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mir-124a通过抑制神经元细胞凋亡促进脊髓损伤的修复

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miR-124a通过抑制神经元细胞凋亡促进脊髓损伤的修复

作者：赵帅帅延安大学

学位级别：硕士

背景脊髓损伤会导致脊髓神经纤维束的损伤,并伴随低于损伤水平的运动、感觉和自主功能的损害甚至丧失。因此寻找促进脊髓损伤修复的特异性靶点具有重要的临床意义。近年来的相关研究结果表明,mirNA参与脊髓损伤的继发性损伤及修复过程。... 详细信息

背景脊髓损伤会导致脊髓神经纤维束的损伤,并伴随低于损伤水平的运动、感觉和自主功能的损害甚至丧失。因此寻找促进脊髓损伤修复的特异性靶点具有重要的临床意义。近年来的相关研究结果表明,mirNA参与脊髓损伤的继发性损伤及修复过程。Micro RNA-124a(mir-124a)是中枢神经系统中表达较丰富的mirNA之一,但其在体内对神经元发育和功能的影响尚不明确。有研究显示,脊髓损伤后mir-124a的表达降低具有时间依赖性,推测其表达降低的时程可能反映细胞的死亡。但是过表达mir-124a后是否会抑制神经元细胞的凋亡,进而促进脊髓损伤的恢复?这个科学问题亟待阐明。目的1.阐明过表达mir-124a后对大鼠脊髓损伤后神经元细胞凋亡的影响。2.阐明mir-124a mimics对PC12细胞凋亡的作用。方法1.将SD大鼠随机分为四组:假手术(Sham)组、脊髓损伤(SCI)组、脊髓损伤+空白病毒对照(SCI+AAV-NC)组和脊髓损伤+过表达病毒(SCI+AAV-mir-124a)组;采用BBB评分对各组大鼠运动功能进行评估,HE染色、TUNEL染色与免疫荧光染色观察损伤局部细胞凋亡情况,通过Western blotting、q RT-PCR技术检测mir-124a、Bax、Bcl-2、Caspase 3等的表达水平。2.将细胞分为对照(Control)组、损伤(HO)组、空白对照预处理(HO+NC)组和模拟物预处理(HO+mir-124a mimics)组;光镜下观察各组细胞生长状态;Annexin V-FITC/PI染色和免疫荧光染色观察各组细胞凋亡情况;通过Western blotting、q RT-PCR技术检测mir-124a、Bax、Bcl-2、Caspase 3等的表达水平。结果1.脊髓损伤后大鼠运动功能丧失,脊髓神经元细胞大量凋亡,脊髓组织受损严重,mir-124a mRNA水平短暂升高后持续降低,Bax mRNA与蛋白表达水平增高,Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平下降,Caspase 3蛋白表达升高;过表达mir-124a后逆转上述mRNA及蛋白的表达水平,脊髓神经元细胞凋亡减少,脊髓组织形态有所好转,大鼠运动功能逐渐恢复。***诱导后细胞形态差,大部分细胞死亡;mir-124a mRNA水平、Bcl-2mRNA表达水平、Bcl-2蛋白表达较Control组显著下降,Caspase 3蛋白表达升高显著;mir-124a mimics预处理后细胞生长状态较好,介于对照组和HO诱导组之间,死亡细胞较HO诱导组少。mir-124a mimics预处理后Bcl-2 mRNA水平显著升高,蛋白表达增高;Caspase 3蛋白表达下降。结论大鼠脊髓损伤后神经元细胞凋亡显著,后肢运动功能丧失。过表达mir-124a可抑制神经元细胞凋亡,从而改善大鼠运动功能,促进脊髓损伤的修复。

关键词：脊髓损伤 mir-124a 细胞凋亡

mir-124a通过抑制iASPP基因表达促进神经突起生长

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南方医科大学学报 2014年第1期34卷 31-35页

作者：林利芳谷溪刘书虎王雪敏南方医科大学基础医学院神经生物学教研室广东广州510515

目的探索mir-124a的靶基因iASPP对神经发育的影响。方法利用在线预测软件TargetScan对mir-124a的靶基因进行预测,结合文献资料提到的与神经早期发育有关的基因进行筛选,我们选择iASPP作为mir-124a的候选靶基因。通过荧光素酶报告基因实... 详细信息

