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mir-137-3p靶向MAX基因对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响

中国畜牧兽医 2023年第5期50卷 1928-1937页

作者：孟超群李成萍赵薇秦旭勇周国利聊城大学生命科学学院聊城252000

【目的】研究mir-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量pCR检测mir-137-3p相对表达量;将mir-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴... 详细信息

【目的】研究mir-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量pCR检测mir-137-3p相对表达量;将mir-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量pCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBpα)、C/EBpβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(ppARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABp4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBpβ、ppARγ和FABp4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测mir-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3′-UTR区与mir-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将mir-137-3p mimics、NC与3′-UTR-WT和3′-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测mir-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将siMAX、siNC转染3T3-L1细胞,利用实时荧光定量pCR检测C/EBpα、C/EBpβ、ppARγ和FABp 4基因相对表达量,利用Western blotting检测C/EBpβ、ppARγ和FABp4蛋白表达水平。【结果】在3T3-L1细胞的成脂分化过程中,与第0天相比,第2、4、6和8天mir-137-3p相对表达量均极显著降低(pmir-137-3p mimics组脂滴明显减少、变小,C/EBpα、C/EBpβ、ppARγ和FABp 4基因相对表达量极显著或显著降低(pppβ、ppARγ和FABp4蛋白表达下调,mir-137-3p inhibitor组油红O观察结果、成脂分化标志基因mRNA和蛋白表达情况则与之相反。靶基因预测结果表明,MAX的3′-UTR区序列与mir-137-3p存在预测结合位点,且在不同物种间具有高度保守性。双荧光素酶报告试验显示,mir-137-3p mimics组3′-UTR-WT双荧光素酶活性极显著降低(ppppα、C/EBpβ、ppARγ和FABp 4基因mRNA表达水平极显著下调(ppβ、ppARγ和FABp4蛋白表达下降。【结论】内源性mir-137-3p在3T3-L1细胞的成脂分化过程中表达水平降低,mir-137-3p可能通过下调MAX基因的表达抑制3T3-L1细胞成脂分化。

关键词： mir-137-3p 3T3-L1细胞 MAX基因脂肪细胞分化

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mir-137-3p调控脂肪细胞分化及其机制研究

miR-137-3p调控脂肪细胞分化及其机制研究

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作者：薛洁天津医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究通过在体实验探讨高脂喂养14周后的DIO小鼠附睾脂肪组织:mir-137-3p、LKB1/AMpK/m TOR信号通路、自噬水平这三者之间与脂质合成代谢及能量储存是否存在关系。离体实验通过对3T3-L1脂肪前体细胞mir-137-3p的表达进行干预,观... 详细信息

目的:本研究通过在体实验探讨高脂喂养14周后的DIO小鼠附睾脂肪组织:mir-137-3p、LKB1/AMpK/m TOR信号通路、自噬水平这三者之间与脂质合成代谢及能量储存是否存在关系。离体实验通过对3T3-L1脂肪前体细胞mir-137-3p的表达进行干预,观察细胞分化情况,并检测相应的分子水平改变,探究mir-137-3p、LKB1/AMpK/m TOR信号通路、自噬水平这三者之间是否存在级联关系,通过调控彼此间的相关基因转录和翻译水平,从而导致脂质合成代谢和能量储存发生异常。mir-137-3p对3T3-L1脂肪前体细胞分化的作用及机制研究。方法:1.构建饮食诱导的肥胖小鼠模型(DIO,diet-induced obesity)。选择6周龄C57BL/6J雄性小鼠作为研究对象。购买后饲养于天津医科大学实验动物研究中心,适应一周后,给予标准饲料(CFD,chow fat diet)或高脂饲料(HFD,high fat diet)喂养。每天定时监测进食量,每周定时检测体重并记录。2.高脂干预14周后,处死取材。HE染色:观察附睾脂肪和肝脏细胞形态的变化;分析血清中血脂代谢的变化;RT-pCR检测脂肪mir-137-3p的m RNA表达;Western Blot检测附睾脂肪内LKB1/AMpK/m TOR信号通路及自噬相关蛋白水平的表达。3.通过离体实验3T3-L1脂肪前体细胞转染mir-137-3p激动剂和抑制剂后,给予白色脂肪诱导液诱导其分化。CCK-8法检测mir-137-3p对3T3-L1细胞增殖的影响;油红O染色观察mir-137-3p对3T3-L1细胞分化形态的影响及脂滴生成的情况;酶标仪检测脂质含量的改变;RT-pCR法检测过表达mir-137-3p的m RNA表达,脂肪生成相关基因和分解基因m RNA表达;Western Blot检测LKB1/AMpK、m TOR/ppARγ信号通路及自噬相关分子的蛋白水平的表达,探讨mir-137-3对3T3-L1脂肪前体细胞分化的作用及机制。4.通过双萤光素酶检测法:预测并验证mir-137-3p与靶基因LKB1的关系。结果:***小鼠摄食量和体重增加,血脂代谢紊乱。HE染色:附睾脂肪细胞直径增大,肝细胞脂肪变性。***-137-3p的m RNA水平在附睾脂肪中的表达量升高最为明显。3.高脂饮食的DIO小鼠附睾脂肪组织中,LKB1/p-AMpK蛋白表达降低,p-m TOR/ppARγ蛋白表达升高,自噬信号通路基因蛋白的表达均变化,表明自噬被抑制。***-8法检测转染mir-137-3p激动剂或抑制剂,均对3T3-L1细胞增殖无影响。5.过表达mir-137-3p,油红O染色观察3T3-L1细胞分化形态的影响及脂滴生成增多;RT-pCR检测脂肪生成相关基因(SREBp1和C/EBpα)的m RNA水平升高;脂质分解基因(HSL和LpL)的m RNA表达水平下降。LKB1/p-AMpK蛋白表达水平下降,p-m TOR/ppARγ表达上调,自噬被抑制。6.抑制mir-137-3p,油红O染色观察3T3-L1细胞分化形态的影响及脂滴生成减少。RT-pCR检测脂肪生成相关基因(SREBp1和C/EBpα)的m RNA水平降低;脂质分解基因(HSL和LpL)的m RNA表达水平升高。LKB1/p-AMpK蛋白表达水平升高,p-m TOR/ppARγ表达下调,自噬被激活。7.双荧光素酶报告系统分析验证mir-137-3p直接靶定LKB1。结论:1.体内实验:DIO模型造模成功。在高脂喂养的高能量状态下,mir-137-3p、LKB1/AMpK/m TOR信号通路、自噬水平均发生明显变化。2.体外实验:过表达mir-137-3p促进3T3-L1脂肪前体细胞分化,促进脂质合成抑制脂质分解。抑制mir-137-3p抑制3T3-L1脂肪前体细胞分化,抑制脂质合成抑制脂质分解。3.机制研究:mir-137-3p、LKB1/AMpK/m TOR信号通路、自噬三者之间存在级联关系,通过调控彼此间的相关基因转录和翻译水平,从而导致脂质合成代谢和能量储存发生异常。***-137-3p的其中之一靶基因是LKB1。

