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基于生物信息学探索let-7c-5p通过靶向OLFM4参与支气管哮喘疾病进展研究

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现代医药卫生 2024年第11期40卷 1833-1839页

作者：刘锡娇黎友伦重庆医科大学附属璧山医院呼吸与危重症医学科重庆402760 重庆医科大学附属第一医院重庆400016

目的基于生物信息学探索let-7c-5p通过靶向OLFM4参与支气管哮喘疾病进展。方法选取基因表达公共数据库(GEO)中芯片数据集GSE207751和GEO222894,采用R软件的“Limma”和“DESeq2”软件包分析2个数据集中的差异表达基因(DEGs)和差异miRNA... 详细信息

目的基于生物信息学探索let-7c-5p通过靶向OLFM4参与支气管哮喘疾病进展。方法选取基因表达公共数据库(GEO)中芯片数据集GSE207751和GEO222894,采用R软件的“Limma”和“DESeq2”软件包分析2个数据集中的差异表达基因(DEGs)和差异miRNA。利用hclust函数进行WcGNA分析。应用“clusterprofiler”软件包进行基因本体(GO)功能注释富集分析和京都基因与基因组百科全书信号通路富集分析,STRING数据库建立蛋白互作网络(ppI网络),cytoscape筛选严重哮喘患者的核心基因。miRWalk、miRBase和miRTarBase数据库用于靶基因的miRNA预测。结果分析获得80个DEGs,包括上调的OLFM4,进行WcGNA分析后发现和哮喘严重程度相关的Darked模块基因24个,之后进行ppI网格构建和mRNA-miRNA预测筛选出4个核心上调基因(包括OLFM4)和6个miRNA(包括hsa-let-7c-5p)。分析获得98个差异表达miRNA,其中上调5个,下调93个。进行轻度哮喘患者和重度哮喘患者差异miRNA交叉分析发现,let-7c-5p在轻度哮喘患者和重度哮喘患者中表达下调。结论研究多重验证了在哮喘患者中,let-7c-5p通过调控OLFM4影响哮喘的气道炎症和气道重塑,参与哮喘疾病进展,有利于了解哮喘疾病状态进展的潜在分子机制,同时验证了let-7c-5p成为哮喘潜在生物标志物的潜力,为进一步研究哮喘疾病进展提供理论基础。

关键词： let-7c-5p OLFM4 支气管哮喘疾病进展生物标志物

RGS16 regulated by let-7c-5p promotes glioma progression by activating pI3K-AKT pathway

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Frontiers of Medicine 2023年第1期17卷 143-155页

作者： chaochao Wang Hao Xue Rongrong Zhao Zhongzheng Sun Xiao Gao Yanhua Qi Huizhi Wang Jianye Xu Lin Deng Gang Li Department of Neurosurgery Qilu HospitalCheeloo College of Medicine and Institute of Brain and Brain-Inspired ScienceShandong UniversityJinan 250012China Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling Jinan 250012China The Second Hospital Cheeloo College of MedicineShandong UniversityJinan 250033China

Gliomas are the most common central nervous system tumours;they are highly aggressive and have a poor prognosis. RGS16 belongs to the regulator of G-protein signalling (RGS) protein family, which plays an important role in promoting various cancers, such as breast cancer, pancreatic cancer, and colorectal cancer. Moreover, previous studies confirmed that let-7c-5p, a well-known microRNA, can act as a tumour suppressor to regulate the progression of various tumours by inhibiting the expression of its target genes. However, whether RGS16 can promote the progression of glioma and whether it is regulated by miR let-7c-5p are still unknown. Here, we confirmed that RGS16 is upregulated in glioma tissues and that high expression of RGS16 is associated with poor survival. Ectopic deletion of RGS16 significantly suppressed glioma cell proliferation and migration both in vitro and in vivo. Moreover, RGS16 was validated as a direct target gene of miR let-7c-5p. The overexpression of miR let-7c-5p obviously downregulated the expression of RGS16, and knocking down miR let-7c-5p had the opposite effect. Thus, we suggest that the suppression of RGS16 by miR let-7c-5p can promote glioma progression and may serve as a potential prognostic biomarker and therapeutic target in glioma.

