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mir-148a-5p参与了高蛋氨酸饮食诱导ApoE^-/-小鼠的肝细胞凋亡

中国组织工程研究 2020年第35期24卷 5632-5637页

作者：马芳张辉李桂忠马胜超沈江涌孙磊郝银菊马生贤姜怡邓宁夏医科大学临床医学院宁夏回族自治区银川市750004 宁夏医科大学基础医学院宁夏回族自治区银川市750004 国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室宁夏回族自治区银川市750004 宁夏血管损伤与修复研究重点实验室宁夏回族自治区银川市750004 宁夏医科大学总医院烧伤整形外科宁夏回族自治区银川市750004 宁夏医科大学药学院宁夏回族自治区银川市750004

背景:高蛋氨酸饮食可以导致ApoE^-/-小鼠发生肝损伤,微小RNA(mirNA)参与细胞存活、分化和细胞凋亡等各种细胞过程,具有重要意义。目的:探讨mir-148a-5p在高蛋氨酸饮食诱导ApoE^-/-小鼠肝细胞凋亡中的作用。方法:12只ApoE^-/-小鼠随机分... 详细信息

背景:高蛋氨酸饮食可以导致ApoE^-/-小鼠发生肝损伤,微小RNA(mirNA)参与细胞存活、分化和细胞凋亡等各种细胞过程,具有重要意义。目的:探讨mir-148a-5p在高蛋氨酸饮食诱导ApoE^-/-小鼠肝细胞凋亡中的作用。方法:12只ApoE^-/-小鼠随机分为2组,每组6只,ApoE^-/-对照组为普通饮食,ApoE^-/-高蛋氨酸组为高蛋氨酸饮食。苏木精-伊红染色观察2组肝组织形态学变化;TUNEL染色观察肝细胞的凋亡情况;Western blot测定Bax、Bcl-2的表达改变;荧光定量pCR检测mir-148a-5p的表达;运用Target Scan靶基因预测软件预测mir-148a-5p的靶基因;双荧光素酶活性实验明确其靶向关系。结果与结论:①与对照组相比,ApoE^-/-高蛋氨酸组肝脏组织肝小叶结构发生明显紊乱,部分细胞呈胞浆疏松化变性,肝细胞凋亡增加,Bax的表达明显上升且Bcl-2的表达显著下降(ppCR结果显示,ApoE^-/-高蛋氨酸组mir-148a-5p的表达增加(p5);③靶基因预测软件提示,Bcl-2为mir-148a-5p的潜在靶基因;④双荧光素酶活性实验确定了mir-148a-5p与Bcl-2的靶向关系(p5);⑤肝细胞中过表达mir-148a-5p后Bax的表达显著上升且Bcl-2的表达明显下降(ppoE^-/-小鼠肝细胞中,mir-148a-5p通过负调控Bcl-2促进肝细胞凋亡,这可能是造成肝损伤的机制之一。

关键词： mir-148a-5p Bcl-2 高蛋氨酸饮食肝细胞凋亡动物

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DTMUV感染DEF后外泌体mir-148a-5p对鸭TLR3通路调控的探究

DTMUV感染DEF后外泌体miR-148a-5p对鸭TLR3通路调控的探究

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作者：郭鸿燕四川农业大学

学位级别：硕士

microRNA（mirNA）是只含有12～23个核苷酸的小RNA,通过外泌体（Exosome）运输参与转录后基因的表达调控和多种生物进程。鸭坦布苏病（Duck Tembusu disease）是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起的以鸭产蛋量下降为主的... 详细信息

