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瘤内注射OVA mrna治疗小鼠结肠癌的研究

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免疫学杂志 2021年第12期37卷 1065-1070页

作者：谢颖张瑾宬刘雨周雪杨君仪刘鲜梅刘丽娜贵州医科大学生物与工程学院生物与医学工程重点实验室/贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心/医药生物技术工程研究中心贵阳550025 贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室

目的研究瘤内注射OVA mrna对小鼠CT26结肠癌的治疗效果,为以OVA为基础的肿瘤治疗提供新的思路。方法建立小鼠CT26结肠癌皮下肿瘤模型,将OVA mrna直接注射至结肠癌荷瘤小鼠皮下肿瘤内,观察肿瘤生长和小鼠存活情况;实时荧光定量PCR检测小... 详细信息

目的研究瘤内注射OVA mrna对小鼠CT26结肠癌的治疗效果,为以OVA为基础的肿瘤治疗提供新的思路。方法建立小鼠CT26结肠癌皮下肿瘤模型,将OVA mrna直接注射至结肠癌荷瘤小鼠皮下肿瘤内,观察肿瘤生长和小鼠存活情况;实时荧光定量PCR检测小鼠肿瘤组织中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-6、TGF-β的表达;免疫荧光染色检测肿瘤组织中CD8^(+)T细胞的浸润情况;TUNEL试剂盒检测肿瘤组织的细胞凋亡。结果每只小鼠皮下接种5×10^(5)个CT26细胞成功建立了小鼠结肠癌皮下肿瘤模型。荷瘤小鼠瘤内注射OVA mrna能显著抑制结肠癌皮下肿瘤生长和延长小鼠的存活时间,并且上调肿瘤组织内细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-12的表达以及增加肿瘤浸润CD8+T细胞的数量和促进肿瘤组织的细胞凋亡。结论瘤内注射OVA mrna通过促进肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤免疫应答,以治疗小鼠CT26结肠癌。

关键词：结肠癌瘤内免疫治疗卵清蛋白 mrna治疗

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组织特异性mrna-LNP递送技术的研发策略

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科学通报 2023年

作者：宗岩魏妥程强中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室北京干细胞与再生医学研究院北京大学未来技术学院生物医学工程系

新型冠状病毒疫苗的成功研发将信使RNA(messenger RNA, mrna)技术在全球范围推到了全新高度,更是直接推动了我国mrna医药产业的快速崛起和发展. mrna技术成功的背后离不开安全、高效的递送载体,尤其是脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, ... 详细信息

新型冠状病毒疫苗的成功研发将信使RNA(messenger RNA, mrna)技术在全球范围推到了全新高度,更是直接推动了我国mrna医药产业的快速崛起和发展. mrna技术成功的背后离不开安全、高效的递送载体,尤其是脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, LNP),已获批(包括正式获批和紧急使用授权)的mrna新冠疫苗大多受益于此递送体系,临床在研的mrna药物项目超90%也同样依赖于LNP.作为mrna递送领域炙手可热的明星载体, LNP自身的研发因此备受关注.当前m RNA-LNP技术在肝脏递送、肌肉注射的相关生物医学应用中较为成熟,但针对肝外组织的靶向递送相对处在研究早期.为了最大化扩宽mrna药物的应用场景,研究者已经采取多种技术手段研发LNP靶向递送技术.基于此,本文重点讨论了当前组织靶向m RNA-LNP技术的研究策略,包括LNP处方优化、筛选新型脂质分子、靶向抗体修饰、给药方式优化等,并简要展望本领域未来的可能发展方向.

