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let-7 microRNA在小鼠胎肺发育时期的表达检测及其腺病毒穿梭质粒的构建

Let-7 microRNA在小鼠胎肺发育时期的表达检测及其腺病毒穿梭质粒...

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作者：王虹福建师范大学

学位级别：硕士

微RNA （microRNA,miRNA）是一类在进化上高度保守、长度约20～24个核苷酸的小分子非编码RNA,能通过与靶基因3’非翻译区相结合,从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因。let-7 microRNA是发现较早的一类niRNA,最早在线虫上发现let-7能调控... 详细信息

微RNA （microRNA,miRNA）是一类在进化上高度保守、长度约20～24个核苷酸的小分子非编码RNA,能通过与靶基因3’非翻译区相结合,从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因。let-7 microRNA是发现较早的一类niRNA,最早在线虫上发现let-7能调控细胞分裂的时序。此后大量证据表明,let-7参与动物多个器官发育的调控过程,并与人类疾病发生密切相关。本研究利用real-time PCR技术检测了let-7家族8个成员在小鼠胚胎肺发育过程中的表达趋势,发现从小鼠假腺肺的前中期到囊状肺的前期,let-7家族8个成员均有表达,且表达量均持续升高,到囊状肺的中后期,其中let-7a、let-7d、let-7e、let-7f、let-7i五个家族成员表达量略有下降,let-7b、let-7c表达量没有明显变化、而let-7g表达量则有所升高。接着,本实验选取8个家族成员中表达丰度最高的let-7a和let-7d,利用原位杂交技术分析它们在小鼠胚胎肺发育过程中的表达模式,结果表明：let-7a和let-7d在小鼠胚胎肺的上皮和间充质中均有明显表达,且在肺芽远端上皮末梢中的表达较为强烈,到出生后三天（P3）,其在胚胎肺上皮和间充质中的表达减弱,这种表达趋势的变化与real-time PCR的结果相近。在此基础上,本实验通过构建pDC316-CMV-control、pDC316-CMV-let-7a以及pDC316-mCMV-mK-ras三个腺病毒表达载体,并将其分别转染细胞,利用RT-PCR以及western blot的方法检测所构建的表达载体,实验结果表明,以pDC316-CMV-control作为对照组,pDC316-CMV-let-7a、pDC316-mCMV-mK-ras两个腺病毒表达载体在mRNA水平及蛋白质水平上均能实现体外过表达。本研究旨在为后期构建腺病毒,并在小鼠体内研究let-7 miRNAs与mK-ras基因负调控关系,及其参与调控哺乳动物胚胎肺发育的分子机制奠定基础。

关键词： let-7 micrornas mK-ras 胎肺发育腺病毒载体

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let-7/lin-28调控通路在牙鲆变态发育中的作用

let-7/lin-28调控通路在牙鲆变态发育中的作用

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作者：高丽娜上海海洋大学

学位级别：硕士

牙鲆Paralichthys olivaceus属于海水鱼类,在我国的经济价值较高,其胚后发育阶段经历了剧烈的变态现象,对其变态发育机制的研究已成为热点,一些异时性基因(heterochronic genes)如let-7、lin-28a、lin-28b、lin-41和lin-29等在很多脊椎... 详细信息

牙鲆Paralichthys olivaceus属于海水鱼类,在我国的经济价值较高,其胚后发育阶段经历了剧烈的变态现象,对其变态发育机制的研究已成为热点,一些异时性基因(heterochronic genes)如let-7、lin-28a、lin-28b、lin-41和lin-29等在很多脊椎动物中呈现出保守的时空性调控表达模式,在生物发育过程中进行精准有序地调控表达,对这些基因的研究有助于牙鲆变态发育分子机制的阐明。let-7 miRNAs类似于其他的micrornas,主要作用于靶基因的3’-UTR序列。LIN-28a及其同源分子LIN-28b是RNA结合蛋白,LIN-41是细胞质蛋白,LIN-29是多锌指结构蛋白,它们都与生物发育时空性紧密相关。本课题组在对牙鲆的变态发育研究中已鉴定得到牙鲆10个let-7 miRNAs并对其在牙鲆发育中的表达进行了相对定量检测。本论文主要研究其余四个异时性基因lin-28a、lin-28b、lin-41和lin-29的克隆、表达分析及其在牙鲆变态发育中与let-7的调控关系。本论文以牙鲆总cDNA为模板,采用PCR等克隆获得牙鲆lin-28a、lin-28b和lin-29基因cDNA全长及lin-41的编码区序列(Coding sequence,CDS),利用生物信息学方法分别分析它们的氨基酸序列、不同物种间同源性比较、构建进化树及预测蛋白三级结构;通过实时荧光定量PCR技术在牙鲆成鱼多个组织和不同发育时期的仔鱼中检测各个异时性基因的相对表达量及外源性th和tu对变态期牙鲆仔鱼各异时性基因表达水平的影响;预测得到牙鲆let-7mirnas的靶基因(lin-28a和lin-28b)并进行验证;构建牙鲆lin-28a和lin-28b基因的真核表达载体并将其和let-7mirnasmimicis在牙鲆胚胎细胞(fecs)中分别进行过表达及后续检测试验。以期初步揭示牙鲆早期发育中这些异时性基因的作用和相互关系,为进一步研究牙鲆变态发育调控通路提供基础性资料。lin-28a基因全长1617bp,包括118bp的5’-utr、890bp的3’-utr和609bp的开放阅读框,编码202个氨基酸;lin-28b基因全长2998bp,包括218bp的5’-utr、2075bp的3’-utr和705bp的开放阅读框,编码234个氨基酸;lin-29基因全长1769bp,包括112bp的5’-utr、328bp的3’-utr和1329bp的开放阅读框,编码442个氨基酸;lin-41的开放阅读框有2502bp,编码833个氨基酸。牙鲆四个异时性基因lin-28a、lin-28b、lin-41和lin-29的氨基酸序列与其他物种的同源性分别在62%4%、63%3%、70%3%和68%5%,进化树分析显示牙鲆四个异时性基因均与其他鱼类同源基因聚为一支,这些基因的氨基酸序列在不同物种间具有相同或相似的蛋白结构,进化和功能方面具有保守性。牙鲆异时性基因lin-28a、lin-28b、lin-29和lin-41在牙鲆成鱼的脑和性腺中都有较高的表达量,尤其是lin-28a和lin-28b在脑和性腺中呈现很突出的高表达(plet-7相反,说明三者可能与let-7存在负向调控关系,lin-41和lin-29在牙鲆成鱼其余各组织中也均有较高的表达量可能与其结构及功能多样性相关(pmicrornaslet-7的靶基因验证试验中,牙鲆lin-28a3’-utr区的三个预测靶位点中只有第二个位点受到let-7的靶控作用,其实验组的萤火虫荧光素酶相对活性明显减弱(plet-7的靶向抑制作用最强(plet-7的靶基因且其3’-utr区域至少存在一个靶位点,及lin-28a受不同let-7的靶向抑制作用程度之间有差异。将重组真核过表达载体pegfp-n1-lin-28a、pegfp-n1-lin-28b和let-7mirnas在牙鲆胚胎细胞中过表达后,细胞中有绿色荧光融合蛋白表达,表明载体转染成功且在牙鲆胚胎细胞中表达;pegfp-n1-lin-28a和pegfp-n1-lin-28b重组质粒在fecs中过表达均有使牙鲆pre-let-7的表达堆积和let-7mirnas的表达减少的作用(p<0.05),表明牙

关键词：牙鲆变态发育异时性基因 lin-28a lin-28b lin-41 lin-29 let-7 micrornas 调控通路

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