microRNA（mirNA）是只含有12～23个核苷酸的小RNA,通过外泌体（Exosome）运输参与转录后基因的表达调控和多种生物进程。鸭坦布苏病（Duck Tembusu disease）是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起的以鸭产蛋量下降为主的禽类疾病,但目前未有DTMUV引起的免疫应答及调控的研究。因此,本研究首先筛选了DTMUV触发的免疫通路并对该宿主免疫通路在DTMUV感染过程中的功能进行了研究。然后我们探究了DEF-Exo mir-148a-5p对免疫通路的调控作用。1.DTMUV感染DEF后免疫通路的筛选及免疫通路作用的探究培养DEF细胞,收集感染DTMUV后12h、24h、36h、48h、60h细胞,用qRT-pCR检测IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、TLR2、TLR3、TLR4转录水平。结果显示DTMUV感染DEF后可引起DEF中IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、TLR2、TLR3、TLR4的转录水平升高（p＜0.05）。将人工合成的TLR3 shRNA和构建的pc DNA3.1（+）-TLR3重组质粒分别转染DEF 24h后再感染DTMUV,通过qRT-pCR检测TLR3下游免疫因子及DTMUV E基因转录水平。结果显示,TLR3下游免疫因子转录水平随TLR3的过表达而升高,随TLR3的沉默表达而降低（p＜0.05）,此外TLR3能下调DTMUV E基因的转录水平（p＜0.05）。DTMUV感染DEF 36h后,分别加入50 IU/mL、100 IU/mL、250 IU/mL、500 IU/mL禽IFN-β。同时将500 IU/mL禽IFN-β加入接毒后的DEF共培养0h,6h,12h,24h。提取细胞全RNA用qRT-pCR对DTMUV E基因的转录水平进行检测。结果显示,IFN-β在一定范围内和处理时间内可下调DTMUV E基因转录水平。表明DTMUV感染能触发TLR3免疫通路,TLR3免疫通路通过分泌IFN-β下调DTMUV E基因转录水平,影响病毒复制。2 DEF-Exo mir-148a-5p对TLR3调控的探究用外泌体分离试剂分离DEF细胞上清中的外泌体。用电镜和western blot对分离物质进行鉴定。电镜结果显示分离到的物质呈现周边凸起、中心凹陷的杯状结构,囊泡小体直径约80 nm,且western blot检测到外泌体表面标志物TSG101和CD9,表明成功分离到DEF-Exo。将接毒的DEF-Exo和未接毒的DEF-Exo分别与pBMC细胞共培养36h后,用qRT-pCR对TLR3和IFN-β转录水平进行检测,用ELISA对TLR3蛋白表达进行检测。结果显示未接毒的DEF-Exo能下调TLR3和IFN-β转录水平,并抑制TLR3的蛋白表达。生物学软件预测发现mir-148a-5p可靶向TLR3,通过双荧光素酶报告基因实验验证mir-148a-5p与TLR3的靶向关系。结果显示模拟剂（mimic）和pmir GLO-TLR3-Wt共转染的细胞中,荧光素酶活性显著降低（p＜0.05）,在mimic和pmir GLO-TLR3-Mut及control和pmir GLO-TLR3-Wt共转染的细胞中,荧光素酶活性没有明显变化（p＞0.05）,表明mir-148a-5p可以与TLR3特异性结合。将mir-148a-5p mimic和control分别转染DEF后感染DTMUV,用qRT-pCR对TLR3和IFN-β转录水平进行检测,用ELISA对TLR3蛋白表达检测。结果显示mir-148a-5p能下调TLR3和IFN-β转录水平,并抑制TLR3的蛋白表达。结果表明:DEF-Exo中mir-148a-5p能靶向TLR3并抑制其表达,影响TLR3通路分泌IFN-β而促进DTMUV复制。

关键词： DTMUV TLR3 外泌体 mir-148a-5p

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干扰mir-148a-5p对肿瘤坏死因子-α诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

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中西医结合心脑血管病杂志 2021年第21期19卷 3674-3678页

作者：陈愿赵子明宋爽崔留义李传荣杨晓航沈蕾刘乾坤郑州市第七人民医院郑州450001

目的探讨干扰mir-148a-5p对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移的影响。方法体外培养VSMC,分为对照组、TNF-α组、TNF-α+anti-mir-NC组和TNF-α+anti-mir-148a-5p组,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qpCR)检... 详细信息

目的探讨干扰mir-148a-5p对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移的影响。方法体外培养VSMC,分为对照组、TNF-α组、TNF-α+anti-mir-NC组和TNF-α+anti-mir-148a-5p组,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qpCR)检测细胞中mir-148a-5p表达水平,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞中细胞核增殖抗原Ki67、上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证mir-148a-5p与第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(pTEN)调控关系。结果与对照组比较,TNF-α组细胞中mir-148a-5p的表达水平升高(p5),G0/G1期明显降低(p5),S期明显升高(p5),细胞迁移数和Ki67、N-cadherin蛋白表达水平明显升高(p5),E-cadherin蛋白表达水平明显降低(p5)。与TNF-α+anti-mir-NC组比较,TNF-α+anti-mir-148a-5p组细胞G0/G1期明显升高(p5),S期明显降低(p5),细胞迁移数和Ki67、N-cadherin蛋白表达水平明显降低(p5),E-cadherin蛋白表达水平明显升高(p5)。双荧光素酶报告基因结果显示,mir-148a-5p可降低pTEN野生型的荧光素酶活性(p5)。结论干扰mir-148a-5p表达可抑制TNF-α诱导的VSMC增殖和迁移。

关键词：血管平滑肌细胞 mir-148a-5p 肿瘤坏死因子-α 细胞增殖细胞迁移实验研究

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