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TRIM52-AS1通过调控mir-28-5p减轻缺氧/复氧诱导的大鼠脑皮层神经元损伤

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中华神经医学杂志 2021年第5期20卷 448-457页

作者：张广林李天晓常晓赞行君郑州大学附属河南省人民医院脑血管科郑州450000

目的探讨TRIM52反义RNA1(TRIM52-AS1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠脑皮层神经元损伤的影响及其可能机制。方法(1)将体外培养的大鼠皮层神经元分为对照组和模型组,模型组制备H/R诱导的细胞损伤模型,采用实时定量pCR(RT-qpCR)检测2组神经元... 详细信息

目的探讨TRIM52反义RNA1(TRIM52-AS1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠脑皮层神经元损伤的影响及其可能机制。方法(1)将体外培养的大鼠皮层神经元分为对照组和模型组,模型组制备H/R诱导的细胞损伤模型,采用实时定量pCR(RT-qpCR)检测2组神经元TRIM52-AS1、微小RNA(mir)-28-5p的表达。(2)将皮层神经元分为对照组、模型组、TRIM52-AS1小干扰RNA(si-TRIM52-AS1)转染组和无义序列转染组,后2组细胞分别转染si-TRIM52-AS1及其无义对照序列,转染6h后,制备H/R诱导的细胞损伤模型。采用RT-qpCR、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、流式细胞仪分别检测4组神经元TRIMS2-AS1的表达及细胞增殖、凋亡情况;采用酶联免疫吸附实验(ELISA),Westerm blotting分别检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)、细胞中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量和Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白的表达。(3)将皮层神经元分为mir-28-Sp转染组和无义序列转染组,分别转染mir-28-5p模拟物及其无义对照序列、转染6h后,均制备H/R诱导的细胞损伤模型。采用RT-qpCR、CCK-8、流式细胞仪分别检测2组神经元mir-28-5p的表达及细胞增殖、调亡情况;采用ELISA及Western boting分别检测培养上清中LDH、细胞中MDA、SOD含量和Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白的表达。(4)将皮层神经元分别分为野生型TRIM52-ASI+mir-28-5p模拟物转染组野生型TRIM52-AS1+mir-28-5p无义对照序列转染组和突变型TRIM52-AS1+mir-28-5p模拟物转染组.突变型TRIM52-AS1+mir-28-5p无义对照序列转染组。转染6h后换新鲜培养液继续培养12h后,采用双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞的荧光素酶活性。(5)将皮层神经元分为无义序列转染组、mir-28-5p抑制物转染组、无义序列+si-TRIM52-AS1转染组、mir-28-5p抑制物+si-TRIM52-AS1转染组,分别转染mir-28-Sp抑制物无义对照序列、mir-28-5p抑制物、mir-28-5p抑制物无义对照序列+si-TRIM52-ASI、mir-28-5p抑制物+si-TRIM52-AS1.转染6h后,制备H/R诱导的细胞损伤模型。采用RT-qpCR、CCK-8、流式细胞仪分别检测4组神经元mir-28-5p的表达及细胞增殖、凋亡情况;采用ELISA及Westermblotting分别检测培养上清中LDH、细胞中***含量和Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果(1)与对照组比较,模型组神经元TRIM52-AS1的表达升高,mir-28-5p的表达降低,差异均有统计学意义(ppmir-28-5p转染组神经元mir-28-Sp的表达增高,培养上清中LDH含量和细胞中MDA含量降低,SOD含量升高,细胞A值及Cyelin D1、Bcl-2蛋白的表达升高,凋亡率及Bax蛋白的表达降低,差异均有统计学意义(pmir-28-5p模拟物转染组细胞的荧光素酶活性显著低于野生型TRIM52-AS1+mir-28-5p无义对照序列转染组(0.43±0.04 vs.1.00±0.09),差异有统计学意义(pmir-28-5p抑制物转染组细胞mir-28-5p的表达明显降低,培养上清中LDH和细胞中MDA含量升高,SOD含量降低,细胞A值及Cyclin D1、Bel-2蛋白的表达降低,凋亡率及Bax蛋白的表达升高。与无义序列+si-TRIM52-ASI转染组比较,mir-28-5p抑制物+si-TRIM52-ASI转染组神经元中mir-28-5p的表达明显降低,培养上清中LDH含量和细胞中MDA含量明显升高,SOD含量降低,A值及Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达降低,凋亡率及Bax蛋白的表达升高,差异均有统计