目的探索mir-124a的靶基因iASPP对神经发育的影响。方法利用在线预测软件TargetScan对mir-124a的靶基因进行预测,结合文献资料提到的与神经早期发育有关的基因进行筛选,我们选择iASPP作为mir-124a的候选靶基因。通过荧光素酶报告基因实验对其进行验证,然后在M17细胞中转染mir-124a过表达质粒,用Western blotting实验检测iASPP蛋白表达水平的变化。利用视黄酸诱导M17细胞作为神经元分化模型,通过过表达或者基因干扰的方法,初步探讨iASPP基因对神经发育的影响。结果 mir-124a促进神经突起发育,并且能够与iASPP基因的3'非翻译区(3'UTR)相互作用来抑制其蛋白质的表达;iASPP基因的过表达抑制神经突起的发育并且抑制mir-124a促进神经突起生长的作用。结论 mir-124a能够通过抑制iASPP基因的表达来促进神经突起生长。

关键词： mir-124a iASPP 神经发育突起生长

mir-124a通过抑制TGF-β通路促进人胎盘间充质干细胞向胰腺祖细胞分化

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基础医学与临床 2014年第10期34卷 1309-1314页

作者：陈冬梅马海滨刘淑丹王立斌李玉奎魏军宁夏医科大学总医院干细胞研究所生育力保持教育部重点实验室宁夏银川750004

目的研究mir-124a参与抑制TGFBR1和BMPR1B的转录后调控,及其对人胎盘间充质干细胞(PMSCs)向胰腺祖细胞分化的影响。方法用慢病毒过表达mir-124a前体,建立PMSCs中过表达mir-124a细胞模型;转染mir-124a反义寡核苷酸,抑制mir-124a表达;real... 详细信息

目的研究mir-124a参与抑制TGFBR1和BMPR1B的转录后调控,及其对人胎盘间充质干细胞(PMSCs)向胰腺祖细胞分化的影响。方法用慢病毒过表达mir-124a前体,建立PMSCs中过表达mir-124a细胞模型;转染mir-124a反义寡核苷酸,抑制mir-124a表达;real-time PCR分析mir-124a与其调控的靶基因TGFBR1和BMPR1B的表达调控关系;real-time PCR、Western blot和免疫荧光化学染色检测mir-124a过表达后,胰腺祖细胞特征基因和蛋白表达变化。结果 PMSCs中过表达和抑制表达mir-124a,能反向调控其靶基因TGFBR1和BMPR1B的表达;mir-124a过表达后,胰腺祖细胞特异性基因PDX-1、Nkx6.1、NGN3和β细胞特征基因Insulin的表达量显著上升(Pmir-124a可能通过抑制TGFBR1的表达,阻断TGF-β/TGF-βR信号,使细胞发生间质上皮转化,并可能通过抑制BMPR1B的表达阻碍细胞向成骨方向分化,从而指导胎盘间充质干细胞向胰腺祖细胞分化。

关键词： mir-124a 转化生长因子βⅠ型受体胰腺祖细胞胎盘间充质干细胞分化

幽门螺杆菌相关性胃疾病中mir-551b和mir-124a的表达及意义

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中国微生态学杂志 2022年第2期34卷 201-205页

作者：董守森尚延生山东第一医科大学附属莱钢医院消化内科山东济南271126 济南市人民医院消化内科山东济南271100

目的检测mir-551b、mir-124a在慢性浅表性胃炎(CSG)、慢性萎缩性胃炎(CAG)及胃癌(GC)患者胃黏膜组织中表达水平,探讨mir-551b、mir-124a与幽门螺杆菌(***)感染的关系及在胃癌发生、发展中的作用。方法选择2018年7月-2019年8月在本院... 详细信息

