用CCK-8法检测HCC827与HCC827GR对吉非替尼的敏感性,用克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测HCC827与HCC827GR的增殖、迁移及侵袭能力。(2)用Real-time pCR检测mir-335-3p 在 HCC827 与 HCC827GR 中的表达。(3)在 HCC827GR 中过表达mir-335-3p后,用CCK-8法检测其对吉非替尼的敏感性的影响,用克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测其对增殖、迁移及侵袭能力的影响;在HCC827中敲弱mir-335-3p后,用CCK-8法检测其对吉非替尼的敏感性的影响。(4)查阅 TargetScan 预测 mir-335-3p 的靶基因,用 Real-time pCR 检测 RAp1B、CTHRC1、SMYD2在HCC827与HCC827GR中的表达,以及mir-335-3p过表达对于HCC827GR中 RAp1B、CTHRC1、SMYD2 的表达的影响。(5)在 HCC827GR 中敲弱 RAp1B、CTHRC1、SMYD2后,用克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测其对增殖、迁移及侵袭能力的影响,用CCK-8法检测其对吉非替尼的敏感性的影响。结果:(1)HCC827的吉非替尼半抑制浓度为2.39μmol/L,对吉非替尼较为敏感,而HCC827GR的吉非替尼半抑制浓度为15.97μmol/L,对吉非替尼敏感性明显下降;HCC827GR的增殖、迁移及侵袭能力较HCC827明显增强(pmir-335-3p 在 HCC827GR 中的表达较 HCC827 明显下调(p3)mir-335-3p过表达明显增加HCC827GR对吉非替尼的敏感性,其差异在10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L三个浓度均具有统计学意义(pmir-335-3p过表达减弱HCC827GR的增殖、迁移及侵袭能力(pmir-335-3p降低HCC827对吉非替尼的敏感性,其差异在0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L三个浓度均具有统计学意义(pp1B、CTHRC1、SMYD2 的 3’-UTR 存在 mir-335-3p的潜在结合位点,RAp1B、CTHRC1、SMYD2在HCC827GR中的表达均较HCC827上调(pmir-335-3p 负向调控 RAp1B、CTHRC1、SMYD2 的表达。(5)敲弱RAp1B、CTHRC1、SMYD2减弱HCC827GR的增殖、迁移及侵袭能力(pmir-335-3p影响非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性,并且可能通过负向调控RAp1B、CTHRC1、SMYD2的表达抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,提示mir-335-3p过表达或许能够成为非小细胞肺癌患者出现EGFR-TKIs获得性耐药后治疗的新方向,但需进一步深入的研究及临床试验来证实。

关键词：非小细胞肺癌 mir-335-3p EGFR-TKIs 获得性耐药

Lnc RNACCAT1通过调控mir-335-3p对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响

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颈腰痛杂志 2021年第1期42卷 17-23页

作者：刘建民袁之木戚荣富孙文建南京同仁医院骨科江苏南京211102

目的探讨长链非编码RNA(Lnc RNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖、凋亡和成骨分化的影响及可能机制。方法以成骨诱导液诱导hBMSCs,分别于诱导后0 d和1、3、7、14 d采用RT-qpCR检测细胞中碱性磷酸酶(ALp)、... 详细信息

目的探讨长链非编码RNA(Lnc RNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖、凋亡和成骨分化的影响及可能机制。方法以成骨诱导液诱导hBMSCs,分别于诱导后0 d和1、3、7、14 d采用RT-qpCR检测细胞中碱性磷酸酶(ALp)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、CCAT1和mir-335-3p基因表达水平。转染CCAT1小干扰RNA或mir-335-3p模拟物(mimics)至hBMSCs,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测hBMSCs存活率、流式细胞术检测细胞凋亡率、RT-qpCR检测细胞中ALp、RUNX2和OCN基因表达,蛋白印迹(Western blot)法检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证mir-335-3p与CCAT1调控关系。以健康体检者为对照,实时荧光定量pCR(RT-qpCR)检测Op患者血清中CCAT1和mir-335-3p表达水平。结果随着诱导时间的增加,hBMSCs中ALp、RUNX2、OCN及CCAT1基因表达水平逐渐升高(pmir-335-3p表达水平逐渐降低(pmir-335-3p后,hBMSCs存活率和CyclinD1蛋白水平降低(ppase-3蛋白水平升高(pp、RUNX2和OCN水平降低(pmir-335-3p表达。低表达mir-335-3p逆转了低表达CCAT1对hBMSCs增殖、凋亡和分化的影响。与对照组比较,Op患者血清CCAT1表达水平降低(pmir-335-3p表达水平升高(pp患者血清中CCAT1表达降低,mir-335-3p表达升高。低表达CCAT1可能通过靶向上调mir-335-3p抑制hBMSCs增殖和分化,并促进其凋亡。

关键词：骨质疏松症 Lnc RNA CCAT1 mir-335-3p 人骨髓间充质干细胞增殖凋亡成骨分化

NF-κB-mediated upregulation of mir-335-3p contributes to the induction of hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice

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NF-κB-mediated upregulation of miR-335-3p contributes to th...