关键词：神经元缺氧/复氧 TRIM52-AS1 mir-28-5p 氧化应激细胞凋亡

mir-28-5p通过抑制FSp1介导的铁死亡逆转肺腺癌细胞顺铂耐药的机制

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安徽医科大学学报 2023年第4期58卷 630-636页

作者：王晓丹宋国庆姜丹中国医科大学附属盛京医院第二胸外科沈阳110000 中国医科大学附属盛京医院第一、第二乳腺肿瘤外科沈阳110000

目的研究mir-28-5p对顺铂(DDp)耐药的A549肺腺癌细胞系(A549/DDp)的影响,并探讨其作用机制是否与铁死亡抑制蛋白1(FSp1)介导的铁死亡有关。方法选择A549肺腺癌细胞和A549/DDp细胞作为研究对象。采用RT-qpCR法检测细胞中mir-28-5p的表... 详细信息

目的研究mir-28-5p对顺铂(DDp)耐药的A549肺腺癌细胞系(A549/DDp)的影响,并探讨其作用机制是否与铁死亡抑制蛋白1(FSp1)介导的铁死亡有关。方法选择A549肺腺癌细胞和A549/DDp细胞作为研究对象。采用RT-qpCR法检测细胞中mir-28-5p的表达水平。通过CCK-8法和集落形成实验测定细胞增殖。mir-28-5p的靶基因通过荧光素酶报告基因和蛋白质印迹分析进行鉴定和验证。使用mir-28-5p模拟物或FSp1过表达质粒转染A549/DDp,评估细胞增殖情况,并采用透射电子显微镜评估线粒体形态,以及试剂盒测定细胞活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平。建立了基于细胞系的异种移植模型,在体内评估mir-28-5p对肿瘤生长的影响。结果与A549细胞相比,A549/DDp细胞中mir-28-5p的表达水平降低(p549细胞比较,A549/DDp细胞的细胞活力(F=49.542,ppmir-NC组相比,mir-28-5p组A549/DDp细胞的细胞活力(t=4.612,p503,ppGL3-FSp1 3′UTR-WT载体存在情况下,用mir-28-5p模拟物转染的细胞中荧光素酶活性降低(pmir-28-5p细胞中FSp1的表达水平被抑制。与载体+mir-28-5p组相比,FSp1+mir-28-5p组细胞活力、集落形成、细胞线粒体长度、GSH增加(pp5)。体内实验显示,与mir-NC+DDp组相比,mir-28-5p+DDp组裸鼠体内形成的肿瘤大小和质量减少(p5),并且Ki-67和FSp1蛋白表达降低(p5)。结论 mir-28-5p逆转肺腺癌细胞顺铂的耐药机制可能与抑制FSp1介导的铁死亡有关。

关键词： mir-28-5p 肺癌铁死亡抑制蛋白1 铁死亡顺铂

mir-28-5p和Nrf2与老年脑动静脉畸形出血的关系

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中国老年学杂志 2022年第14期42卷 3385-3389页

作者：王辰龙周红呼群张瑞云张海廷李志方民航总医院神经内科(北京大学民航临床医学院神经内科) 北京100123 中国人民解放军军事医学科学院

目的研究mir-28-5p与Nrf2在脑动静脉畸形(AVM)中的表达及与出血的关系。方法收集2016年2月至2018年2月民航总医院就诊的脑血管AVM未出老年血患者32例为血管畸形组,AVM出血患者25例为出血组,27例为癫痫组,健康体检者30例为健康组,采用逆... 详细信息

