检索结果-南通市图书馆

作者：李汉豪暨南大学

学位级别：硕士

目的:在哺乳动物睾丸的发育过程中,支持细胞(Sertoli cells,SCs)对间质细胞(Leydig cells,LCs)的发育和功能起着重要的调节作用。在这个过程中,存在两类不同发育阶段的支持细胞--未成熟支持细胞(Immature Sertoli cells,ISCs)和成年支... 详细信息

目的:在哺乳动物睾丸的发育过程中,支持细胞(Sertoli cells,SCs)对间质细胞(Leydig cells,LCs)的发育和功能起着重要的调节作用。在这个过程中,存在两类不同发育阶段的支持细胞--未成熟支持细胞(Immature Sertoli cells,ISCs)和成年支持细胞(Adult Sertoli cells,ASCs)。然而,不同发育阶段的SCs对LCs功能的调控方式是否存在差异目前尚未明确。本研究明确了不同阶段SCs的差异mirNA,即mir-145a-5p,并研究mir-145a-5p对LCs的睾酮合成功能的调控作用和方式。方法:体外实验:(1)利用胶原酶和胰蛋白酶的两步酶解法分别从4周龄或8周龄的小鼠睾丸中分离SCs和LCs,并使用ISCs或ASCs的条件培养基上清处理ALCs,q pCR检测ALCs睾酮合成相关基因表达变化;(2)q pCR和原位杂交实验验证ISCs和ASCs的差异mirNA,并以mir-145a-5p作为研究对象进行后续研究;(3)mir-145a-5p模拟物(mimic-mir-145)或抑制剂(inhibitor-mir-145)转染LCs,放射性免疫(RIA)检测培养基上清睾酮水平变化,q pCR检测睾酮合成相关基因表达变化,油红O染色观察细胞内脂滴形态;(4)使用mirNA靶点预测数据库(Target ***)预测mir-145a-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因实验确定mir-145a-5p的靶基因;mimic-mir-145转染LCs,q pCR和Western blot进行靶点验证;(5)利用外泌体分离试剂分离ISCs和ASCs的外泌体,透射电镜(TEM)观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析系统(NTA)分析外泌体的粒径,Western blot检测外泌体标记蛋白的表达;(6)分别用ISCs和ASCs的外泌体处理ALCs,q pCR检测LCs睾酮合成相关基因表达差异;(7)FAM标记的mir-145a-5p转染ISCs后与LCs共培养,并在ISCs培养基中加入外泌体抑制剂GW4869,验证mir-145a-5p由SCs通过外泌体途径转运至LCs中,Western blot验证LCs的靶蛋白是否出现下调。体内实验:(1)使用mir-145a-5p的体内激动剂Agomir-145或拮抗剂Antagomir-145对小鼠睾丸进行注射,RIA检测血清睾酮水平变化,Western blot检测靶基因的蛋白表达水平;(2)TUNEL和HE染色观察睾丸组织状态,油红O染色观察LCs胞内脂滴形态。结果:(1)mir-145a-5p在ISCs的表达量高于ASCs,对LCs转染mimic-mir-145可以抑制睾酮合成途径基因Star、Cyp11a1、Hsd3b1和Hsd17b3的表达并导致LCs细胞内产生脂质积累,降低LCs培养基上清中的睾酮水平。而对LCs转染inhibitor-mir-145的作用则与之相反。(2)mir-145a-5p的靶基因为Sf-1,抑制Sf-1的表达可导致下游的睾酮合成相关基因Star、Cyp11a1、Hsd3b和Hsd17b3的表达水平下调并导致LCs细胞内产生脂质积累。(3)使用ISCs来源的外泌体处理LCs可以抑制睾酮合成途径基因Sf-1、Star、Cyp11a1和Hsd17b3的表达,而ASCs来源的外泌体作用则与之相反。(4)mir-145a-5p在ISCs外泌体中的表达量与在ISCs中的表达量成正相关,抑制ISCs外泌体的分泌使mir-145a-5p进入LCs中的量显著减少。结论:mir-145a-5p在ISCs中高表达并通过ISCs外泌体转运至LCs,靶向Sf-1的3’-UTR,抑制Sf-1的表达,下调睾酮合成相关酶的表达,最终抑制睾酮的生成。

关键词：睾丸支持细胞睾丸间质细胞外泌体 mir-145a-5p Sf-1

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CircERBB2Ip通过mir-145a-5p/Smad5轴调控心肌梗死后血管新生的分子机制研究

CircERBB2IP通过miR-145a-5p/Smad5轴调控心肌梗死后血管新生的分...

