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Exploration and Validation of the Potential downstream Genes Underlying ipa1-2d Locus for Rice Panicle Branching

Phyton-International Journal of Experimental Botany 2021年第3期90卷 773-787页

作者： Lin Zhang dong Xie Zhong Bian Yiting Zou Han Zhou Wenlu Cai Hadi Yeilaghi Xiaolei Fan Changquan Zhang Qiaoquan Liu Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of the Ministry of Education Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular BreedingYangzhou UniversityYangzhou225009China Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and PhysiologyYangzhou UniversityYangzhou225009China

In recent years,some super hybrid rice varieties were bred with strong culms and large panicles,which are mainly contributed by the ipa1-2d locus.A gain-of-function allele of OsSPL14 is the ipa1-2d and it can greatly increase the panicle primary branch ***,the key downstream genes mediating this trait variation are not fully *** this study,we developed high-quality near-isogenic lines(NILs)with a difference of only 30 kb chromosomal segment covering the ipa1-2d *** the NILs,we explored the impact of ipa1-2d on five sequential stages of early inflorescence development,and found that the locus can greatly enhance the initiation of primary branch meristems.A transcriptomic analysis was performed to unveil the downstream molecular network of ipa1-2d,and 87 genes were found differentially expressed,many of which are involved in metabolism and catalysis *** addition,transgenic lines of overexpression and RNA interference were generated to shape different levels of *** were also used to validate the expression variation explored by *** on the gene annotation,twelve potential downstream targets of ipa1-2d were selected,and their expression variation was confirmed by qRT-PCR analysis both in NILs and transgenic *** research expands the molecular network underlying ipa1-2d and provides novel gene information which might be involved in the control of panicle *** discussed the potential function of identified genes and highlighted their values for future function exploration and breeding application.

关键词： Rice ipa1-2d panicle branching inflorescence meristems gene expression

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水稻ipa1-2d株型调控遗传解析及关键下游基因功能研究

水稻ipa1-2D株型调控遗传解析及关键下游基因功能研究

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作者：谢东扬州大学

学位级别：硕士

水稻株型是决定水稻产量的重要因素之一,通过塑造水稻理想株型才能实现水稻产量进一步提升。ipa1是之前克隆的调控水稻理想株型的主效基因,ipa1-2d作为其自然等位,提高了其表达量。ipa1已被证实参与水稻株高、茎粗、分蘖、穗型的调控,... 详细信息