目的研究mir-28-5p与Nrf2在脑动静脉畸形(AVM)中的表达及与出血的关系。方法收集2016年2月至2018年2月民航总医院就诊的脑血管AVM未出老年血患者32例为血管畸形组,AVM出血患者25例为出血组,27例为癫痫组,健康体检者30例为健康组,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-pCR)方法测定各组外周血mir-28-5p与Nrf2的mRNA表达,随访血管畸形组2年,统计AVM患者出血情况并进行相关因子检测。AVM老年患者进行Spetzler&Martin分级,对不同分组、病情分级的数据进行统计。结果在健康组、癫痫组、血管畸形组、出血组外周血中mir-28-5p依次呈低表达;Nrf2依次呈高表达,差异具有统计学意义(p5);不同病情分级对应的mir-28-5p表达均随着病情分级增加表达减弱,不同分级之间差异具有统计学意义(p5)。Nrf2表达随着病情分级增加表达增强,不同分级之间差异具有统计学意义(p5);血管畸形组随访期间14例出现出血症状,单因素回归分析显示出血危险与mir-28-5p弱表达相关,与Nrf2强表达相关(p5)。体外模型中,加入Nrf2抑制剂后,癫痫组、血管畸形组、出血组中mir-28-5p的mRNA表达水平明显升高,mir-28-5p与Nrf2呈负相关(p5)。结论mir-28-5p在老年脑AVM患者中呈现低表达,与临床分级、出血症状呈负相关。Nrf2在老年脑AVM患者中呈现高表达,与临床分级、出血症状呈正相关,MicroRNA-28-5p与Nrf2呈负相关,是临床出血并发症的危险因素。

关键词： mir-28-5p 核转录因子脑动静脉畸形脑出血血管内皮细胞

mir-28-5p在乳腺癌细胞转移中的作用和机制

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miR-28-5p在乳腺癌细胞转移中的作用和机制

作者：马亮华北理工大学

学位级别：硕士

乳腺癌在女性中的死亡率常年居高不下,而乳腺癌细胞转移是导致其难以被治愈的主要原因。mirNAs广泛存在于动植物机体内,在恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。其中mir-28-5p可能在乳腺癌转移中扮演着重要角色,因此该研究拟阐明其在乳... 详细信息

乳腺癌在女性中的死亡率常年居高不下,而乳腺癌细胞转移是导致其难以被治愈的主要原因。mirNAs广泛存在于动植物机体内,在恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。其中mir-28-5p可能在乳腺癌转移中扮演着重要角色,因此该研究拟阐明其在乳腺癌细胞转移中的作用及分子机制。首先,采用mirNA表达数据库（HMED）统计分析了mir-28-5p的表达,结果显示,相对于乳腺正常组织,mir-28-5p在乳腺癌组织中显著低表达。KMpLOT分析结果发现mir-28-5p低表达组患者生存率显著降低。RT-q pCR分析结果表明相对于乳腺上皮细胞（HMEC）,mir-28-5p在乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF-7、T-47D、ZR-75-30）中显著低表达。Transwell实验证明过表达mir-28-5p mimics可抑制MCF-7细胞转移。然后采用基因芯片筛选获得了648个差异表达基因（DEGs）,其中283个表达上调,365个表达下调。将DEGs进行GO和KEGG分析,结果表明DEGs主要富集在细胞黏着和癌症通路中。并且RT-q pCR检测结果显示mir-28-5p抑制RAp1B和WSB2的表达,促进VEGF的表达。进一步RT-q pCR和western blot结果证实,无论在转录水平还是翻译水平,mir-28-5p均显著抑制WSB2的表达。随后构建了WSB2 3’UTR野生型荧光素酶表达载体WSB2 3’UTR-wt,以及5’-AGCUCCUU-3’位点突变型荧光素酶表达载体WSB23’UTR-mut,双荧光素酶实验结果显示mir-28-5p mimics使WSB2 3’UTR-wt的荧光素酶活性降低;mir-28-5p inhibitor使WSB2 3’UTR-wt荧光素酶活性增加,但对WSB2 3’UTR-mut无调节作用。Target Scan7.1分析结果显示,在多个物种的WSB23’UTR中,均预测到了mir-28-5p的结合位点5’-AGCUCCUU-3’。最后构建了WSB2的表达载体p EGFp-C3-WSB2,Transwell实验表明WSB2的过表达减弱了mir-28-5p对MCF-7细胞的迁移抑制。综上所述,研究结果阐明了mir-28-5p通过结合WSB2 3’UTR上的5’-AGCUCCUU-3’序列抑制WSB2的表达,从而实现对MCF-7细胞迁移的调控。该研究结果将为乳腺癌防治提供新的治疗靶点和理论支撑。图26幅;表8个;参79篇。

