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嗜酸性氧化亚铁硫杆菌cox、cup和iro基因在亚铁氧化中的作用比较分析

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌cox、cup和iro基因在亚铁氧化中的作用比较...

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作者：崔爽山东大学

学位级别：硕士

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）是一种专性自养的极端嗜酸的硫杆菌,它广泛分布于硫化矿床、酸性矿水及土壤中,在细菌冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等方面发挥着重要作用,是目前研究最深入,应用最广泛的浸矿... 详细信息

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）是一种专性自养的极端嗜酸的硫杆菌,它广泛分布于硫化矿床、酸性矿水及土壤中,在细菌冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等方面发挥着重要作用,是目前研究最深入,应用最广泛的浸矿细菌之一。它能在酸性条件下将Fe2+氧化为Fe3+,或者将元素硫或还原性硫化物氧化为硫酸,并依靠这些无机物的氧化过程获得能量。浸矿过程中产生的Fe3+是促使矿石中其他金属浸出的氧化剂,因此该菌的亚铁氧化能力与矿石浸出紧密相连。在实际应用过程中,这类细菌生长缓慢,代时长,细胞得率低,限制了它在生产中的应用效率,也给研究工作带来诸多不便。因此,对其进行遗传改造,提高该菌的亚铁氧化能力势在必行。本论文对嗜酸性氧化亚铁硫杆菌铁氧化系统电子传递链基因进行了克隆鉴定,并与具有广泛宿主的质粒连接,置于强启动子tac下,重新导入该菌中获得表达,研究并比较了所构建菌株的铁氧化活性,生长状况和浸矿能力的变化,为改造这类菌中提供理论和方法依据。首先将***19859中的细胞色素氧化酶基因cox,含铜蛋白基因cup,以及亚铁氧化酶基因iro分别克隆至pUC18质粒上,然后亚克隆至pJRD215或pMSD2上,构建重组质粒pTCOX、pTCUP和pTiro。通过接合转移将这些质粒转入***19859中。然后通过菌落PCR等方法验证,表明成功构建了基因工程菌***（pTCOX）、***（pTCUP）和***（pTiro）。测定了所构建菌株的质粒稳定性,亚铁消耗速率,氧化还原电位,生长曲线和浸矿效率,并进行了比较。结果表明重组质粒能够稳定地遗传,***（pTCOX）的铁氧化活性得到较大幅度的提高。然后以***野生型为对照,以alaS基因为内参,运用荧光定量对***（pTCOX）的rus操纵子内基因的表达情况进行了分析。为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌进一步的基因改良工作提供了理论指导。

关键词：生物冶金嗜酸性氧化亚铁硫杆菌 Fe2+氧化活性 cox基因 cup基因 iro基因接合转移

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禽病原性大肠杆菌E037株有关基因突变株的构建及其致病性研究

禽病原性大肠杆菌E037株有关基因突变株的构建及其致病性研究

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作者：刘静扬州大学

学位级别：硕士

禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病, CRD)、... 详细信息

禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病, CRD)、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎/卵黄囊感染。禽大肠杆菌病是2至12周龄鸡和火鸡的一种常见传染病,给养禽业造成了严重的经济损失。大肠杆菌血清型复杂多样,在禽类中最常见的血清型是O1、O2和O78,与其致病相关的毒力因子已被相继报道,如脂多糖复合物、荚膜、黏附素、温度敏感性血凝素、铁摄取系统、外膜蛋白、毒素、AGI-3基因组岛、侵袭素IbeA、Pst系统、大肠杆菌素等。虽然已知APEC有许多种毒力因子,但是还未鉴定出某一单独的毒力因子可以区分所有的致病菌株与非致病菌株。人们在致力于弄清APEC已知毒力因子的同时,也将注意力转移到新的致病基因的分离与鉴定方面。我们在大量禽源大肠杆菌的致病性实验中,发现有相当比例的分离株并不具备已知的毒力因子,这说明这些分离株还存在其他毒力因子,在同一优势血清型的分离株,其致病性也有高低之分。所以寻找发现新的大肠杆菌致病因子,具有重要的研究意义。本研究以构建基因突变株的方法,分离和鉴定了APEC可能的毒力相关基因,同时结合其生物学特性,为研究该病的致病机理和防制措施奠定了基础。1.禽病原性大肠杆菌tsh基因突变株的构建及其与致病性关系的研究运用基因重组方法将庆大霉素抗性基因(GM)连接到PCR扩增的tsh两端区域产生的2个目的基因片段之间,并插入到pUC18载体的多克隆位点中,构建成带GM标志的载体pUC18-tshFRGM,从中切下此3个片段,再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性载体pMEG375-tshFRGM,将突变载体转化到受体APECE037株和基因缺失突变株E037 (?iro)株中,根据同源重组原理,分别筛选出E037基因缺失突变株E037 (?tsh)和E037 (?iro?tsh)。动物实验结果表明E037 (?iro)、E037 (?tsh)和E037 (?iro?tsh)突变株的致病性均有了明显下降。铁系统和温度敏感性血凝素在APEC E037株的致病性和持续感染中发挥重要的作用,但两个基因的协同致病能力不明显。在243株APEC中,有205株为iro+菌株,其中高致病株、中等致病株和低致病株分别为89.8% (184/205)、8.8% (18/205)和1.5% (3/205);有167株为tsh+菌株,其中高致病株、中等致病株和低致病株分别为87.4% (146/167)、12.6% (21/167)和0% (0/167)。结果显示铁系统和温度敏感性血凝素为APEC重要的致病因子。2.禽病原性大肠杆菌两个未知基因突变株的构建及其对致病性影响的研究采用抑制差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization, SSH)对禽病原性大肠杆菌高致病株E037 (血清型O78)与非致病菌株K-12 MG1655进行基因组差异片段克隆与分析。从E037株中共检出17个特异性差异片段,选取其中编号为88#和126#的两个片段进行突变株的构建。通过PCR扩增出88#和126# 2个目的基因片段,并插入到T-easy载体的多克隆位点中,构建出T-88#,T-126#,分别从中切下这两个片段,再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性载体pMEG375-88#,pMEG375-126#将突变载体转化到受体APEC E037中,根据同源重组原理,分别筛选出E037基因插入突变株E037-1及E037-2。动物实验结果表明E037-1及E037-2突变株的致病性均有了明显下降。结果显示这两个基因可能是APEC的致病相关基因,值得对其功能进行进一步研究。

关键词：禽病原性大肠杆菌 iro基因 tsh基因功能未知基因基因缺失突变株抑制差减杂交基因插入突变株

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