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作者：仇治梅遵义医科大学

学位级别：硕士

研究背景:冠状动脉疾病(Coronary artery disease,CAD)是造成全球范围内死亡的最主要原因,因为它阻塞了流向心肌的基本血液流动,导致心肌缺血或心肌梗死(myocardial infarction,MI)。虽然可以通过药物溶栓、介入治疗或外科搭桥等再灌注... 详细信息

研究背景:冠状动脉疾病(Coronary artery disease,CAD)是造成全球范围内死亡的最主要原因,因为它阻塞了流向心肌的基本血液流动,导致心肌缺血或心肌梗死(myocardial infarction,MI)。虽然可以通过药物溶栓、介入治疗或外科搭桥等再灌注手段来实现血运重建,但仍有部分患者因冠脉微循环功能障碍而导致心肌灌注不足或无灌注。因此,如何促进MI后血管新生以重新建立缺血性心肌的血液供应尤为重要。成年哺乳动物心脏有微弱的再生能力,但这种微弱的再生能力通常不足以在心脏损伤后产生具有临床意义的心肌修复。不同的是,新生小鼠心脏在受到损伤时具有强大的自我修复能力。心肌再生的关键因素之一是受损组织的血运重建。在正常心脏中,几乎每个心肌细胞旁都有一根毛细血管,内皮细胞与心肌细胞的比值为3:1。表明在新生的早期就建立了冠脉微血管网络。因此,解构新生小鼠损伤修复中调控血管新生的信号分子及相关通路对改善成人缺血性心脏病患者的预后具有关键影响。近年越来越多的研究表明非编码RNA(Non-codingRNA,ncRNA)是心血管疾病发生发展的重要参与者。目前已有文献报道多种微小RNA(microRNA,mirNA)和长链非编码RNA(Long non-codingRNA,LncRNA)在小鼠新生阶段血管新生中发挥了重要作用,而ncRNA家族的另一成员环状RNA(CircularRNA,CircRNA)是否参与了调控新生阶段的血管新生过程未见报道。通过高通量测序技术分析心脏不同发育阶段或生理病理状态下CircRNA表达情况,发现新生鼠和成年鼠心脏中存在大量差异表达的CircRNA,且不同生理病理状态下CircRNA的表达丰度不同,表明CircRNA与心脏发育、生理和病理过程有着非常密切的关系。本研究通过新生鼠与成年鼠心脏的CircRNA表达谱筛选分析,筛选出环状RNA CircERBB2Ip并探讨其作用机制。第一部分环状RNA的筛选及其对乳鼠心脏再生的影响目的:1、筛选、验证并鉴定新生及成年小鼠心脏中差异表达的CircRNA并分析其基本特征。2、体内实验观察敲低CircERBB2Ip对乳鼠心肌再生的影响。方法:1、筛选并鉴定环状RNA:通过新生鼠及成年鼠心脏中CircRNA表达谱筛选分析,筛选出环状RNA CircERBB2Ip,q RT-pCR检测CircERBB2Ip在心脏组织出生后不同时间点(p1、p7、成年鼠)的表达情况。通过设计跨越CircRNA特异性接头序列的q pCR引物,验证其扩增曲线及溶解曲线。Sanger测序确定其环化位点及环化位点序列。RNA酶R(RNase R)检测CircRNA的稳定性,胞质胞核分离实验确定CircRNA的亚细胞定位。2、结扎左冠状动脉前降支建立乳鼠心肌梗死模型,将表达靶向CircERBB2Ip的shRNA的ADV载体或空载体注入到左心室心肌中,观察敲低CircERBB2Ip对乳鼠心肌梗死后心功能、纤维化程度、心肌细胞增殖及血管生成能力的影响。结果:1、通过新生鼠及成年鼠心脏中CircRNA表达谱筛选出CircERBB2Ip,q RT-pCR结果证实在心脏发育过程中,小鼠心脏组织的CircERBB2Ip表达显著降低。2、pCR扩增结果提示CircRNA引物的溶解曲线为单峰,Tm值在正常范围之内,电泳条带单一,分子量大小正确,Sanger测序结果为单峰,环化位点正确。RNase R消化降解后,线性ERBB2Ip的mRNA水平显著降低,而CircERBB2Ip能够抵抗RNase R。胞质胞核分离实验表明CircERBB2Ip主要定位于细胞质。3、在乳鼠心肌梗死模型中,与注射对照腺病毒组(ADV-sh NC)相比,注射ADV-sh CircERBB2Ip组小鼠表现为:心功能下降,心脏纤维化程度加重,瘢痕面积上升。敲低CircERBB2Ip后对心肌细胞的增殖没有影响,但显著减少梗死心肌周围CD31+毛细血管密度和α-SMA+小动脉密度。结论:1、在小鼠心脏发育过程中,CircERBB2Ip的表达显著降低;2、敲低CircERBB2Ip不利于乳鼠心肌梗死后心脏再生及减弱血管新生。第二部分CircERBB2Ip调控心肌微血管内皮细胞(CMECs)的生物学行为改善心肌梗死后心脏修复目的:1、体内实验观察CircERBB2Ip对成年小鼠心肌梗死后心脏修复的影响。2、体外观察CircERBB2Ip对CMECs增殖、迁移及成管的影响。方法:1、构建具有心脏特异性过表达CircERBB2Ip的重组9型腺相关病毒(AAV9-CircERBB2Ip),建立小鼠心肌梗死模型,尾静脉注射过表达小鼠心脏中的CircERBBIp,观察过表达CircERBB2Ip后对小鼠心肌梗死后心功能、纤维化程度及血管生成能力的影响。2、CMECs的培养:采用酶消化法联合差速贴壁法培养CMECs。免疫荧光(IF)鉴定CMECs标