关键词：脂质纳米颗粒 mrna治疗组织靶向递送纳米医学

体外合成的ABC转运蛋白2 mrna在小鼠体内表达促进尿酸排泄

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中国生物化学与分子生物学报 2021年第8期37卷 1100-1109页

作者：孙忠兴葛科立张志霞贾少平张金玉葛银林青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学系山东青岛266071 青岛大学基础医学院中西医结合中心山东青岛266011 枣庄职业学院医学院基础医学教研室山东枣庄277000

高尿酸血症是指嘌呤代谢紊乱尿酸在体内堆积所导致的慢性代谢疾病,近年来其发病率增高且发病年龄呈现年轻化趋势,寻找有效的治疗靶点以及治疗方法是当前研究的热点。尿酸盐转运蛋白ABC转运蛋白2(ATP-binding cassette subfamily G membe... 详细信息

高尿酸血症是指嘌呤代谢紊乱尿酸在体内堆积所导致的慢性代谢疾病,近年来其发病率增高且发病年龄呈现年轻化趋势,寻找有效的治疗靶点以及治疗方法是当前研究的热点。尿酸盐转运蛋白ABC转运蛋白2(ATP-binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)主要表达于肾,促进尿酸排泄。本研究通过体外合成ABCG2 mrna,将其转染至高尿酸血症模型小鼠体内,观察对小鼠尿酸的影响及其相关作用。化学合成ABCG2 mrna的DNA模板,体外转录mrna修饰后转染到小鼠肾小管上皮细胞TCMK-1,Western印迹检测细胞中的蛋白质表达。结果显示,TCMK-1细胞中的蛋白质表达量与mrna转染量呈正相关(P治疗组[20 mg/(kg·d)]和mrna治疗组[2 mg/(kg·3d)],共4组(n=6)。边造模边治疗持续28 d,治疗结束后检测其血尿酸、尿液中尿酸、血肌酐、血尿素氮和肝中黄嘌呤氧化酶指标。结果显示,与模型组小鼠相比,mrna治疗能显著降低小鼠血尿酸(100.38±10.94)及血尿素氮(6.30±1.10)、肌酐(30.86±5.78)水平(Pmrna治疗组小鼠肾内肾小管细胞水肿、炎细胞浸润等病理损伤得到明显改善。qRT-PCR检测小鼠肾组织mrna相对表达量,免疫组化、Western印迹检测小鼠肾ABCG2蛋白质表达水平。结果显示,mrna组小鼠肾组织中ABCG2 mrna及其蛋白质相对表达量明显上调(Pmrna可以在高尿酸小鼠模型体内成功表达,并促进尿酸及其它有机离子排泄,同时改善小鼠肾损伤。该结果为临床利用ABCG2基因作为治疗高尿酸血症相关疾病的靶点提供了实验依据。

关键词：高尿酸血症 ABC转运蛋白2 mrna治疗肾功能

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体外合成的ABC转运蛋白2 mrna在小鼠体内表达促进尿酸排泄

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体外合成的ABC转运蛋白2 mRNA在小鼠体内表达促进尿酸排泄

作者：孙忠兴青岛大学

学位级别：硕士

研究目的:高尿酸血症（Hyperuricemia）是指嘌呤代谢紊乱,尿酸在体内堆积所导致的慢性代谢疾病,寻找有效的治疗靶点以及治疗方法是当前研究的热点。尿酸盐转运蛋白ABC转运蛋白2（ATP-binding cassette subfamily G member 2,ABCG2）主... 详细信息

