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益气活血通络方对脊髓型颈椎病模型大鼠mir-126a-5p及VEGF信号通路的影响

天津医药 2024年第3期52卷 273-277页

作者：刘丹唐占英李攀袁薇娜李芳芳陈倩胡志俊上海中医药大学附属龙华医院康复医学科 200032

目的探讨益气活血通络方对脊髓型颈椎病模型大鼠微小RNA-126a-5p(mir-126a-5p)及血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的影响。方法30只健康雄性SD大鼠按照随机数字表法均分为假手术组、模型组和中药组。模型组、中药组均制备脊髓型颈椎病模... 详细信息

目的探讨益气活血通络方对脊髓型颈椎病模型大鼠微小RNA-126a-5p(mir-126a-5p)及血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的影响。方法30只健康雄性SD大鼠按照随机数字表法均分为假手术组、模型组和中药组。模型组、中药组均制备脊髓型颈椎病模型。中药组给予益气活血通络方灌胃,假手术组、模型组给予生理盐水灌胃,均为12周。各组干预结束后进行大鼠行为学测试,测定机械性刺激阈值和热刺激回缩时间。处死大鼠,HE染色观察各组椎间盘软骨终板结构的差异。TUNEL染色观察大鼠椎间盘纤维环细胞变化。实时荧光定量聚合酶链式反应检测大鼠椎间盘纤维环组织mir-126a-5p和VEGF mRNA。采用Western blot法检测大鼠椎间盘纤维环组织VEGF蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠椎间盘血管芽数目减少,大鼠椎间盘纤维环细胞破坏明显、大量凋亡且细胞密度降低;模型组和中药组机械性刺激阈值降低,热刺激回缩时间缩短,mir-126a-5p水平降低,VEGF mRNA和蛋白表达水平升高(p5)。与模型组比较,中药组大鼠椎间盘血管芽数目增加,大鼠椎间盘纤维环细胞破坏减轻,大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡减少且细胞密度增加,机械性刺激阈值升高,热刺激回缩时间延长,mir-126a-5p水平增加,VEGF mRNA和蛋白表达水平降低(p5)。结论益气活血通络方治疗脊髓型颈椎病的机制可能与上调mir-126a-5p、下调VEGF表达有关。

关键词：颈椎病血管内皮生长因子类椎间盘脊髓益气活血通络方 mir-126a-5p

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颌骨骨髓间充质干细胞外泌体通过mir-126a-5p调控Hoxa11影响跨胚层游离骨移植愈合的机制研究

颌骨骨髓间充质干细胞外泌体通过miR-126a-5p调控Hoxa11影响跨胚...

引用

作者：郝雨佳山西医科大学

学位级别：硕士

目的:临床上,大面积的骨缺损是口腔软硬组织修复面临的巨大挑战,每年大概1300万的骨缺损患者中,大于25毫米的骨缺损仅有10%的几率能够自愈。通过自体移植游离的四肢骨植骨块是修复颌骨大面积缺损的最好方法,然而术后仍有5%-10%的患者出... 详细信息