关键词：乳腺癌 mir-28-5p 转移 WSB2

基于MCp-1/CCR2通路研究mir-28-5p对老龄自发性高血压大鼠的干预作用

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中国老年学杂志 2023年第24期43卷 6052-6055页

作者：张贤春冯静陈海明海口市人民医院全科医学科海南海口570311

目的研究基于单核细胞趋化蛋白(MCp)-1/CC趋化因子受体(CCR)2通路微小核糖核酸-28-5p(mir-28-5p)对老龄自发性高血压大鼠的干预作用。方法选取SpF级雄性Wistar大鼠6只设为正常组,自发性高血压大鼠18只分为模型组、对照组、mir-28-5p组各... 详细信息

目的研究基于单核细胞趋化蛋白(MCp)-1/CC趋化因子受体(CCR)2通路微小核糖核酸-28-5p(mir-28-5p)对老龄自发性高血压大鼠的干预作用。方法选取SpF级雄性Wistar大鼠6只设为正常组,自发性高血压大鼠18只分为模型组、对照组、mir-28-5p组各6只,mir-28-5p水平检测采用荧光定量聚合酶链反应(pCR)法,检测肺功能相关指标,采用酶联免疫法检测炎症因子白细胞介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,Western印迹检测MCp-1及CCR2通路相关蛋白表达。结果与正常组相比,模型组、对照组、mir-28-5p组mir-28-5p表达及左室收缩压(LVSp)水平明显较高,左室舒张末压(LVEDp)、左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)水平明显较低(p5);与模型组相比,对照组、mir-28-5p组mir-28-5p表达及LVEDp水平明显较低,LVSp、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平明显较高(p5);与对照组相比,mir-28-5p组mir-28-5p表达及LVEDp水平明显较低,LVSp、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平明显较高(p5)。与正常组相比,模型组、对照组、mir-28-5p组IL-1、IL-6、TNF-α水平及MCp-1、CCR2水平明显较高(p5);与模型组相比,对照组、mir-28-5p组IL-1、IL-6、TNF-α水平及MCp-1、CCR2水平明显较低(p5);与对照组相比,mir-28-5p组IL-1、IL-6、TNF-α水平及MCp-1、CCR2水平明显较低(p5)。结论mir-28-5p可通过调控MCp-1、CCR2通路蛋白水平改善老龄自发性高血压大鼠的心功能,干预抑制炎性反应。

关键词：单核细胞趋化蛋白(MCp)-1/CC趋化因子受体(CCR)2通路 mir-28-5p 老龄自发性高血压炎症反应

LncRNA GUSBp11/mir-28-5p/pAQR7轴调控E-cadherin和N-cadherin的磷酸化来影响甲状腺癌细胞迁移的研究

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LncRNA GUSBP11/miR-28-5p/PAQR7轴调控E-cadherin和N-cadherin的...

