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m6A结合蛋白IGF2BP3在胃癌和GES-1细胞mNNG恶性转化模型中的表达和机制研究

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m6A结合蛋白IGF2BP3在胃癌和GES-1细胞MNNG恶性转化模型中的表达...

作者：杜丹丹东南大学

学位级别：硕士

胃癌（Gastric cancer,GC）是最具侵袭性的恶性肿瘤之一,其进展迅速且具有高度转移性。根据2020年全球癌症统计报告显示,全球胃癌新发病例在肿瘤中排名第五,死亡病例排名第四。胃癌严重威胁着人类健康,而胃癌的发病和进展涉及环境和遗... 详细信息

胃癌（Gastric cancer,GC）是最具侵袭性的恶性肿瘤之一,其进展迅速且具有高度转移性。根据2020年全球癌症统计报告显示,全球胃癌新发病例在肿瘤中排名第五,死亡病例排名第四。胃癌严重威胁着人类健康,而胃癌的发病和进展涉及环境和遗传的共同作用。大量研究已证实N-亚硝基类化合物（N-Nitroso-compound,NOCs）与胃癌的因果关系,但NOCs所致胃癌的分子机制有待进一步研究。m6A结合蛋白是N6腺苷甲基化（N6-methyladenosine,m6a）中的重要酶类之一,与癌症的发生发展密切相关,在环境化学致癌中可能发挥重要作用,其参与细胞恶性转化的机制研究仍需补充。上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EmT）是细胞恶性转化的关键分子步骤之一,因此EmT又被认为是化学致癌作用与肿瘤之间的桥梁。m6A结合蛋白在化学致癌及EmT过程中如何发挥作用尚待阐明。因此本研究首先基于公共数据库和胃癌人群样本,绘制胃癌相关m6A结合蛋白基因表达谱,寻找差异基因,筛选出与胃癌生存预后显著相关的关键m6A结合蛋白IGF2BP3。其次在胃癌细胞中对筛选出的关键m6A结合蛋白IGF2BP3的生物学功能进行研究,并探讨其通过影响下游靶基因mYC致EmT过程的机制。最后,基于已构建的mNNG诱导GES-1细胞恶性转化模型,探索IGF2BP3在恶转细胞中的功能及揭示mNNG致细胞恶性转化的分子调控机制。本研究为进一步探究化学致癌的分子机制和寻找胃癌的生物学标志提供依据。方法一、m6A结合蛋白在胃癌人群中的表达分析及生物标志研究应用TCGA数据库和5个GEO数据集（GSE66229、GSE54129、GSE29998、GSE64951、GSE96668）研究10个m6A结合蛋白在胃癌组织和正常组织中的差异表达。应用Kaplan-meier Plotter网站分析10个m6A结合蛋白表达对患者总生存期的影响。在已收集的40例胃癌患者的癌和癌旁组织中通过qRT-PCR检测6种m6A结合蛋白的m RNA表达水平,并基于TCGA数据库和人群组织样本,绘制m6A结合蛋白的ROC曲线。筛选IGF2BP3作为进一步研究的目标分子,通过m6a2Target数据库进行下游靶基因预测,并基于TCGA和GEO数据库探究IGF2BP3与下游靶标mYC的相关性。应用免疫组化方法检测胃癌组织与癌旁组织中IGF2BP3、mYC及EmT相关蛋白的表达水平。二、IGF2BP3在胃癌细胞中的生物学功能和调控机制研究通过qRT-PCR和Western blot实验检测IGF2BP3在三种胃癌细胞中的表达情况,筛选出HGC-27细胞开展进一步生物学功能研究。通过慢病毒转染构建IGF2BP3敲低的胃癌细胞株,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell实验检测胃癌细胞侵袭迁移能力,Western blot实验检测胃癌细胞EmT关键蛋白的表达水平。应用qRT-PCR和Western blot实验检测IGF2BP3敲低的胃癌细胞中下游基因mYC的表达水平,通过RIP-q PCR验证胃癌细胞中IGF2BP3蛋白与mYC m RNA的结合作用,通过m RNA稳定性实验检测IGF2BP3对mYC m RNA稳定性的影响。进行挽救实验,即在IGF2BP3敲低的胃癌细胞中转染质粒过表达mYC,检测细胞增殖、侵袭迁移能力及EmT过程的恢复情况。三、IGF2BP3在mNNG致GES-1恶性转化细胞中的作用及机制研究以不同剂量（0μm、1μm、5μm、10μm、20μm、40μm）mNNG染毒胃正常粘膜上皮细胞GES-1细胞24h,通过qRT-PCR检测IGF2BP3 m RNA表达水平。以10μm mNNG处理GES-1细胞6h、12h、18h、24h和30h并检测IGF2BP3 m RNA表达水平。基于课题组前期已构建的mNNG致GES-1细胞恶性转化细胞模型,应用qRT-PCR、Western blot检测不同代数（10代、20代、30代、40代）恶转细胞中IGF2BP3 m RNA和蛋白表达水平,并选择30代恶转细胞（mC-30）进行后续实验研究。通过慢病毒转染构建IGF2BP3敲低的恶转细胞株,应用CCK-8、Transwell和Western blot实验分别检测敲低IGF2BP3对恶转细胞增殖、侵袭迁移以及EmT关键蛋白的影响。通过qRT-PCR和Western blot实验检测IGF2BP3敲低的恶转细胞中下游基因mYC的表达水平,通过RIP-q PCR验证恶转细胞中IGF2BP3蛋白与mYC m RNA的结合作用,通过m RNA稳定性实验检测IGF2BP3对mYC m RNA稳定性的影响。进行挽救实验,即在IGF2BP3敲低的恶转细胞中转染质粒过表达mYC,检测细胞增殖、侵袭迁移能力及EmT过程的恢复情况。结果一、m6A结合蛋白在胃