目的检测mir-551b、mir-124a在慢性浅表性胃炎(CSG)、慢性萎缩性胃炎(CAG)及胃癌(GC)患者胃黏膜组织中表达水平,探讨mir-551b、mir-124a与幽门螺杆菌(***)感染的关系及在胃癌发生、发展中的作用。方法选择2018年7月-2019年8月在本院肿瘤科与消化科住院的患者120例,其中CSG患者40例,CAG患者40例,GC患者40例。采用qRT-PCR法检测各研究对象胃黏膜组织中mir-551b、mir-124a表达水平,分析mir-551b、mir-124a水平与***感染及GC患者临床病理特征的关系。结果 GC组患者胃黏膜组织中mir-551b、mir-124a表达水平低于CSG组、CAG组(P0.05);***阳性感染GC患者胃黏膜组织中mir-551b、mir-124a表达水平低于***阴性感染患者,差异有统计学意义(Pmir-551b、mir-124a表达量低于高分化、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ、浸润深度为T1-T2、无淋巴结转移的GC患者(Pmir-551b、mir-124a表达与性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)。结论 mir-551b、mir-124a在GC患者胃黏膜组织中低表达,且在***阳性感染患者中低表达,检测mir-551b、mir-124a表达水平可能在***感染所致胃黏膜组织癌变过程中具有一定预测作用。

关键词： mir-551b mir-124a 胃黏膜幽门螺杆菌胃癌

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mir-124a在胰腺发育及疾病中的作用

生理科学进展 2019年第3期50卷 195-199页

作者：杨晨朱源森周洁滕春波东北林业大学生命科学学院

microRNA(mirNA)是一类长度为18~25个核苷酸非编码小分子RNA,广泛存在于真核生物中并高度保守,主要参与基因转录后调控。mir-124a在中枢神经系统和胰腺中含量最为丰富,在其他器官中的表达量约低100倍。近年研究显示,mir-124a参与胰腺发... 详细信息

microRNA(mirNA)是一类长度为18~25个核苷酸非编码小分子RNA,广泛存在于真核生物中并高度保守,主要参与基因转录后调控。mir-124a在中枢神经系统和胰腺中含量最为丰富,在其他器官中的表达量约低100倍。近年研究显示,mir-124a参与胰腺发育、生理及病理多种过程的调节,包括:(1)通过阻断TGFβ途径诱导人胎盘间充质干细胞向胰腺祖细胞方向分化(2)靶向调控Foxa2、iGluR等与胰岛激素分泌相关的重要转录因子,介导胰岛激素的释放(3)通过与下游靶基因Rac1的相互作用在胰腺癌细胞生长,侵袭和转移中起关键作用(4)通过调控CHSY1及其下游靶点CASP1的表达水平参与慢性胰腺炎CP的发生等。研究mir-124a对于深入了解胰腺发生及疾病机理及其治疗具有重要意义。

关键词： mir-124a 胰腺发育胰腺癌慢性胰腺炎

过表达mir-124a对J774.1细胞中TNF-α和IL-6表达水平及细胞周期的影响

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吉林大学学报（医学版） 2018年第5期44卷 983-987页

作者：尹芳蕊庞春艳耿立霞王永福包头医学院第一附属医院风湿免疫科包头医学院风湿免疫研究所内蒙古自治区自体免疫学重点实验室内蒙古包头014010

目的:探讨mir-124a对类风湿关节炎(RA)细胞模型小鼠巨噬细胞J774.1细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)表达水平及细胞周期的影响,阐明mir-124a在RA中的作用机制。方法:取对数生长期J774.1细胞,以1×106 mL^(-1)均匀接种... 详细信息