关键词： RGS16 let-7c-5p glioma proliferation migration

let-7c-5p靶向调控DUSp7/ERK表达抑制大肠癌细胞HcT8的增殖

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let-7c-5p靶向调控DUSP7/ERK表达抑制大肠癌细胞HCT8的增殖

let-7c-5p靶向调控cTHRc1抑制食管鳞状细胞癌进展的研究

2022ccTB中国肿瘤标志物学术大会暨中国整合肿瘤学...

作者：付娟娟侯志平李思锦周龙妹承德医学院承德医学院附属医院

目的:探讨let-7c-5p靶向DUSp7通过MApK-ERK信号通路调控大肠癌增殖的作用及其潜在机制。方法:TcGA数据库中检测let-7c-5p在大肠癌组织与癌旁组织的表达情况及其与大肠癌患者临床病理分期的关系;RT-q pcR法验证let-7c-5p在大肠癌及癌旁... 详细信息

目的:探讨let-7c-5p靶向DUSp7通过MApK-ERK信号通路调控大肠癌增殖的作用及其潜在机制。方法:TcGA数据库中检测let-7c-5p在大肠癌组织与癌旁组织的表达情况及其与大肠癌患者临床病理分期的关系;RT-q pcR法验证let-7c-5p在大肠癌及癌旁组织样本中的表达情况;利用转染的方法构建let-7c-5p高表达的HcT8细胞系,通过ccK8、EDU、细胞克隆形成实验及流式细胞术观察let-7c-5p对大肠癌增殖和凋亡的影响;通过miRTarBase、TargetScan和GEpIA等数据库预测和分析let-7c-5p的靶基因;通过GO分析筛选信号通路并进行WB实验验证。结果:TcGA数据分析显示let-7c-5p在大肠癌组织的表达明显低于癌旁组织,且与临床分期有关。同时,在临床水平采用RT-qpcR技术验证let-7c-5p在大肠癌组织中的表达明显低于癌旁对照组。ccK-8及EdU实验结果表明let-7c-5p mimics组细胞增殖能力显著低于对照组(p5);let-7c-5p显著抑制集落生成能力(p5);流式结果表明let-7c-5p mimics组细胞凋亡率上升(p5);利用生信软件预测let-7c-5p的靶点为DUSp7且其在大肠癌组织中呈高表达;通过KEGG富集分析锁定MApK信号通路,WB验证显示let-7c-5p mimics组细胞ERK1/2蛋白表达降低,Bax/Bcl-2蛋白表达上升结论:let-7c-5p通过抑制DUSp7调控MApK-ERK信号通路抑制大肠癌的增殖,发挥抗肿瘤作用。

关键词：大肠癌 let-7c-5p DUSp7 MApK-ERK

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Let-7c-5p靶向调控CTHRC1抑制食管鳞状细胞癌进展的研究

let-7c-5p通过下调免疫相关的cDcA8抑制肝细胞癌

2022ccTB中国肿瘤标志物学术大会暨中国整合肿瘤学...

作者：郑雅心张键黄春梅方霖康敏眉山市人民医院(眉山市传染病医院) 宜宾市第二人民医院西南医科大学附属医院

目的:mi RNAs作为潜在的肿瘤生物标记物,具有很好的临床应用前景。let-7c-5p在食管鳞状细胞癌(EScc)中的功能和潜在机制尚不清楚。本研究旨在通过检测let-7c-5p在EScc组织和细胞系中的表达水平,研究let-7c-5p对EScc细胞生物学功能的影响... 详细信息