作者：李乐威武汉科技大学

学位级别：硕士

目的:甲状腺癌(TC)是内分泌系统的最常见癌症之一。尽管目前大多数患者选择手术切割的方式来治疗,但也有部分会出现反复成瘤的情况。因此本研究试图通过LncRNA-mirNA-mRNA调控的方式为甲状腺癌的治疗提供一条潜在的治疗途径。方法:在TCG... 详细信息

目的:甲状腺癌(TC)是内分泌系统的最常见癌症之一。尽管目前大多数患者选择手术切割的方式来治疗,但也有部分会出现反复成瘤的情况。因此本研究试图通过LncRNA-mirNA-mRNA调控的方式为甲状腺癌的治疗提供一条潜在的治疗途径。方法:在TCGA数据库和starbase数据库中分析了 GUSBp11、mir-28-5p、pAQR7在甲状腺癌的表达以及它们之间在甲状腺癌中的相关性。然后使用Kaplan-Meier分析了膜孕酮受体pAQR7在甲状腺癌中的生存。取6对甲状腺乳头状癌患者的甲状腺癌组织和癌旁组织,提取RNA和蛋白。分别检测LncRNA GUSBp11和膜孕酮受体pAQR7的RNA水平和蛋白水平。免疫荧光实验验证莫孕酮受体pAQR7位于甲状腺癌细胞系BCpAp的细胞膜上。提取人正常甲状腺上皮细胞NTHY-ori3-1、人乳头状癌甲状腺癌细胞TpC-1、BCpAp和K1的RNA和mirNA通过RT-qpCR实验检测GUSBp11、pAQR7和mir-28-5p的内源性表达;构建GUSBp11敲降质粒和pAQR7的敲降质粒、合成mir-28-5p的mimic和inhibitor的短链RNA。转染至甲状腺癌的细胞系TpC-1和BCpAp中,提取蛋白或RNA检测其敲降或过表达效率,然后通过伤口愈合实验和transwell实验检测甲状腺癌细胞内GUSBp11、mir-28-5p、pAQR7改变后对细胞迁移的影响,western blot实验检测甲状腺癌细胞内GUSBp11、mir-28-5p、pAQR7改变后检测E-cadherin、N-cadherin 以及 p-E-cadhein(S838/840)、p-Ncadherin(Y820)的蛋白变化。构建GUSBp 11与mir-28-5p结合位点、pAQR7的3’UTR上mir-28-5p结合位点的野生型和突变型荧光素酶报告基因质粒,通过荧光素酶报告基因活性检测验证其各自的结合情况。构建稳定敲降pAQR7的BCpAp细胞系和稳定过表达和敲降GUSBp11的BCpAp细胞系以及在稳定敲降pAQR7的BCpAp细胞系中稳定过表达GUSBp11。建立体内小鼠甲状腺癌移植瘤模型,通过采集肿瘤体积与重量、western blot和免疫组化实验分别观察体内pAQR7对甲状腺癌肿瘤生长的影响,以及CDH1和CDH2的变化。构建CDH1和CDH2的cds区的序列以及突变序列分别连在pcDNA3.1的载体上,转染至BCpAp和TpC-1 的细胞系中,western blot检测 CDH1、CDH2、p-CDH1(S838/840)和 p-CDH2(Y820)的变化,伤口愈合实验和transwell实验检测其迁移变化。结果:通过网站预测,在甲状腺癌中中LncRNA GUSBp11和膜孕酮受体pAQR7的表达上调,且两者这件呈正相关关系,而mir-28-5p与他们呈负相关关系,且与LncRNA GUSBp11和膜孕酮受体pAQR7的3’UTR预测有结合位点,功能富集结果显示LncRNA GUSBp11、膜孕酮受体pAQR7、mir-28-5p可调控细胞粘附分子和激活pI3K/Akt等途径;甲状腺癌患者的癌组织中的GUSBp11的RNA水平和pAQR7的蛋白水平都高于癌旁组织。而甲状腺乳头状癌(pTC)细胞系TpC-1、K1、BCpAp中膜孕酮受体pAQR7、LncRNA GUSBp11的表达高于甲状腺上皮细胞系Nthy-ori3-1中的表达,而甲状腺乳头状癌(pTC)细胞系TpC-1、K1、BCpAp中mir-28-5p的表达低于甲状腺上皮细胞系Nthy-ori3-1中的表达。在BCpAp细胞中的免疫荧光结果显示,膜孕酮受体pAQR7位于BCpAp的细胞膜上。Western blot实验结果显示在TpC-1和BCpAp细胞中敲降GUSBp11或敲降pAQR7能使CDH1上调而CDH2、p-CDH1(S838/840)、p-CDH2(Y820)都下调。在pTC细胞系TpC-1和BCpAp中过表达LncRNA GUSBp11后CDH1下调而CDH2、p-CDH1(S838/840)都上调,而当过表达LncRNAGUSBp11和敲降膜孕酮受体pAQR7同时进行时,敲降pAQR7能逆转过表达GUSBp11对pTC细胞下游基因水平的改变。伤口愈合实验和transwell实验结果表明,敲降GUSBp11或敲降pAQR7或过表达mir-28-5p能抑制甲状腺乳头状癌(pTC)细胞TpC-1和BCpAp细胞的迁移。裸鼠成瘤实验验证了在BCpAp细胞系中稳定敲降GUSBp11或敲降pAQR7,能抑制甲状腺癌肿瘤的体内生长;过表达GUSBp11后能促进甲状腺癌肿瘤的体内生长。而当过表达GUSBp11和敲降pAQR7同时进