关键词： m6A结合蛋白胃癌 mNNG 细胞恶性转化上皮-间质转化

mA甲基化修饰是神经病理性疼痛的潜在生物靶点

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生理学报 2024年

作者：张玉婷张励才徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6a)是真核生物中最常见的RNA修饰类型，通过甲基转移酶、去甲基化酶和m6A结合蛋白的动态可逆性调控影响细胞内的RNA代谢，控制相关病理生理过程的基因表达。近年来，m6a甲基化修饰参与神经病理性疼... 详细信息

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6a)是真核生物中最常见的RNA修饰类型，通过甲基转移酶、去甲基化酶和m6A结合蛋白的动态可逆性调控影响细胞内的RNA代谢，控制相关病理生理过程的基因表达。近年来，m6a甲基化修饰参与神经病理性疼痛的研究成为热点，一些新的认识不断涌现，m6a甲基化修饰成为治疗神经病理性疼痛的潜在生物靶点。本文就m6a甲基化修饰在神经病理性疼痛中的作用和调控机制进行综述，以期为神经病理性疼痛的药物开发和治疗提供新的启示。

关键词： N6-甲基腺嘌呤甲基转移酶去甲基化酶 m6A结合蛋白神经病理性疼痛

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N6-甲基腺苷在肝细胞癌发生发展中的作用

临床肝胆病杂志 2021年第9期37卷 2210-2214页

作者：马可赵礼金遵义医科大学附属医院肝胆胰外科贵州遵义563000

肝细胞癌是原发性肝癌中最为常见的一种类型,具有较高的发病率和死亡率。N6-甲基腺苷(m6a)的异常修饰将会促进肝细胞癌的发生与发展。叙述了m6a的结构与功能并总结了决定m6a功能的甲基化酶复合物,包括甲基转移酶(编辑器)、去甲基酶(消码... 详细信息

肝细胞癌是原发性肝癌中最为常见的一种类型,具有较高的发病率和死亡率。N6-甲基腺苷(m6a)的异常修饰将会促进肝细胞癌的发生与发展。叙述了m6a的结构与功能并总结了决定m6a功能的甲基化酶复合物,包括甲基转移酶(编辑器)、去甲基酶(消码器)和m6A结合蛋白(读码器)在肝细胞癌中的作用机制。认为需要更深入的研究阐明甲基化酶复合物在肝细胞癌中作用的多样性和特异性,以期使之成为预防和治疗肝细胞癌的新靶点。

关键词：癌,肝细胞 N6-甲基腺苷甲基转移酶类去甲基酶 m6A结合蛋白

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m6a修饰在人类相关致病病毒中的作用与研究进展

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病毒学报 2019年第5期35卷 813-821页

作者：吴芳成文召赵飞媛范大梦刁勇许瑞安唐明青华侨大学医学院泉州362021 分子药物教育部工程研究中心厦门361021 福建省分子医学重点实验室厦门361021

N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine,m6a)修饰是真核生物中最为常见的信使RNA(messenger RNA,mRNA)转录后修饰方式,主要受甲基化转移酶(methyltransferases)、去甲基化转移酶(demethylases)以及特异性结合蛋白(m6a-binding proteins)共同调控。m6a修饰参与RNA生命周期的各个阶段,从RNA加工、出核、翻译到RNA降解。近期有研究显示,m6a修饰的异常发生不仅能够导致肿瘤的发生,也会影响致病病毒的复制及相关重要基因的表达,表明m6a修饰在致病病毒的复制及其致病过程中扮演重要角色。本文主要阐述m6a修饰在人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)、甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)以及猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40,SV40)这八种病毒的复制及感染宿主过程中的作用与分子机制,为病毒性传染病的防治提供新的参考。