目的:mi RNAs作为潜在的肿瘤生物标记物,具有很好的临床应用前景。let-7c-5p在食管鳞状细胞癌(EScc)中的功能和潜在机制尚不清楚。本研究旨在通过检测let-7c-5p在EScc组织和细胞系中的表达水平,研究let-7c-5p对EScc细胞生物学功能的影响,进一步探讨let-7c-5p对cTHRc1的靶向调控作用及其对下游AKT/ERK信号传导通路的影响,最终查明let-7c-5p在EScc发生发展过程中的作用和分子调控机制。方法:本研究采用pcR检测let-7c-5p、cTHRc1在食管鳞癌组织中的mRNA表达水平,通过细胞转染试验过表达及抑制let-7c-5p表达后,检测EScc中cTHRc1 mRNA及蛋白的表达情况以及对细胞生物学功能的影响;采用双荧光素酶报告基因试验来验证let-7c-5p和cTHRc1的靶向调控关系。Western Blot检测cTHRc1蛋白表达水平以及下游信号传导通路p-AKT、p-ERK磷酸化水平变化。结果:pcR证实let-7c-5p在EScc组织和细胞系中表达明显下调,而cTHRc1在EScc中明显高表达,且let-7c-5p表达水平与cTHRc1呈负相关。let-7c-5p与晚期TNM分期和淋巴结转移有相关性。双荧光素酶报告基因试验证实了cTHRc1是let-7c-5p的直接靶基因。ccK-8试验证实let-7c-5p过表达能显著抑制食管鳞癌细胞的增殖能力;流式细胞学分析检测细胞凋亡结果显示过表达let-7c-5p可导致早期和晚期凋亡细胞百分比升高;伤口愈合测定试验和Transwell迁移试验结果表明上调let-7c-5p能够明显抑制食管鳞癌细胞的迁移能力。Western Blot结果显示过表达let-7c-5p可明显抑制cTHRc1的蛋白表达水平,进而抑制下游p-AKT和p-ERK磷酸化水平。结论:(1)let-7c-5p在人食管鳞癌组织中低表达,其低表达与晚期TNM分期和淋巴结转移相关;cTHRc1在食管鳞癌组织中高表达,let-7c-5p和cTHRc1表达呈负相关关系。(2)上调let-7c-5p可明显抑制食管鳞癌细胞株TE1、KYSE150的增殖和迁移活性,诱导细胞凋亡。(3)let-7c-5p通过直接靶向调控cTHRc1表达,进而调节下游AKT/ERK信号传导通路,从而影响食管鳞状细胞癌的进展。

关键词：食管鳞状细胞癌 let-7c-5p cTHRc1 p-AKT p-ERK

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Let-7c-5p通过下调免疫相关的CDCA8抑制肝细胞癌

作者：陈万金安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:作为临床上常见的恶性肿瘤,肝细胞癌具有很高的侵袭性和死亡率,且其治疗在全球范围内都是一个巨大的挑战。目前,肝细胞癌的治疗主要包括早期的根治性肝切除术,以及中晚期的经导管动脉化疗栓塞术、放疗、对症治疗等。然而,早期肝切... 详细信息