关键词： LncRNA GUSBp11 mir-28-5p pAQR7 磷酸化甲状腺乳头状癌

山羊mir-28-5p/mir-92a-3p靶向ApOL6基因调控肌内前体脂肪细胞分化

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山羊miR-28-5p/miR-92a-3p靶向APOL6基因调控肌内前体脂肪细胞分化

作者：郑建莹西南民族大学

学位级别：硕士

羊肉的品质、风味、多汁性、鲜嫩程度等与肌内脂肪（intramuscular fat,IMF）含量呈正相关。IMF含量与肌内脂肪沉积率相关,脂肪沉积是脂肪细胞分化和脂质代谢共同作用的结果。脂肪细胞分化是一个受到非编码RNA、功能基因等因素调控的复... 详细信息

羊肉的品质、风味、多汁性、鲜嫩程度等与肌内脂肪（intramuscular fat,IMF）含量呈正相关。IMF含量与肌内脂肪沉积率相关,脂肪沉积是脂肪细胞分化和脂质代谢共同作用的结果。脂肪细胞分化是一个受到非编码RNA、功能基因等因素调控的复杂过程,细胞的大小、形态、结构和功能在这一过程中发生显著性变化。微小RNA（micro RNA,mirNA）是一类非编码RNA,长度在22 nt左右,其作为一种特殊的RNA分子可以通过与靶基因结合进而调控一系列生命活动。近年来,大量的研究表明mirNA可调控脂肪的分解与沉积、脂肪细胞的增殖与分化等多个重要的过程。目前已有研究表明,部分mirNAs可以调控山羊肌内脂肪细胞分化,但其他mirNAs是否影响山羊肌内脂肪细胞分化以及具体的作用机制,仍需进一步研究。因此本研究根据实验室前期高通量测序结果,分析后筛选出差异表达的mir-28-5p和mir-92a-3p作为本实验的研究对象,通过化学合成mir-28-5p/mir-92a-3p的mimics和inhibitor,利用RT-pCR、实时荧光定量pCR（Real-time Quantitative pCR,q pCR）、过表达载体构建、RNA干扰、细胞分离培养、瞬时转染、油红O染色、Bodipy染色、双荧光素酶报告基因检测系统等生物技术手段,最终阐明mir-28-5p和mir-92a-3p及其靶基因对山羊脂肪细胞分化的影响及作用机制。（1）mir-28-5p/mir-92a-3p对山羊肌内脂肪细胞分化的影响mir-28-5p和mir-92a-3p在山羊肌内脂肪细胞分化过程中的表达均呈现先下降后上升然后下降的趋势。在山羊肌内脂肪细胞内转染mir-28-5p的模拟物后,细胞内脂滴明显减少,OD值显著下降,ppARγ、LpL、C/EBpα、Ap2、SREBp1和C/EBpβ的表达水平显著降低（p＜0.05）;抑制mir-28-5p表达后,山羊肌内细胞内脂滴增多,OD值显著上升,ppARγ、LpL、C/EBpα、Ap2、SREBp1和C/EBpβ的表达水平显著上升（p＜0.05）。上调mir-92a-3p表达后,细胞内脂滴明显减少,OD值显著下降,ppARγ、LpL、C/EBpβ、Ap2和SREBp1的表达水平显著下降（p＜0.05）,C/EBpα的表达显著上升（p＜0.05）;抑制mir-92a-3p表达后,细胞内脂滴增多,OD值显著上升,ppARγ、LpL、C/EBpα、C/EBpβ和SREBp1的表达水平显著上升（p＜0.05）。