目的:探讨mir-124a对类风湿关节炎(RA)细胞模型小鼠巨噬细胞J774.1细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)表达水平及细胞周期的影响,阐明mir-124a在RA中的作用机制。方法:取对数生长期J774.1细胞,以1×106 mL^(-1)均匀接种于培养皿,每组设3个复孔,当细胞融合度达到60%时进行感染,实验分为mir-124a过表达组(感染mir-124a腺病毒载体)、空载腺病毒组(感染阴性病毒液)和空白对照组(不做任何处理)。ELISA法检测感染48h后3组细胞上清液中TNF-α和IL-6的表达水平,RT-PCR法检测感染48h后J774.1细胞中TNF-α和IL-6mRNA相对表达水平,流式细胞术检测感染48h后3组细胞细胞周期变化。结果:感染48h后,与空白对照组和空载腺病毒组比较,mir-124a过表达组细胞上清中TNF-α和IL-6表达水平明显降低(P=0.038,P=0.042;P=0.043,P=0.044),mir-124a过表达组细胞中TNF-α和IL-6mRNA表达水平明显降低(P=0.001,P=0.002;P=0.001,P=0.003),G1期细胞百分率明显升高(P=0.01),S期和G2期细胞百分率明显降低(Pmir-124a感染小鼠巨噬细胞J774.1后可使细胞的炎性因子表达水平下降,抑制细胞增殖,mir-124a有望成为RA治疗的新靶点。

关键词： mir-124a 类风湿性关节炎腺病毒载体 J774.1细胞

奶牛mir-124a靶基因预测及生物信息学分析

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中国生物制品学杂志 2018年第10期31卷 1084-1089,1094页

作者：杨卓妮娜王秀伟郭丽张伟红杨焕民沈冰蕾刘胜军黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 黑龙江尚志市中现育龙牛业黑龙江尚志150600

目的预测奶牛mir-124a(bta-mir-124a)的靶基因,并对其生物学功能、调控机制以及参与的信号转导通路进行富集分析,为bta-mir-124a调控乳品质代谢的功能验证研究提供理论依据。方法利用mirBase、mirWalk和Targetscan等在线数据分析系统,获... 详细信息

目的预测奶牛mir-124a(bta-mir-124a)的靶基因,并对其生物学功能、调控机制以及参与的信号转导通路进行富集分析,为bta-mir-124a调控乳品质代谢的功能验证研究提供理论依据。方法利用mirBase、mirWalk和Targetscan等在线数据分析系统,获得bta-mir-124a的前体及成熟区序列,同时预测其候选靶基因并取交集,进而对筛选获得的候选靶基因进行GO功能注释及信号通路富集分析。结果 bta-mir-124a序列在各物种间高度保守,其候选靶基因主要富集在生物调控、细胞生长、代谢等生物学过程中。KEGG信号通路显示,在癌症、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein,AMPK)、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)信号转导、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成等信号通路中,候选靶基因均被富集。结论 bta-mir-124a的候选靶基因在癌症发生、AMPK信号转导、脂肪酸代谢中发挥重要作用。其中,脂肪酸代谢是bta-mir-124a可能参与的主要代谢调控通路。为后期bta-mir-124a在奶牛乳腺组织中调控乳脂代谢的功能机制的研究提供参考。

关键词： mir-124a 靶基因预测生物信息学分析乳脂代谢奶牛

mir-124a在结直肠癌转移中的作用及机制

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miR-124a在结直肠癌转移中的作用及机制

作者：梁胜男华中农业大学

学位级别：硕士

结直肠癌是一种受遗传因素和环境因素双重影响产生的恶性肿瘤。早期的结直肠癌患者治疗效果良好,但是晚期易复发且易转移的特点导致结直肠癌的死亡率一直高居不下。因此,明确结直肠癌转移的机制是提高其疗效和预后的关键。近年来,许多... 详细信息