背景:作为临床上常见的恶性肿瘤,肝细胞癌具有很高的侵袭性和死亡率,且其治疗在全球范围内都是一个巨大的挑战。目前,肝细胞癌的治疗主要包括早期的根治性肝切除术,以及中晚期的经导管动脉化疗栓塞术、放疗、对症治疗等。然而,早期肝切除术的复发率较高,以及中晚期的综合治疗并不能显著延长患者的生存时间,这二者是当前治疗的局限性。近年来,基于pD-1、LAG-3、cTLA-4等免疫靶点新开发的免疫治疗药物被认为是治疗中晚期肝细胞癌最有前景的药物,但这些药物延长肝细胞癌患者的生存时间并未达到预期。因此,为了开发出能够根治肝细胞癌的药物,就必须对得肝细胞癌的发病机制了解透彻。Micro RNA(mi RNA)是一种内源性小分子RNA的总称,其长度约20nt,并且无法编码蛋白质。从临床角度来看,许多研究显示mi RNA可以作为肿瘤标志物来辅助各种肿瘤的早期诊断和评估肿瘤患者预后。从生物学的角度来看,mi RNA通过与下游m RNA的3’UTR区域结合来阻止蛋白质的翻译过程或促进m RNA的降解,从而充当肿瘤抑制因子。作为最早发现的mi RNA之一,let-7c-5p在许多肿瘤中都起着不可或缺的作用,例如肺癌、食管癌等。在肝细胞癌中,早先有研究表明let-7c-5p可以提高5-氟尿嘧啶的抗肿瘤作用。然而,由于mi RNA的调控路径众多,let-7c-5p的作用靶点尚未完全揭示。方法:1.通过生物信息学分析探索let-7c-5p在肝细胞癌中的表达水平,以及与let-7c-5p表达水平相关的生存分析。此外,通过q pcR检测20对临床样本的let-7c-5p的表达水平。2.使用let-7c-5p mimics过表达let-7c-5p后,通过ccK-8实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术来检测肝细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及凋亡。3.通过生物学信息学分析预测let-7c-5p的下游靶基因,并且通过免疫组化、双荧光素酶分析以及Western Blot分析进行验证。4.通过挽救实验来明确let-7c-5p对肝细胞癌细胞的影响是由下游靶基因所介导。5.通过生物信息学分析探索下游靶基因所调控的免疫通路以及免疫功能。结果:1.对公共数据库的数据进行可视化分析,其结果表明,较正常组织而言,let-7c-5p的表达水平在肝细胞癌组织中显著降低,且let-7c-5p的低表达意味着肝细胞癌患者预后不良。此外,q pcR检测结果证实,let-7c-5p在肝细胞癌组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织。2.细胞表型实验结果表明,过表达let-7c-5p可抑制肝细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。此外,流式细胞术实验结果表明,过表达let-7c-5p可促进肝细胞癌细胞的凋亡。3.公共数据库的分析结果显示,在肝细胞癌中,cDcA8的表达水平和let-7c-5p的表达水平呈强负相关,cDcA8在肝细胞癌组织中显著高表达,cDcA8的高表达意味着肝细胞癌患者预后不良,以及cDcA8的3’UTR端有let-7c-5p的潜在结合位点。此外,双荧光素酶分析和Western Blot分析结果表明,cDcA8是let-7c-5p的下游靶基因并且受其负调节。4.挽救实验结果表明,let-7c-5p inhibitor促进了肝细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,且抑制了肝癌细胞的凋亡率,而si-cDcA8逆转了let-7c-5p inhibitor对肝细胞癌细胞的作用。5.公共数据库分析表明,cDcA8与一些免疫细胞、免疫调节剂相关,例如,pDcD-1和cTLA-4。此外,KEGG和GO分析结果表明,cDcA8可能参与了多种免疫通路和免疫功能的调节,如T细胞活化。结论:实验结果表明let-7c-5p可以通过下调免疫相关的cDcA8来抑制肝细胞癌,这有助于了解肝细胞癌的发病机制以及开发新型的治疗药物。

关键词： MicroRNA let-7c-5p cDcA8 肝细胞癌

let-7c-5p调控细胞周期蛋白D1在氟诱导成骨细胞增殖和活化中的作用

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let-7c-5p调控细胞周期蛋白D1在氟诱导成骨细胞增殖和活化中的作用

let-7c-5p通过靶向调节TGF-β1参与慢性肾脏病发病机制的研究

中国毒理学会表观遗传毒理专业委员会第一次学术大会

作者：罗可可欧阳婷廖玉丹潘雪莉贵州医科大学公共卫生学院环境污染与疾病监控教育部重点实验室

目的探讨let-7c-5p转录后调控和通过Wnt/β-catenin通路转录水平调控cyclinDl促进成骨细胞增殖活化。方法依据地方性氟中毒病区划分标准,选择贵州省燃煤污染型氟中毒病区织金县荷花村为调查点,非氟中毒地区安顺市双堡镇张官村作为对照点... 详细信息