（2）mir-28-5p/mir-92a-3p与ApOL6靶向关系的鉴定克隆得到山羊ApOL6 3’UTR序列并进行分析,发现ApOL6 m RNA的3’UTR上存在一个mir-28-5p和一个mir-92a-3p的配对结合序列;成功构建ApOL6 3’UTR野生型（pmri GLO-ApOL6 WT）和突变型（pmri GLO-ApOL6 28MT、pmri GLO-ApOL6 92a MT）报告载体,双荧光素酶报告基因检测系统表明过表达mir-28-5p/mir-92a-3p的表达极显著抑制ApOL6 3’UTR的活性（p＜0.01）,而过表达mir-28-5p/mir-92a-3p的表达并不影响突变型3’UTR的活性（p＞0.05）。同时,ApOL6的细胞时序表达谱呈现先上升后下降的趋势,与mir-28-5p/mir-92a-3p的表达趋势存在差异;在山羊肌内细胞中分别转染mir-28-5p/mir-92a-3p的模拟物后,ApOL6的表达水平极显著下降（p＜0.01）,而在细胞中分别抑制mir-28-5p/mir-92a-3p的表达后,ApOL6的表达水平极显著升高（p＜0.01）。（3）靶标基因ApOL6对山羊肌内脂肪细胞分化的影响根据NCBI上提供的山羊ApOL6 CDS区序列和已知的pc DNA-3.1载体序列,利用双酶切法成功构建ApOL6过表达载体（pc DNA-ApOL6）。在山羊肌内脂肪细胞中过表达ApOL6后,与对照组相比,细胞内脂滴明显增多,OD值显著升高,ppARγ、C/EBpα、C/EBpβ、Ap2和SREBp1相对表达水平显著升高（p＜0.05）,LpL的表达显著下降（p＜0.05）;在山羊肌内脂肪细胞中干扰ApOL6后,细胞内脂滴明显减少,OD值显著下降,分化相关标志基因ppARγ、LpL、C/EBpα、C/EBpβ、Ap2和SREBp1的相对表达水平显著下降（p＜0.05）。（4）恢复实验进一步确定mir-28-5p/mir-92a-3p通过抑制ApOL6发挥调控作用在山羊肌内前体脂肪细胞中转染mir-28-5p/mir-92a-3p模拟物后转染ApOL6过表达载体质粒,与单独转染

关键词：山羊肌内脂肪细胞分化 mir-28-5p mir-92a-3p ApOL6

mir-28-5p靶向BECN1对OCI-LY7细胞凋亡及自噬过程的调控作用

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河北医药 2024年第6期46卷 805-810页

作者：康天李杨路晓飞张文婷朱秀丽刁玉巧江莲河北省石家庄市人民医院 050000 河北医科大学第四医院

目的探讨mir-28-5p靶向BECN1在OCI-LY7细胞凋亡及自噬过程中的作用及机制。方法通过TUNEL荧光染色、Western blot实验明确mir-28-5p及姜黄素在OCI-LY7细胞凋亡及自噬过程的作用,经在线预测并进一步通过双荧光素酶报告基因检测明确mir-28... 详细信息