关键词：心肌微血管内皮细胞 CircERBB2Ip mir-145a-5p 血管新生

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mir-145a-5p修饰的小胶质细胞在脊髓损伤治疗中的作用和机制研究

miR-145a-5p修饰的小胶质细胞在脊髓损伤治疗中的作用和机制研究

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第十四届全国免疫学学术大会

作者：李鹏辉胡昳旸梁世倩胡学昱王哲秦鸿雁中国人民解放军空军军医大学基础医学院医学遗传与发育生物学教研室中国人民解放军空军军医大学第一附属医院骨科

目的:mir-145a-5p是促进M2型小胶质细胞极化的一类mirNAs分子,移植mir-145a-5p修饰的M2型小胶质细胞能够促进小鼠脊髓损伤的修复,为临床治疗脊髓损伤患者提供重要的思路。方法:体外培养原代小胶质细胞,获得单纯的M0、M1 (LpS+IFN-γ)和M... 详细信息

目的:mir-145a-5p是促进M2型小胶质细胞极化的一类mirNAs分子,移植mir-145a-5p修饰的M2型小胶质细胞能够促进小鼠脊髓损伤的修复,为临床治疗脊髓损伤患者提供重要的思路。方法:体外培养原代小胶质细胞,获得单纯的M0、M1 (LpS+IFN-γ)和M2 (IL-4)型小胶质细胞,并在此基础上过表达mir-145a-5p,获得过表达mir-145a-5p的M0、M1和M2型小胶质细胞;通过RT-qpCR、Western Blot检测不同组中促炎促损伤的M1型小胶质细胞标记物的表达,如TNF-α、 IL-6和iNOS等,以及抗炎促修复的M2型小胶质细胞标记物的表达,如Arg1、MR和YM1等;将上述细胞的培养上清与损伤的海马神经元共孵育,观察神经元的凋亡数量;将96只8周雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、单纯SCI组、移植M2型和过表达mir-145a-5p的M2型小胶质细胞组,并损伤后3d、7d、14d和28d取材,通过小鼠BMS、游泳评分,观察不同组小鼠的运动能力;进行iNOS/iba1、Arg1/iba1免疫荧光染色,观察损伤区小胶质细胞的极化;进行TUNEL染色,观察损伤区神经元的凋亡;进行CS56、GFAp、HE、Nissl、LFB染色,观察损伤区瘢痕形成、神经组织的分布等;通过ELISA检测小鼠外周血中TGF-β、IL-6和IL-12炎性因子,评价炎性反应;通过BMS、游泳评分,观察小鼠的运动能力。结果:体外实验中过表达mir-145a-5p的M1型小胶质细胞比单纯的M1型小胶质细胞表达较少的促炎分子TNF-α、IL-6和iNOS,且与受损的神经元共培养后,凋亡的神经元数量显著减少;过表达mir-145a-5p的M2型小胶质细胞比单纯的M2型小胶质细胞表达较多的抗炎分子Arg1、MR和YM1;体内实验中,移植过表达mir-145a-5p的M2型小胶质细胞组,SCI得到显著修复,表现在:小鼠后肢运动BMS和游泳评分提高;Arg1/iba1标记的M2型小胶质细胞增多,而iNOS/iba1标记的M1型小胶质细胞显著减少;免疫组化染色可见损伤区抑制性基质分子CS56和GFAp标记的瘢痕组织减少,MAp2、Nissl和LFB标记的神经元和髓鞘组织增加。结论:mir-145a-5p能够促进M2型小胶质细胞极化,促进小鼠脊髓损伤的修复。

关键词：脊髓损伤神经免疫炎症小胶质细胞 mir-145a-5p

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Regulation of hepatic lipid metabolism by intestine epithelium-derived exosomes

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Life Metabolism 2023年第6期2卷 42-57页