目的:临床上,大面积的骨缺损是口腔软硬组织修复面临的巨大挑战,每年大概1300万的骨缺损患者中,大于25毫米的骨缺损仅有10%的几率能够自愈。通过自体移植游离的四肢骨植骨块是修复颌骨大面积缺损的最好方法,然而术后仍有5%-10%的患者出现愈合延迟。为了优化目前的疗法,对自体游离骨移植愈合机制的探索十分必要。从胚胎发育学的角度讲,颌面骨是通过膜内骨化过程从神经嵴衍生出来的;四肢骨是通过软骨化骨过程从中胚层衍生形成的。从细胞功能来讲,四肢骨来源的骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)表达同源盒结构基因a11(Homeobox a11 gene,Hoxa11),而颌骨BMSCs(Mandible mesenchymal stem cells,M-MSCs)几乎不表达Hoxa11;从干细胞分化的角度讲,M-MSCs的成骨分化能力高于四肢骨BMSCs。考虑到颌骨和四肢骨之间的这些差异,二者的骨愈合机制也可能不同。然而在颌骨与四肢骨的这种跨胚层游离骨移植中,颌骨受植床如何调控四肢植骨块内BMSCs分化,目前仍未研究。本研究的目的是深入了解神经嵴源性的M-MSCs分泌出的外泌体(Mandible mesenchymal stem cell-derived exosomes,M-MSC-Exos)对跨胚层游离骨移植中骨生成的影响及相关作用机制,评估受植床的M-MSCs-Exos所负载的微RNA(micro RNA,mirNA)货物通过调控骨移植微环境从而影响四肢骨植骨块的分化、愈合。本研究旨在通过初步揭示不同胚层源性的BMSCs外泌体相互通信、彼此调控的机制,开辟跨胚层游离骨移植的新思路。方法:1.建立大鼠自体颌骨-股骨游离移植的模型,使用骨形态分析系统对Masson、Goldner、H&E染色的石蜡切片进行分析,观察移植区的缺损填充情况、新生骨结构、类骨质相对含量和矿化骨相对含量;观察移植区缺损处的成骨活跃程度。2.创建M-MSCs和股骨骨髓间充质干细胞(Femur mesenchymal stem cells,F-MSCs)的Transwell共培养体系;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction,RT-q pCR)反映M-MSCs对F-MSCs的成骨影响效应。3.超速离心提取了颌骨骨髓间充质干细胞分泌出的外泌体(Mandible mesenchymal stem cell-derived exosomes,M-MSC-exos);纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle tracking analysis,NTA)以及透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)进行表征。4.通过向M-MSCs和F-MSCs的Transwell共培养体系中加入外泌体抑制剂GW4869,配合RT-q pCR,验证了外泌体在模拟各个骨移植的细胞系统中起着信号通讯的作用。5.运用了小RNA高通量测序平台,筛选M-MSC-exos和股骨骨髓间充质干细胞分泌的外泌体(Femur mesenchymal stem cell-derived exosomes,F-MSC-exos)的内容物中小RNA表达量的区别,并筛选出具有统计学差异的且参与调控骨生成的mir-126a-5p。6.运用慢病毒转染,对M-MSCs实施mir-126a-5p的敲低,共培养体系内探索mir-126a-5p敲低的M-MSCs对于F-MSCs成骨能力的影响。双萤光素酶报告基因检测证明mir-126a-5p与Hoxa11具有结合作用。结果:1.当同样的股骨植骨块移植到不同的受植床(下颌骨和股骨)时,移植区存在成骨的愈合差异。两组相比较:股骨植骨块移植修复下颌骨骨缺损后,新生骨骨小梁相互均匀交织,可见丰富的新生血管;成骨趋势增强,矿化骨成分相对较高,Runx2,OSX、OCN、Col-1等成骨标志表达较高。而股骨植骨块游离移植修复股骨缺损后,植骨块与受植床之间存在更多不规则的胶原排列,骨小梁排列紊乱,矿物质/有机基质比率相对较低,Runx2,OSX、OCN、Col-1等成骨标志表达相对较低。2.通过建立M-MSCs和F-MSCs的共培养体系,RT-q pCR结果发现当M-MSCs微环境干预F-MSCs后,Runx2,OSX、OCN、Col-1等成骨标志有所上调。3.M-MSCs和F-MSCs的共培养体系经过外泌体抑制剂GW4869干预后,RT-q pCR结果发现,当阻断掉颌骨微环境的外泌体时,F-MSCs原被上调过的成骨相关指标Runx2,OSX、OCN、Col-1等趋势被逆转,提示外泌体在细胞通讯水平上起到关键作用。4.提取以及鉴定了M-MSC-exos

关键词：自体骨移植骨髓间充质干细胞外泌体成骨分化 mir-126a-5p

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