关键词： DIO小鼠 mir-137-3p LKB1/AMpK/mTOR 自噬

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LncRNA OIp5-AS1上调pTN表达促进骨肉瘤耐药的分子机制研究

LncRNA OIP5-AS1上调PTN表达促进骨肉瘤耐药的分子机制研究

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作者：孙星星上海交通大学

学位级别：硕士

背景:骨肉瘤是常见的原发性恶性骨肿瘤,好发于儿童和青少年,恶性程度高,易发生肺部转移。骨肉瘤化疗耐药的发生导致部分患者预后不佳。目前关于骨肉瘤耐药现象发生的具体机制尚不十分清楚,因此探寻骨肉瘤耐药机制,逆转骨肉瘤耐药现象的... 详细信息

背景:骨肉瘤是常见的原发性恶性骨肿瘤,好发于儿童和青少年,恶性程度高,易发生肺部转移。骨肉瘤化疗耐药的发生导致部分患者预后不佳。目前关于骨肉瘤耐药现象发生的具体机制尚不十分清楚,因此探寻骨肉瘤耐药机制,逆转骨肉瘤耐药现象的发生,对改善患者生存具有重要临床意义。LncRNAs是一类核苷酸数目超过200个,但是缺乏蛋白编码能力的长链RNA,它可以从多个水平对基因进行表达调控,包括转录和转录后水平,从而广泛参与生物体的各种生命活动。LncRNA OIp5-AS1已经被证实在多个肿瘤中具有促进肿瘤进展的功能,广泛参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡和耐药等病理过程。然而LncRNA OIp5-AS1在骨肉瘤耐药中发挥的作用以及分子机制目前尚不清楚。目的探讨LncRNA OIp5-AS1在骨肉瘤耐药中的作用及其分子机制。方法(1)qRT-pCR检测LncRNA OIp5-AS1在骨肉瘤亲本细胞MG63和耐药细胞MG63/ADR中的表达水平;(2)CCK8实验、EDU增殖实验、克隆形成实验、流式细胞凋亡实验检测LncRNA OIp5-AS1、mi R-137-3p和pTN在骨肉瘤细胞耐药中的作用;(3)裸鼠成瘤实验检测体内水平LncRNA OIp5-AS1在骨肉瘤耐药中的作用;(4)双荧光素酶报告基因实验、qRT-pCR和蛋白免疫印迹实验验证LncRNA OIp5-AS1与mi R-137-3p以及mi R-137-3p与pTN的靶向调控关系。结果(1)LncRNA OIp5-AS1在骨肉瘤耐药细胞MG63/ADR中的表达高于亲本细胞MG63;(2)敲减LncRNA OIp5-AS1后,MG63/ADR细胞对阿霉素的耐药性下降,凋亡水平增加;体内实验裸鼠移植瘤的体积与质量均下降;(3)过表达mi R-137-3p或敲减pTN,MG63/ADR细胞对阿霉素的耐药性下降,克隆形成能力下降;敲减mi R-137-3p或过表达pTN,MG63细胞对阿霉素的耐药性增强,克隆形成能力增强;(4)双荧光素酶报告基因实验、qRT-pCR和蛋白免疫印迹实验证实mi R-137-3p是LncRNA OIp5-AS1的下游靶基因;pTN是mi R-137-3p的下游靶基因。结论LncRNA OIp5-AS1通过海绵吸附负调控mi R-137-3p,上调pTN的表达从而促进骨肉瘤细胞耐药现象的发生。LncRNA OIp5-AS1或许可以成为潜在的逆转骨肉瘤化疗耐药的分子靶点。

关键词：骨肉瘤耐药 LncRNA OIp5-AS1 mir-137-3p pTN

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