关键词： N6-腺苷酸甲基化(m6a) 甲基化转移酶去甲基化转移酶 m6A结合蛋白病毒

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水稻mRNA腺嘌呤甲基化修饰结合蛋白的遗传材料创建与功能分析

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水稻mRNA腺嘌呤甲基化修饰结合蛋白的遗传材料创建与功能分析

作者：胡桐华中农业大学

学位级别：硕士

RNA上存在着多种化学修饰,如m6a（N6-methyladenosine）、m6am（N6,2’-Odimethyladenosine）、m5C（5-methylcytosine）、m1A（N1-methyladenosine）,这些修饰普遍存在于转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）以及信使RNA（mRNA）上。腺嘌呤甲基化修饰（N6-methyladenosine）是真核生物mRNA上最广泛的一种修饰类型。众所周知,mRNA是连接DNA和蛋白质的枢纽,而mRNA上的修饰则会直接影响其功能和稳定性,因此m6a对于基因组遗传信息的传递和基因功能的发挥都起着至关重要的作用。目前对于水稻中m6a修饰的结合蛋白及其功能还不清楚,本研究利用生物信息学、分子生物学和生物化学的研究方法,对水稻中m6a修饰的结合蛋白进行鉴定和初步功能分析。主要研究结果如下:1.哺乳动物和拟南芥中已报道的m6A结合蛋白主要是一类含有YTH保守结构域的蛋白。据此,我们通过BLAST发现水稻基因组中共有12个含有保守YTH结构域的蛋白编码基因,分别命名为OsECT1～OsECT12。利用Pymol软件对水稻YTH家族蛋白结构进行建模分析,测量关键氨基酸与m6a的空间距离,预测结果表明OsECT1、OsECT2、OsECT3、OsECT10、OsECT12具有较高的m6a结合活性。2.通过RiceXPro网站上的数据分析发现YTH家族中OsECT1、OsECT2、OsECT3在水稻不同组织中的表达量均较高。进一步对OsECT1、OsECT2、OsECT3在水稻不同组织中的表达模式分析,结果表明OsECT1在剑叶中表达量最高,在花药表达最低;OsECT2在发芽10 d的根和抽穗期剑叶表达最高,在花药表达最低;OsECT3在10 d的根中表达最高,在花药中表达最低。水稻原生质体亚细胞定位表明OsECT1、OsECT2和OsECT3均定位于细胞质中。3.通过遗传转化方法创建了OsECT1和OsECT2超量表达材料和OsECT1、OsECT2、OsECT3的CRISPR/Cas9敲除突变体材料。通过表型分析发现osect1-crispr敲除突变体没有明显的发育表型;osect2-crispr的敲除突变体相对于野生型株高变矮;osect3-crispr相比于野生型种子萌发率下降、苗期生长迟缓、成熟期植株矮小以及分蘖数减少。对OsECT1和OsECT2的T-DNA插入突变体进行鉴定和表型分析,发现osect2种子粒长增加,粒宽变窄。4.对野生型幼苗分别进行42℃高温、4℃低温、180m m NaCl和20%PEG6000处理,检测OsECT1、OsECT2、OsECT3的表达水平对不同胁迫的响应。结果表明OsECT1和OsECT3在42℃高温、180m m NaCl和20%PEG6000处理下表达量上升,在4℃低温处理下表达受到抑制;OsECT2在180m m NaCl和20%PEG6000处理下表达量上升,4℃低温处理下表达受到抑制。osect3-crispr突变体进行180m m NaCl处理,结果表明其对盐胁迫的敏感性相比野生型明显增加。5.通过酵母双杂交实验分别对OsECT1、OsECT2和OsECT3进行互作蛋白的筛选。结果表明组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27me3）甲基转移酶SDG718和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶OsPP2Ac与OsECT1互作。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD702和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶OsPP2Ac与OsECT2互作。KNOX转录因子结合蛋白KNB36和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶OsPP2Ac与OsECT3互作。

关键词：水稻 RNA腺嘌呤甲基化 YTH蛋白 m6A结合蛋白