研究目的:高尿酸血症（Hyperuricemia）是指嘌呤代谢紊乱,尿酸在体内堆积所导致的慢性代谢疾病,寻找有效的治疗靶点以及治疗方法是当前研究的热点。尿酸盐转运蛋白ABC转运蛋白2（ATP-binding cassette subfamily G member 2,ABCG2）主要表达于肾脏,促进尿酸排泄。本研究通过体外合成ABCG2 mrna,将其转染至高尿酸血症模型小鼠体内,观察对小鼠尿酸的影响及其相关作用。研究方法:1.从NCBI中查得小鼠ABCG2基因序列,设计添加5’和3’端非翻译区（untranslated regions,UTR）。化学合成ABCG2 mrna的DNA序列,将其插入到质粒p ET-28a（+）中,对重组质粒p ET-28a（+）-ABCG2进行Bam H I/Sal I双酶切琼脂糖凝胶电泳,检测DNA模板长度是否符合预期。再以重组质粒为模板,PCR仪扩增出3’UTR端添加120个碱基poly（T）尾的DNA序列,与未加尾序列通过琼脂糖凝胶电泳比较分子量大小,检测DNA模板加尾后长度是否符合预期,并且进行测序验证。2.六孔板中培养小鼠肾小管上皮细胞TCMK-1,DNA序列加尾后,将其作为模板,通过体外转录合成mrna,纯化后转染不同剂量至TCMK-1细胞中,Western blot检测细胞中的蛋白质表达。3.动物实验,24只SPF级KM小鼠,随机分为正常组、模型组、苯溴马隆治疗组[20mg/（kg·d）]和mrna治疗组[2 mg/（kg·3d）],每组6只。除正常组外其它各组利用氧嗪酸钾[200 mg/（kg·d）]灌胃,并辅以高嘌呤饮食构建高尿酸血症小鼠模型,苯溴马隆组灌胃给药,mrna被脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles,LNPs）包裹后以尾静脉注射方式给药,边造模边治疗持续28天。4.观察记录小鼠体重及其生长状态,28天后检测各组小鼠血尿酸、尿尿酸、血肌酐、血尿素氮和肝脏中黄嘌呤氧化酶活性。5.剪取各组小鼠肾脏组织,苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察小鼠肾脏病理结构改变。6.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）检测各组小鼠肾脏组织中ABCG2 mrna的相对表达量。Western blot、免疫组化法（Immunohistochemistry,IHC）检测各组小鼠肾脏中ABCG2蛋白表达水平。研究结果:1.琼脂糖凝胶电泳结果显示DNA分子量大小与预期一致,ABCG2基因成功插入到p ET-28a（+）质粒当中,添加poly（T）尾后的DNA序列,长度明显大于未加尾序列,其测序结果与预期一致。2.Western blot结果显示TCMK-1细胞中的ABCG2蛋白质表达量,随着mrna转染剂量增多而升高（P＜0.01）,表明转染的mrna可以在细胞中翻译。3.动物实验结果显示,模型组小鼠的血尿酸水平和尿尿酸水平明显高于正常组（P＜0.01）,表明模型组小鼠体内尿酸堆积,高尿酸血症小鼠模型成功建立。4.与模型组小鼠相比,mrna治疗能够降低小鼠血尿酸及血尿素氮、肌酐水平（P＜0.05或P＜0.01）,同时升高尿尿酸水平（P＜0.05）。对小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶活性没有明显影响。5.与模型组小鼠肾脏组织病理损伤相比,mrna治疗组小鼠肾脏肾小管细胞水肿、炎细胞浸润等得到改善。mrna治疗组小鼠的生长状态明显优于苯溴马隆治疗组,未发现明显毒副作用。6.q RT-PCR结果显示,mrna组小鼠肾脏组织中ABCG2 mrna相对表达量远高于其它各组（P＜0.01）,表明脂质纳米颗粒所包裹的ABCG2 mrna经尾静脉注射后成功到达小鼠肾脏组织。7.与模型组相比,免疫组化和Western blot结果显示mrna治疗组小鼠肾脏组织中ABCG2蛋白质表达水平明显升高（P＜0.01）,表明体外修饰合成的mrna在小鼠肾脏组织中成功翻译出蛋白质。结论:体外修饰合成的ABCG2 mrna经过脂质纳米颗粒包裹后,通过尾静脉注射后可以在高尿酸血症模型小鼠体内成功翻译出蛋白质,进而促进尿酸和相关的其它有机离子排泄,小鼠肾脏组织的病理损伤也得到了明显改善。研究结果为临床利用ABCG2基因作为治疗高尿酸血症及其相关疾病的靶点提供实验依据。

关键词：高尿酸血症 ABC转运蛋白2 mrna治疗肾功能