目的探讨let-7c-5p转录后调控和通过Wnt/β-catenin通路转录水平调控cyclinDl促进成骨细胞增殖活化。方法依据地方性氟中毒病区划分标准,选择贵州省燃煤污染型氟中毒病区织金县荷花村为调查点,非氟中毒地区安顺市双堡镇张官村作为对照点,知情同意原则下取调查对象血、发、尿样,氟离子选择电极法测定调查人群体内氟负荷,微量酶标法和ELISA检测ALp活力和BGp含量。在课题组前期miRNA-seq分析基础上,使用miRWalk3.0数据库预测靶向cyclinDl的miRNA,筛出与氟暴露相关、靶向调控cyclinD1且表达明显下调的miRNA——let-7c-5p,进一步生物信息学分析显示,let-7c-5p还靶向WNT/β-catenin通路中的Wnt9a。qRT-pcR在248例调查对象中验证let-7c-5p表达、cyclinD1和Wnt9amRNA转录,ELISA检测cyclinD1及Wnt9a蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验分别验证let-7c-5p与cyclinDl和Wnt9a的靶标关系。以0,600,1200μmol/L氟化钠（NaF）处理人成骨细胞72h构建氟中毒细胞模型,及过表达人成骨细胞中let-7c-5p后予0,1200μmol/L氟化钠处理。ccK-8、EdU染色、流式细胞术检测氟对成骨细胞增殖和周期的影响;微量酶标法和ELISA检测ALp活力和BGp含量;qRT-pcR检测let-7c-5p、cyclinD1及Wnt9a表达;Western-blotting检测cyclinD1、Wnt9a及核内外β-catenin蛋白表达;细胞免疫荧光检测β-catenin核转位;染色质免疫共沉淀（chIp）检测β-catenin在cyclinD1转录调控区结合。结果人群和体外实验结果均显示,随着氟暴露剂量增加,ALp活性和BGp含量升高,let-7c-5p表达降低,cyclinD1、Wnt9amRNA转录及蛋白表达增加。共转染let-7c-5p和cyclinD1、Wnt9a3’UTR-WT的质粒荧光强度下降。人成骨细胞中,随染氟剂量增加,人成骨细胞增殖活跃,细胞周期进程加快,β-catenin入核增加,β-catenin在cyclinD1转录调控区结合增加。过表达let-7c-5p后可逆转上述现象。以上结果差异均有统计学意义。结论氟暴露可诱导let-7c-5p低表达,低表达的let-7c-5p直接靶向cyclinD1及通过Wnt/β-catenin信号通路在转录水平调控cyclinD1致其高表达,促进人成骨细胞增殖活化。

关键词：燃煤型氟中毒成骨细胞增殖活化 let-7c-5p Wnt/β-catenin信号通路 cyclinD1

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Let-7c-5p通过靶向调节TGF-β1参与慢性肾脏病发病机制的研究

作者：王振国苏州大学

学位级别：硕士

目的:探讨let-7c-5p和TGF-β信号相关分子在慢性肾脏病中的表达及其与临床特征的关系。方法:选择2018年3月至9月在苏州大学附属第三医院确诊的23例慢性肾脏病（cKD）患者为研究对象,对照组选取行肾癌根治术患者的肾脏标本远瘤组织。用... 详细信息

目的:探讨let-7c-5p和TGF-β信号相关分子在慢性肾脏病中的表达及其与临床特征的关系。方法:选择2018年3月至9月在苏州大学附属第三医院确诊的23例慢性肾脏病（cKD）患者为研究对象,对照组选取行肾癌根治术患者的肾脏标本远瘤组织。用实时定量聚合酶链反应（qpcR）检测两组中let-7c-5p、转化生长因子β（TGF-β）和转化生长因子β受体1（TGF-βR1）的表达水平。通过双荧光素酶报告分析验证TGF-β为let-7c-5p的靶基因。采用Elisa法测定瞬时转染不同浓度let-7c-5p模拟物时TGF-β蛋白的浓度变化。分析cKD患者中let-7c-5p表达水平与疾病严重程度的关系。结果:与对照组相比,cKD患者中let-7c-5p表达显著下降（p＜0.01）,TGF-β的表达水平显著升高（p＜0.001）,而TGF-βR1表达水平无统计学差异（p＞0.05）。cKD患者中TGF-β的表达水平与let-7c-5p表达水平呈负相关。let-7c-5p通过与3’非翻译区中的167-173位点直接结合来调节TGF-β1。let-7c-5p过表达导致TGF-β1蛋白水平呈剂量依赖性降低。cKD患者中let-7c-5p表达水平与病情严重程度相关,与蛋白尿、肌酐水平呈负相关,与估计肾小球滤过率（eGFR）呈正相关,而TGF-β表达水平与肌酐水平呈正相关。结论:let-7c-5p通过靶向调节TGF-β信号系统参与慢性肾脏病的发病机制,可能成为慢性肾脏病潜在的诊断和治疗靶点。

关键词：慢性肾脏病 let-7c-5p TGF-β1 诊断与治疗

let-7c-5p在乳腺癌中的表达、功能及其分子机制的研究

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Let-7c-5p在乳腺癌中的表达、功能及其分子机制的研究