目的探讨mir-28-5p靶向BECN1在OCI-LY7细胞凋亡及自噬过程中的作用及机制。方法通过TUNEL荧光染色、Western blot实验明确mir-28-5p及姜黄素在OCI-LY7细胞凋亡及自噬过程的作用,经在线预测并进一步通过双荧光素酶报告基因检测明确mir-28-5p和BECN1的靶向关系。结果TUNEL染色和caspase-3蛋白水平检测:与对照组比较,姜黄素明显增加凋亡细胞百分比并表达裂解蛋白caspase-3(p5)。相比姜黄素单独作用,细胞凋亡被mir-28-5p显著减弱抑制(p5)。与对照组比较,姜黄素组beclin1和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值显著降低、p62蛋白表达明显升高(p5);与姜黄素组比较,姜黄素+mir-28-5p抑制剂组beclin1表达和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显升高、p62蛋白表达明显降低(p5)。通过在线数据库预测:mir-28-5p与BECN1存在靶向的关系;双荧光素酶报告基因实验显示:与阴性对照组比较,mir-28-5p模拟物显著降低BECN1-wt组的荧光素酶活性,但mir-28-5p模拟物不影响BECN1-mut组的荧光素酶活性。结论mir-28-5p介导姜黄素促OCI-LY7细胞凋亡作用。BECN1是mir-28-5p的靶基因,姜黄素诱导mir-28-5p过表达可直接靶向BECN1抑制自噬过程。

关键词： mir-28-5p BECN1 人淋巴瘤细胞系OCI-LY7细胞细胞自噬细胞凋亡

mir-28-5p影响结肠癌细胞迁移活力的分子机制初探

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蛇志 2022年第1期34卷 15-19,37页

作者：覃慧晴桂裕昌许建文潘勤和胡金翠广西医科大学第一附属医院康复医学科广西南宁530021

目的探讨mir-28-5p影响结肠癌细胞迁移活力的分子机制。方法选用结肠癌细胞(HCT116细胞)进行实验,实验分为两部分。第一部分实验:将HCT116细胞分为空白对照组(control组)和爱拉斯汀组(erastin组),control组不进行特殊处理,erastin组使... 详细信息

目的探讨mir-28-5p影响结肠癌细胞迁移活力的分子机制。方法选用结肠癌细胞(HCT116细胞)进行实验,实验分为两部分。第一部分实验:将HCT116细胞分为空白对照组(control组)和爱拉斯汀组(erastin组),control组不进行特殊处理,erastin组使用加有20μM erastin的培养基培养48 h。第二部分实验:将HCT116细胞分为拮抗剂阴性对照组(inhibitor-NC组)、mir-28-5p拮抗剂组(inhibitor组)、激动剂阴性对照组(mimics-NC组)、mir-28-5p激动剂组(mimics组),两组阴性对照分别转染拮抗剂阴性对照混合物和激动剂阴性对照混合物,mir-28-5p拮抗剂组转染mir-28-5p inhibitor以沉默mir-28-5p,mir-28-5p激动剂组转染mir-28-5p mimics以过表达mir-28-5p。用细胞划痕实验检测细胞迁移活力,实时荧光定量pCR(RT-pCR)检测HCT116细胞中mir-28-5p的相对表达水平,蛋白质免疫印迹(WB)检测VAT1L蛋白的相对表达量。比较48 h后erastin组与control组mir-28-5p、VAT1L表达水平及两组细胞划痕迁移率和转染完成后各组细胞mir-28-5p、VAT1L表达水平。结果第一部分:与control组相比,erastin组mir-28-5p的相对表达量、VAT1L蛋白的相对表达量均有降低(均p5);与control组相比,erastin组的细胞迁移率降低(p5)。第二部分:与inhibitor-NC组比较,mir-28-5p inhibitor组mir-28-5p的相对表达量降低(p5);与mimics-NC组比较,mir-28-5p mimics组mir-28-5p的相对表达量增高(p5)。与inhibitor-NC组比较,mir-28-5p inhibitor组VAT1L蛋白的相对表达量升高(p5);与mimics-NC组比较,mir-28-5p mimics组VAT1L蛋白的相对表达量降低(p5)。结论mir-28-5p可能通过抑制VAT1L的表达,以降低结肠癌细胞迁移活力。

关键词： mir-28-5p 结肠癌 VAT1L 细胞活力