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Heterozygosity of knob-Associated Tandem Repeats and knob Instability in Mitotic Chromosomes of Zea （Zea mays L. and Z. diploperennis Iltis Doebley）

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Journal of Integrative Plant Biology 2005年第11期47卷 1345-1351页

作者： Zhi-Yong XIONG Yong LIU Yong-Gang HE Yun-Chun SONG Ke-Xiu LI Guan-Yuan HE China-UK HUST-RRes （Rothamsted Reseach UK） Genetic Engineering and Genomics Joint Laboratory Huazhong University of Science and Technology （HUST） Wuhan 430074 China Key Laboratory of the Ministry of Education for Plant Developmental Biology Wuhan University Wuhan 430072 China

knobs are blocks of heterochromatin present on chromosomes of maize （Zea mays L.） and its relatives that have effects on the frequency of genetic recombination, as well as on chromosome behavior. knob heterozygosity and instability in six maize inbred lines and one Z. diploperennis Iltis Doebley line were investigated using the fluorescence in situ hybridization （FISH） technique with knob-associated tandem repeats （180 bp and 350 bp （TR- 1）） as probes. Signals of seven heterozygous knobs containing 180- bp repeats and of one heterozygous knob containing TR- 1 were captured in chromosomes of all materials tested according to the results of FISH, which demonstrates that the 180-bp repeat is the main contributor to knob heterozygosity compared with the TR- 1 element. In addition, one target cell with two TR- 1 signals on one homolog of chromosome 2L, which was different from the normal cells in the maize inbred line GB57, was observed, suggesting knob duplication and an instability phenomenon in the maize genome.

关键词： fluorescence in situ hybridization knob repetitive DNA sequence Zea diploperennis Z. mays.

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靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒构建及感染性质分析

靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒构建及感染性质分析

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作者：李哲吉林大学

学位级别：硕士

溶瘤病毒(Oncolytic viruses,Ovs)疗法是肿瘤生物治疗应用的一个热点,其原理是利用病毒的复制能力,选择性感染和裂解破坏肿瘤细胞,且正常细胞和组织无害,裂解的肿瘤细胞可以释放子代病毒和肿瘤相关抗原,刺激机体产生免疫反应进一步杀伤... 详细信息

溶瘤病毒(Oncolytic viruses,Ovs)疗法是肿瘤生物治疗应用的一个热点,其原理是利用病毒的复制能力,选择性感染和裂解破坏肿瘤细胞,且正常细胞和组织无害,裂解的肿瘤细胞可以释放子代病毒和肿瘤相关抗原,刺激机体产生免疫反应进一步杀伤肿瘤细胞。此外,有研究表明:某些OVs(如溶瘤痘病毒)还能够特异性地感染并破坏肿瘤血管,间接引起未感染的肿瘤细胞凋亡或坏死。肿瘤新生血管(Tumor neo-vasculature)为肿瘤细胞的增殖和转移提供氧气和营养物质,OVs通过靶向感染和破坏肿瘤血管将进一步增强其肿瘤杀伤能力并抑制肿瘤的侵袭转移。溶瘤腺病毒,也被称为条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAd)是目前临床研究应用最多的溶瘤病毒之一。目前在研的溶瘤腺病毒主要是基于人血清5型腺病毒(Ad5)改造而来。Ad5的主要细胞受体是柯萨奇-腺病毒受体(CAR),腺病毒通过其纤维蛋白(fiber)与受体结合,从而使其附着在细胞表面,并通过整合素受体内化。由于肿瘤血管内皮细胞表面CAR低表达或不表达,使得CRAd5缺乏感染肿瘤血管内皮细胞的能力,因而限制了溶瘤腺病毒通过破坏肿瘤血管增强其抗肿瘤作用的潜力。目前已发现60多种血清型的人腺病毒,并分为A-G七个亚群,不同血清型腺病毒因识别受体不同而感染不同的细胞类型。如C亚群的Ad5等血清型的细胞受体是CAR,而D亚群的Ad37则以唾液酸(SA)为受体。唾液酸是神经氨酸的乙酰化衍生物,唾液酸的含量与肿瘤的增值、转移、浸润等密切相关,不同形式的唾液酸与血管内皮细胞的黏附相关。因此,我们提出以下假设:1、肿瘤血管内皮细胞表面的唾液酸受体会呈现高表达。2、将Ad5纤维蛋白上识别受体的头节区(knob)替换为Ad37的knob,构建fiber嵌合型病毒,可以增强CRAd5感染肿瘤血管内皮细胞的能力。此外,有研究报道,在整合素高表达的肿瘤模型中,RGD修饰的溶瘤病毒可以增强靶向性和抗肿瘤活性。同时,RGD肽通过竞争细胞外基质整合素受体,抑制肿瘤血管的新生,降低肿瘤细胞对正常组织的浸润与黏附能力。因此,以RGD修饰fiber嵌合型病毒,将进一步增强CRAd5靶向感染肿瘤血管的能力。基于上述背景,本论文设计构建一种新型fiber嵌合型溶瘤腺病毒,以增强溶瘤腺病毒靶向感染肿瘤血管内皮细胞的能力。具体构建策略:首先,将CRAd5的knob替换为Ad37的knob构建CRAd5/K37;然后,在CRAd5/K37的knob或其它fiber区域突变或插入RGD肽进一步构建RGD修饰的嵌合溶瘤腺病毒CRAd5/K37-RGD。获得上述嵌合病毒后,深入分析其感染肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的能力和性质。本论文首先分析了靶向肿瘤血管溶瘤腺病毒修饰策略的可行性。通过流式细胞术检测发现,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表面的唾液酸受体呈现高表达。同时在构建病毒载体之前,首先构建了两种修饰策略的嵌合fiber真核表达载体,通过Western Blot分析嵌合fiber的表达情况和三聚体形式。结果显示:嵌合fiber(F5/K37)能够正常表达并形成三聚体;在Ad37 knob区域的HI-loop环插入RGD肽影响嵌合fiber的表达和三聚体形成,进而会影响病毒包装;而在fiber的shaft区域突变插入RGD肽,不影响嵌合fiber的表达和三聚体的形成。随后,在上述设计和前期验证的基础上,构建了以肿瘤特异性启动子Survivin介导E1基因表达的fiber嵌合型溶瘤腺病毒CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD。通过腺病毒骨架质粒的构建以及病毒包装、筛选、纯化和滴度测定等步骤最终成功获得了上述两种新型溶瘤腺病毒。然后,通过Dot blot等实验验证了嵌合病毒纤维蛋白的型别变化。接下来,我们重点分析了嵌合型溶瘤腺病毒对人血管内皮细胞和肿瘤细胞的感染性质。分别以表达红色荧光蛋白(RFP)的CRAd5、CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD感染人血管内皮细胞(HUVEC)、人微脑血管内皮细胞(hCMEC/D3)、正常肝细胞和多种肿瘤细胞系,流式分析其细胞转导能力。结果表明:相比于未改造病毒CRAd5,CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD在人血管内皮细胞和多种肿瘤细胞系中的感染和表达能力得到了显著提升。对比两种嵌合病毒发现,尽管CRAd5/K37-S-RGD对一些肿瘤细胞系的感染能力低于CRAd5/K37,但其对肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的选择性更好,表明CRAd5/K37-S-RGD具有更好的安全性。然后,以人卵巢癌细胞系SKOV3为模型,通过knob蛋白阻断,进一步明确了嵌合病毒CRAd5/K37-S-RGD感染依赖的主要受体为CAR、S

关键词：基因工程肿瘤血管溶瘤腺病毒 RGD肽 knob

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