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环状RNA circLIFR在非小细胞肺癌中的功能及作用机制研究

环状RNA circLIFR在非小细胞肺癌中的功能及作用机制研究

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作者：江美娜宁波大学

学位级别：硕士

背景及意义非小细胞肺癌（non-small cell lung caner,NSCLC）是肺癌的主要类型,其发病率和致死率居恶性肿瘤前列。尽管靶向治疗和免疫治疗在NSCLC中取得了进步,但患者的五年生存率仍较低,总体预后较差。因此,为了降低巨大的发病率和死... 详细信息

背景及意义非小细胞肺癌（non-small cell lung caner,NSCLC）是肺癌的主要类型,其发病率和致死率居恶性肿瘤前列。尽管靶向治疗和免疫治疗在NSCLC中取得了进步,但患者的五年生存率仍较低,总体预后较差。因此,为了降低巨大的发病率和死亡率,迫切需要探索NSCLC的新靶点和新型标志物,以及阐明NSCLC发生发展的分子机制。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类主要由外显子反向剪接产生的非编码的环形RNA分子,通过调节转录、充当microRNA诱饵、蛋白质支架,竞争结合蛋白质等多种形式参与细胞增殖和肿瘤发生进程。但与NSCLC发生发展相关的新型circRNA,及其竞争性内源RNA（competiting endogenous RNA,ceRNA）作用机制仍不清楚。本研究利用circRNA表达芯片筛选出肺癌相关的circLIFR,分析其和临床病理因素的潜在关系,研究其对癌细胞生长、增殖、凋亡以及周期的影响,明确circLIFR通过与抑癌基因PTEN竞争结合mir-1305进而影响下游PI3K/AKT通路,阐明circLIFR在NSCLC中的功能和作用机制,为探寻新型诊断标志物、预后生物标志物和分子治疗靶点提供理论基础。方法（1）通过GEO数据库获得NSCLC患者circRNA表达芯片数据（GSE126533）,以及正常肺上皮细胞（BEAS-2B）和两株NSCLC细胞（A549,HCC827）的测序数据（GSE152434）,按照Pvalue2,排行前100名,未有文章发表,与肿瘤生长增殖相关,表达丰度最高,初步选定circLIFR（hsairc072298）作为研究目的分子。（2）设计背靠背引物特异性扩增成环位点、RNaseR消化以及放线菌素D处理验证circLIFR的环形结构和稳定性。RT-qPCR检测circLIFR在NSCLC细胞中的表达,核质分离实验检测circLIFR的亚细胞定位。RT-qPCR检测circLIFR在NSCLC患者中的表达情况,通过卡方分析明确circLIFR与临床病理特征的潜在关系。（3）构建circLIFR的过表达质粒和合成siRNA:向NSCLC细胞中转染过表达质粒和siRNA,通过MTT、克隆形成、流式细胞术等方法分别检测circLIFR对NSCLC细胞生长、增殖和细胞凋亡的影响。（4）数据库预测与circLIFR潜在结合的mir-1305。敲低和过表达circLIFR后RT-qPCR检测mir-1305的表达。双萤光素酶报告基因实验检测circLIFR与mir-1305的结合位点。RT-qPCR检测NSCLC组织中mir-1305的表达丰度。皮尔森相关性分析明确circLIFR与mir-1305在NSCLC组织中的相关性。（5）共转染过表达circLIFR质粒和mir-1305,通过MTT、克隆形成、流式细胞术等方法检测circLIFR回复mir-1305的细胞生物学功能。（6）双萤光素酶实验验证mir-1305与PTEN之间的靶向结合关系。Western Blot分析circLIFR对PTEN下游的PI3K/AKT的调控作用。结果（1）Hsairc072298在NSCLC芯片中显著低表达,是LIFR产生的表达丰度最高的环形转录本。背靠背引物仅能扩增包含成环位点的目的片段,circLIFR耐受RNase R消化和放线菌素D干扰。（2）CircLIFR在NSCLC细胞中低表达,主要定位于细胞质中。CircLIFR在NSCLC组织中显著低表达,在肺癌患者全血中显著高表达,并且和肿瘤大小、单发多发、分化程度和病理类型相关。（3）过表达circLIFR可显著抑制NSCLC细胞的生长、增殖和促进细胞的凋亡。敲低circLIFR表达可显著促进NSCLC细胞的生长、增殖和抑制细胞的凋亡。CircLIFR的变化对细胞周期没有影响。（4）CircLIFR与mir-1305存在直接的靶向关系,mir-1305在NSCLC中显著上调,且与circLIFR的表达呈负相关。CircLIFR可以回复mir-1305促进NSCLC细胞生长增殖的作用,以及回复mir-1305抑制细胞凋亡的作用。（5）mir-1305与PTEN 3'UTR存在直接靶向关系,circLIFR可以回复mir-1305对PTEN的抑制。CircLIFR通过与PTEN竞争结合mir-130形成调节轴,从而影响下游PI3K/AKT中AKT的磷酸化。结论（1）肺癌相关的circLIFR具有稳定的环形结构,在NSCLC细胞中低表达,主要定位于细胞质中。CircLIFR在NSCLC组织中低表达,且与肿瘤大小、病灶单发多发情况、肿瘤分化程度和病理类型有关。全血circLIFR能用来区分健康人、良性肺

关键词：环状RNA circLIFR mir-1305 磷酸酶及张力蛋白同源的基因非小细胞肺癌

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