作者：傅枭男浙江理工大学

学位级别：硕士

乳腺癌是女性最普遍的恶性疾病之一,它的高发生率及死亡率严重威胁女性身心健康。随着精准医疗的提出,乳腺癌的治疗方法将更加多样化,治疗效果也将更加令人满意。在精准医疗中基因工程将发挥重要作用,所以探究基因在乳腺癌中扮演的角色... 详细信息

乳腺癌是女性最普遍的恶性疾病之一,它的高发生率及死亡率严重威胁女性身心健康。随着精准医疗的提出,乳腺癌的治疗方法将更加多样化,治疗效果也将更加令人满意。在精准医疗中基因工程将发挥重要作用,所以探究基因在乳腺癌中扮演的角色以及其发挥作用的分子机制能够为精准医疗奠定理论基础。let-7c-5p是抑癌基因let-7家族中的一员,它在前列腺癌、非小细胞肺癌以及结肠癌中都起着一定的抑癌作用,在乳腺癌患者血清中检测到其表达量呈明显下降趋势,但是let-7c-5p在乳腺癌中的生物学功能尚未明了。本研究选取9对乳腺癌以及相对应癌旁组织的石蜡包埋样本为实验对象,提取其总RNA后,进行RT-qpcR检测let-7c-5p在乳腺癌及癌旁组织中的表达情况;同时在乳腺癌细胞McF-7中过表达let-7c-5p,采用MTT的方法测试let-7c-5p对McF-7细胞增殖能力的影响,利用流式细胞仪探测let-7c-5p对McF-7细胞凋亡的影响;然后利用生物信息学软件预测let-7c-5p潜在的靶标基因,并用双荧光素酶实验加以验证,再采用荧光定量pcR和Western blotting实验深入探索其调控方式。结果显示let-7c-5p在9例乳腺癌组织中的表达量均低于对应的癌旁组织,其在癌组织中的表达量约为癌旁组织的0.23。对乳腺癌细胞McF-7转染let-7c-5p mimics后,细胞中let-7c-5p表达量较对照组显著升高(pplet-7c-5p mimics终浓度呈正相关;流式细胞仪检测结果表明过表达let-7c-5p后细胞凋亡率明显上升(pcc6为let-7c-5p潜在的靶标基因,双荧光素酶实验、Western blotting和荧光定量pcR结果表明let-7c-5p能够结合至ERcc6 mRNA的3’UTR,从而抑制ERcc6蛋白的合成,但是ERcc6 mRNA的表达水平并不受let-7c-5p影响。综上,本研究结果表明let-7c-5p在乳腺癌组织中呈低表达,在乳腺癌细胞中过表达let-7c-5p能明显抑制细胞增殖,并且引发细胞凋亡,ERcc6为let-7c-5p的靶基因,let-7c-5p可能通过抑制ERcc6蛋白表达发挥其抑癌作用。

关键词：乳腺癌 let-7c-5p 细胞增殖细胞凋亡 ERcc6

let-7c-5p介导cyclinD1下调在氟诱导人成骨细胞增殖活化中的作用及机制研究

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let-7c-5p介导CyclinD1下调在氟诱导人成骨细胞增殖活化中的作用...

作者：罗可可贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:地方性氟中毒是一种因摄入过量氟导致的慢性全身性疾病,主要表现为氟斑牙和氟骨症。成骨细胞的增殖和活化与氟骨症密切相关,并受细胞周期严密调控,而micro RNAs(mi RNAs)与之密切相关。本研究基于课题组前期研究结果,进一步分析let... 详细信息