作者： Tiange Feng Yuan Liang Lijun Sun Lu Feng Jiajie Min Michael W.Mulholland Yue Yin Weizhen Zhang Department of physiology and pathophysiology School of Basic Medical Sciencesand Key Laboratory of Molecular Cardiovascular ScienceMinistry of EducationPeking UniversityBeijing 100191China Department of Surgery University of Michigan Medical CenterAnn ArborMI 48109United States Department of pharmacology School of Basic Medical Sciencesand Key Laboratory of Molecular Cardiovascular ScienceMinistry of EducationPeking UniversityBeijing 100191China

The“gut-liver axis”is critical for the control of hepatic lipid homeostasis,where the intestine affects the liver through multiple pathways,such as nutrient uptake,gastrointestinal hormone release,and gut microbiota homeostasis.Whether intestine-originated exosomes mediate the gut’s influence on liver steatosis remains unknown.Here,we aimed to determine whether intestinal epithelium-derived exosomes(intExos)contribute to the regulation of hepatic lipid metabolism.We found that mouse intExos could be taken up by hepatic cells.Mice fed high-fat diet(HFD)received intExos showed strong resistance to liver steatosis.MicroRNA sequencing of intExos indicated the correlation between mir-21a-5p/mir-145a-5p and hepatic lipid metabolism.Both liver overexpression of mir-21a-5p and intExos containing mir-21a-5p alleviated hepatic steatosis in mice fed with HFD.Mechanistically,mir-21a-5p suppressed the expression of Ccl1(C-C motif chemokine ligand 1)in macrophages,as well as lipid transport genes Cd36(cluster of differentiation 36)and Fabp7(fatty acid binding protein 7)in hepatocytes.Liver-specific inhibition of mir-145a-5p significantly reduced hepatic lipid accumulation in mice fed with HFD through negatively regulating the expression of Btg1(BTG anti-proliferation factor 1),leading to an increase of stearoyl-CoA desaturase-1 and lipogenesis.Our study demonstrates that intExos regulate hepatic lipid metabolism and non-alcoholic fatty liver dis-ease(NAFLD)progression via mir-21a-5p and mir-145a-5p pathways,providing novel mediators for the gut-liver crosstalk and potential targets for regulating hepatic lipid metabolism.

关键词： exosome non-alcoholic fatty liver disease mir-21a-5p mir-145a-5p lipid metabolism

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HBx通过抑制microRNA-145a-5p促进小鼠肝癌发生

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第三军医大学学报 2021年第18期43卷 1751-1761页

作者：杜彬周梦瑶毋楠张思遥黄欣况钦吴勇冯涛重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心药学院生物化学与分子生物研究中心重庆400016

目的通过研究mirNA-145a-5p在肝前体细胞和小鼠感染乙肝病毒X(hepatitis B virus X,HBx)不同时间的变化情况,初步探讨HBx导致肝癌发生的机制。方法通过慢病毒将HBx基因转染到14-19肝前体细胞中,构建HBx-EGFp-14-19细胞系,并通过肝门静脉... 详细信息

目的通过研究mirNA-145a-5p在肝前体细胞和小鼠感染乙肝病毒X(hepatitis B virus X,HBx)不同时间的变化情况,初步探讨HBx导致肝癌发生的机制。方法通过慢病毒将HBx基因转染到14-19肝前体细胞中,构建HBx-EGFp-14-19细胞系,并通过肝门静脉将HBx-EGFp-14-19细胞悬液注入KM小鼠体内,建立具有完整免疫系统的HBx小鼠模型,并分别于30、90、180、360 d收集肝脏组织。通过qRT-pCR和Western blot检测HBx在HBx-EGFp-14-19细胞和HBx小鼠中的表达。将mir-145a-5p mimics和inhibitor转染到HBx-EGFp-14-19细胞和饲养180 d HBx小鼠中,qRT-pCR检测mir-145a-5p、c-Myc、Kras、细胞凋亡和细胞周期因子的RNA表达,Western blot检测c-Myc、Kras、细胞凋亡和细胞周期因子的蛋白质表达,CCK-8检测细胞增殖。结果成功构建能够稳定表达HBx的细胞模型和动物模型。HBx过表达后,mir-145a-5p在HBx-EGFp-14-19细胞和HBx小鼠中的表达下调,而c-Myc和Kras的表达升高。使用mir-145a-5p模拟物(mimic/agomir)可以抑制细胞增殖并下调c-Myc、Kras、Bcl-2、CDK4、Cyclin E、CyclinD1的表达,并上调Bad和Bax的表达,而mir-145a-5p抑制剂(inhibitor/antagomir)与mir-145a-5p模拟物组的结果相反。结论 HBx过表达导致小鼠肝癌发生,其机制可能与HBx调节mir-145a-5p及其靶基因c-Myc和Kras的表达和抑制细胞凋亡有关。

关键词： HBx 肝癌 mir-145a-5p c-Myc Kras

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