结直肠癌是一种受遗传因素和环境因素双重影响产生的恶性肿瘤。早期的结直肠癌患者治疗效果良好,但是晚期易复发且易转移的特点导致结直肠癌的死亡率一直高居不下。因此,明确结直肠癌转移的机制是提高其疗效和预后的关键。近年来,许多研究报道显示mirNA在多种肿瘤的发生发展及转移中都起重要调控作用。mir-124a在多种恶性肿瘤中表达量变低从而导致预后变差,其在神经管母细胞瘤和肝癌中的作用机制都已阐明,但是在结直肠癌中的作用机制尚不清楚。本研究从临床数据出发,应用分子及细胞水平上的多种生物学实验方法以及生物信息学分析对mir-124a在结直肠癌中的作用进行了系统研究。我们首先采用qRTPCR方法对20例患者的冷冻结直肠癌与癌旁组织样本进行了mir-124a的含量检测,研究了结直肠癌患者的癌与癌旁组织中mir-124a表达量的差异。为了进一步明确mir-124a表达水平与患者的哪些临床表现有关,我们还收集了42例具有完整临床及预后资料的病例进行mir-124a的表达量检测,并对mir-124a表达量与结直肠癌的各个临床病理因素的相关性进行了统计学分析。此外,我们检测了上调mir-124a对结直肠癌细胞行为的影响。为了研究mir-124a的作用机制,我们采用RNA-seq测序及生信分析,检测了过表达mir-124a后显著性差异表达的基因。最后,我们通过mirNA靶基因预测网站选取了mir-124a的候选靶基因,并挑选与转移相关的候选靶基因。我们的主要研究结果总结如下:1.通过qRT-PCR的方法对20例患者成对的冷冻样本检测,结果显示:4例患者的成对组织中mir-124a表达量未发现有显著差异;剩余16例结直肠癌组织中mir-124a的表达量均低于癌旁组织（p＜0.05）。2.检测42例预后资料完整的结直肠癌患者的mir-124a含量并进行分组分析。结直肠癌患者mir-124a表达量与临床病理因素的相关性检测,发现mir-124a在Dukes分期为B期和C期的两个不同阶段的结直肠癌患者中的表达水平有明显的区别（p＜0.05）。***-8实验结果表明,与对照组相比,mir-124a mimics组细胞的增殖能力降低,在48h有显著差异（p＜0.05）。Transwell实验结果表明,与对照组相比,mir-124a mimics组的细胞迁移能力显著降低（p＜0.05）。因此,mir-124a对结直肠癌细胞的增殖和迁移起抑制作用。4.转录组水平研究mir-124a的作用机制:将转染mir-124a mimics组与转染Negative Control组进行RNA-seq测序分析得到差异基因,通路富集分析发现mir-124a可能通过调控PI3K通路抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移能力。5.生物信息学挑选靶基因:应用三个mirNA靶基因预测网站,将结果取交集得到78个候选基因。通过文献查阅,挑选出与mir-124a调控结直肠癌转移功能相关性最高的三个基因:ANTXR2,COL12A1,C1GALT1。

关键词： mir-124a 结直肠癌肿瘤转移预后 RNA-seq

mir-124a通过抑制OSBP基因表达促进神经突起生长

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miR-124a通过抑制OSBP基因表达促进神经突起生长

作者：林利芳南方医科大学

学位级别：硕士

MicroRNAs（mirNAs）是由长度约21～25个核苷酸序列的RNA分子组成的,是哺乳动物和植物中基因转录后调控的关键因子,并且彻底改变了我们对基因转录后调控的理解。目前研究发现大部分动物中的mirNA能够通过种子序列与靶基因mRNA的3’端非... 详细信息