目的:地方性氟中毒是一种因摄入过量氟导致的慢性全身性疾病,主要表现为氟斑牙和氟骨症。成骨细胞的增殖和活化与氟骨症密切相关,并受细胞周期严密调控,而micro RNAs(mi RNAs)与之密切相关。本研究基于课题组前期研究结果,进一步分析let-7c-5p通过调控cyclin D1在氟诱导的成骨细胞增殖活化中的作用,为mi RNA在氟骨症中的防治应用提供新思路。方法:***-7c-5p、cyclin D1与Wnt9a在燃煤污染型氟暴露人群的表达及相关性分析:依据地方性氟中毒病区划分标准(GB 17018-2011),选择贵州省燃煤污染型氟中毒病区织金县荷花村及非氟中毒地区安顺市双堡镇张官村作为调查点。依据纳入排除标准,知情同意原则下追踪既往调查对象共248例,采集调查对象血样及尿样,氟离子选择电极法测定调查人群体内氟负荷并进行分组,根据测定的尿氟浓度(UF),将调查对象分为三组:(1)UFcr,共117例;(2)1.96 mg/g cr≤UFcr,共65例;(3)UF≥3.92 mg/g cr,共66例。采用微量酶标法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测碱性磷酸酶活性(ALp)和骨钙素(BGp)含量。在课题组前期对氟暴露人群mi RNA测序基础上,使用生物信息学软件筛选出靶向调控cyclin D1且表达明显下调的mi RNA——let-7c-5p。使用生物信息学软件进一步分析发现let-7c-5p除了靶向cyclin D1外,还靶向Wnt/β-catenin通路中Wnt9a。采用q RT-pcR验证调查对象血浆中let-7c-5p表达及外周血单个核细胞中Wnt9a m RNA转录;ELISA法检测外周血单个核细胞中Wnt9a蛋白表达,在课题组前期检测氟暴露人群中cyclin D1表达的基础上,使用Spearman相关系数法分析调查对象let-7c-5p与cyclin D1、Wnt9a表达的相关性。2.氟对let-7c-5p、cyclin D1及Wnt9a/β-catenin通路的影响:酶消法分离人原代成骨细胞,通过形态学观察、碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定人原代成骨细胞。根据课题组前期实验结果以0、600、1200μmol/L Na F处理人成骨细胞72 h进行后续试验。q RT-pcR检测let-7c-5p、cyclin D1及Wnt9a m RNA转录;Western-blotting检测Wnt9a、β-catenin及cyclin D1蛋白表达;免疫荧光检测β-catenin入核情况;染色质免疫共沉淀法(ch Ip)法检测β-catenin在cyclin D1转录调控区富集情况。***-7c-5p调控cyclin D1参与氟诱导的人成骨细胞增殖活化机制研究:(1)结合课题组前期发现氟可诱导人成骨细胞活化的基础上,采用let-7c-5p mimic和mimic Nc转染人成骨细胞24 h后用q RT-pcR检测let-7c-5p表达,确定转染成功后进一步采用1200μmol/L Na F处理人成骨细胞72 h,q RT-pcR检测let-7c-5p表达,ccK-8、Ed U、流式细胞术检测let-7c-5p对成骨细胞增殖的影响;微量酶标法和ELISA法检测ALp活性和BGp含量。(2)通过生物信息学软件预测let-7c-5p与cyclin D1的结合位点,使用双荧光素酶报告基因实验验证let-7c-5p与cyclin D1的靶标关系。采用let-7c-5p mimic和mimic Nc转染人成骨细胞24 h后进一步采用1200μmol/L Na F处理人成骨细胞72 h,q RT-pcR检测cyclin D1 m RNA转录;Western-blotting检测cyclin D1蛋白表达。(3)通过生物信息学软件预测let-7c-5p与Wnt9a的结合位点。使用双荧光素酶报告基因实验验证let-7c-5p与Wnt9a的靶标关系。采用let-7c-5p mimic和mimic Nc转染人成骨细胞24 h后进一步采用1200μmol/L Na F处理人成骨细胞72 h,q RT-pcR检测Wnt9a m RNA转录,Western-blotting检测Wnt9a蛋白表达、β-catenin蛋白核内外表达以及β-catenin在cyclin D1转录调控区富集情况。结果:1.随着调查对象尿氟浓度增加,let-7c-5p表达降低,Wnt9a m RNA转录及蛋白表达增加,并且cyclin D1表达和Wnt9a表达均与let-7c-5p表达呈负相关,提示let-7c-5p可能参与了氟暴露人群中cyclin D1与Wnt9a的上调。2.在染氟人成骨细胞中,随着Na F剂量增加,let-7c

关键词： let-7c-5p Wnt/β-catenin信号通路 cyclin D1 燃煤污染性氟中毒成骨细胞增殖活化