MicroRNAs（mirNAs）是由长度约21～25个核苷酸序列的RNA分子组成的,是哺乳动物和植物中基因转录后调控的关键因子,并且彻底改变了我们对基因转录后调控的理解。目前研究发现大部分动物中的mirNA能够通过种子序列与靶基因mRNA的3’端非翻译区（3’UTR）序列以不完全配对的方式结合,通过抑制翻译或者促进mRNA脱腺苷化和降解从而抑制蛋白质的合成。在哺乳动物中,预测有50%左右的蛋白编码基因的活性是受mirNA控制的。口前的功能研究显示mirNA几乎参与每个细胞的调控过程,并且mirNA表达的改变可能参与很多人类的疾病过程。有研究表明,mirNA在生物体内是呈组织特异性分布的,而神经系统与其他的组织一样也表达mirNA,并且有些mirNA是仅表达于神经组织或神经细胞的,比如mir-9,mir-124a,mir-125,mir-128以及mir-129。mir-124a在分化中和成熟的神经元中均表达,是脑组织中含量最高的mirNA,大约占大脑mirNA总量的25～48%,并且其核苷酸序列在物种间高度保守。以往对于mir-124a的研究大多是探索其在神经发生方面的作用,但是作为神经系统中表达最丰富的mirNA,其在神经发育方面的作用还鲜为人知。最近的研究发现,mir-124a可能通过调节细胞骨架的活动从而影响神经突起的形成,但是mir-124a对于神经突起生长调节作用的直接靶基因目前仍然未知。氧化固醇结合蛋白（oxysterol-binding protein,OSBP）和OSBP相关蛋白（ORPs）在真核生物中构成一个保守的固醇和磷脂酰肌醇结合蛋白家族,ORPs蛋白家族的作用机制到目前为止还不完全清楚。然而,一些ORPs蛋白存在于膜接触位点并且控制与信号转导、囊泡转运和脂质代谢相关的酶效应器或者蛋白复合物的活性。哺乳动物中的ORPs蛋白功能包括协调固醇和鞘磷脂代谢以及促有丝分裂信号（OSBP）,控制内质网-晚期核内体（LE）接触和LE的能动性（ORP1L）,中性脂质代谢（ORP2）,细胞粘附（ORP3）,巨噬细胞脂质平衡、迁移和高密度脂蛋白代谢（ORP8）,载脂蛋白B-100分泌（ORP10）和脂肪细胞分化（ORP11）等。但是越来越多的ORPs相互作用蛋白已经被确定,这提示它们可能涉及细胞调节的多个方面,与ORPs相互作用的蛋白质,功能包括细胞信号传导、囊泡运输、脂代谢、糖代谢、细胞骨架调节蛋白、离子转运等。因此,ORPs可以通过与不同的配体结合,在有机体内发挥相应的功能。ORPs蛋白家族的不同成员的表达量是具有组织特异性的,ORP1在人的大脑皮层有着较高的转录水平,并且在培养的人成神经细胞瘤细胞系中显示出固醇调节的表达。因此,包括OSBP在内的ORPs家族蛋白可能对中枢神经系统细胞的固醇平衡起着重要作用。人的OSBP蛋白能够作为胆固醇结合支架蛋白从而协调两种磷酸酶[丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（serine/threonine phosphatase,PP2A）,酪氨酸磷酸酶（tyrosine phosphatas,HePTP）]的活性来控制细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）信号通路,另外,研究发现ERK的磷酸化能够促进神经突起的生长,但是OSBP对神经突起生长的作用仍然未知。基于目前的研究现状,我们一方面致力于探索mir-124a促进神经突起生长的靶基因,另一方面试图寻找其中的作用机制。为了找到mir-124a可能的靶基因,我们首先利用在线生物信息学软件（TargetScan）对mir-124a的靶基因进行预测,然后结合相关的文献资料对预测出的候选基因进行筛选。结果我们发现OSBP基因的3’UTR有3个保守的mir-124a作用位点并且将其作为候选基因进行研究。接下来为了验证mir-124a是通过种子序列与候选基因OSBP 3’UTR相互作用的,我们先从Genbank网站上获取OSBP的3’UTR（小鼠来源）全长序列,然后通过软件Primer Premier 6.0设计出PCR引物序列,以N2a细胞基因组DNA为 PCR 模板,构建 mir-124a 表达质粒 hU6-mir-124a-CMV-EGFP（简称 U6-124）,以U6-124质粒为模板构建mir-124a突变质粒hU6-mir-124amut-CMV-EGFP（简称U6-124mut）,将AAGG突变成TTCC。利用包含mir-124a所有作用位点的OSBP3’UTR构建荧光素酶报告基因质粒（OSBP3’UTR）,以OSBP3’UTR质粒为模板构建OSBP 3’UTR突变质粒（OSBP 3’UTRmut）,将GCCT突变成CGGA。接着我们用脂质体转染试剂LipofectamineTM

关键词： mir-124a OSBP 突起生长