水稻株型是决定水稻产量的重要因素之一,通过塑造水稻理想株型才能实现水稻产量进一步提升。ipa1是之前克隆的调控水稻理想株型的主效基因,ipa1-2d作为其自然等位,提高了其表达量。ipa1已被证实参与水稻株高、茎粗、分蘖、穗型的调控,其下游调控网络研究有所发展,但还不够完善。为了进一步解析ipa1-2d对于水稻株型等性状的调控,探究ipa1-2d对于水稻株型调控的下游分子网络,本文以ipa1-2d作为研究对象,围绕其对株型相关性状调控效应进行验证,并进行关键下游响应基因寻找和功能验证研究,完善ipa1-2d株型调控网络。目前研究成果如下:（1）前期通过粳稻品种日本晴（Nipponbare,NIP）和籼稻品种YYP1杂交得到F2分离群体,通过QTL定位发现8号染色体存在一个对多种株型性状产生影响的位点。随后通过连续多代自交,构建了残余杂合单株衍生的分离群体,对该群体多个株型性状连锁分析发现茎粗、穗一次枝梗、剑叶宽在ipa1-2d分离基因型之间具有显著差异,表明ipa1-2d可能是多个株型性状的调控位点;利用不同世代的自交重组单株,我们将该调控区间逐渐缩小,明确了ipa1-2d对相关性状的调控效应。（2）为了进一步明确ipa1-2d对多种株型性状调控效应,我们对籼稻品种YYP1的ipa1-2d位点进行基因敲除,获得了一系列不同类型突变体,对不同株系开展了株型性状调查,发现ipa1-2d位点敲除后对应植株茎粗、穗一次枝梗数、剑叶宽都大幅度降低,剑叶长和穗长也有所下降。证明ipa1-2d参与多个株型性状调控,且位于相关调控网络上游。（3）利用实验室前期构建的ipa1不同拷贝数和RNAi材料,我们进一步比较了不同株系的株型性状变化,发现茎粗、穗一次枝梗数随着ipa1表达量上升而递增。而穗二次枝梗数、株高、剑叶长、剑叶宽随着ipa1表达量上升表现为先上升后下降的变化趋势。穗长、倒二叶宽和倒二叶长在不同拷贝数植株中没有明显的剂量变化特征,但在RNAi株系明显降低。上述结果说明ipa1在多种株型性状调控中存在剂量效应。（4）通过对ipa1不同拷贝数材料转录组数据分析发现860个基因表达存在差异,根据表达变化趋势以及公共数据库表达模式差异挑选了 8个可能的ipa1下游基因。通过qRT-PCR对下游基因在24个不同类型组织以及NIL-ipa1和NIL-ipa1-2d近等基因系连续幼穗发育组织进行表达模式分析发现,8个基因都具有时空表达特异性,在近等基因系间表达也具有差异,证明相关基因响应ipa1-2d调控。（5）根据八个基因的注释,我们采用了双基因组合模式（IAA/PIN、GRF/GH3、PP/F-BOX、SPL/ZF-Hd）对八个基因开展了序列突变功能验证,转化的背景材料为包含ipa1-2d不同等位的近等基因系材料,用于进一步验证相关基因与ipa1-2d的互作。测序分析及CAPS标记鉴定显示成功构建了8个基因的两两敲除材料;此外,我们还构建了IAA和GRF基因的超表达转基因株系,qRT-PCR分析相关单株发现了表达明显上调的单株,证明我们成功构建超表达材料。（6）对T0和T1代转基因材料的剑叶长、剑叶宽、穗长、穗一次枝梗数和二次枝梗数表型测量分析。通过比较不同背景的基因组合敲除株系,发现其中存在表型明显偏离野生型数值的单株,暗示相关基因突变对表型有影响。然而对不同株系进行平行比较,我们没有发现统一变化规律。对株系内部分极端分离单株进行测序验证发现突变型不能解释所有表型变化,有待后续进行更为细致的解析。相比野生型,IAA过表达有增加叶部和穗部性状的趋势,而GRF过表达有降低相关性状的趋势。综上,我们初步获得了不同转基因株系的表型变化特征,为后续开展进一步功能研究提供了参考。

关键词：水稻株型 ipa1-2d 叶宽基因编辑

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水稻穗型调控位点qPL6与ipa1-2d互作机制及关键下游基因功能验证

水稻穗型调控位点qPL6与ipa1-2D互作机制及关键下游基因功能验证

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作者：邹怡婷扬州大学

学位级别：硕士

水稻穗部的发育状态直接影响并决定水稻的产量,开展水稻穗部发育调控的分子遗传研究具有重要意义。目前已经克隆出许多对穗发育进行调控的基因,不同基因之间的相互作用,也会对水稻穗部发育产生各种影响。我们为了探索优质的基因组合,对... 详细信息

水稻穗部的发育状态直接影响并决定水稻的产量,开展水稻穗部发育调控的分子遗传研究具有重要意义。目前已经克隆出许多对穗发育进行调控的基因,不同基因之间的相互作用,也会对水稻穗部发育产生各种影响。我们为了探索优质的基因组合,对前期定位的调节水稻穗长的位点qPL6以及调节水稻穗分枝数的基因ipa1-2d进行互作分析。同时以日本晴为背景,构建与这两个位点有关的四个近等基因系,转录组实验寻找下游差异表达基因,丰富影响穗型的基因调控网络,并筛选了一些有潜在功能的新基因进行突变体和过表达材料创制,明确其表型效应并探索其育种价值。此外,我们还发展了高质量的残余杂合近等基因系,以探索ipa1-2d和ipa1-1d的遗传效应差异及其育种利用价值。主要研究结果如下:（1）通过构建日本晴背景下的不同回交世代近等基因系,明确了 qPL6位点增加水稻穗长、ipa1-2d位点增加水稻穗一级分枝数的遗传效应。证明这两个位点之间存在遗传互作效应,双位点聚合可以进一步改善水稻的穗部性状,表现为穗长和穗分枝数进一步增加;此外,茎粗和叶长性状也表现出类似变化模式。（2）为了探究qPL6和ipa1-2d互作影响穗型的发育学本质,对纯合背景近等基因系的幼穗发育动态过程进行切片观察,发现qPL6单位点存在延迟原基起始和伸长的效应,而ipa1-2d单位点可加快原基起始和伸长,qPL6在ipa1-2d存在的情况穗发育进程变快。（3）为了进一步验证两个位点互作的分子机制,我们开展了基因组织表达模式分析。结果显示qPL6以及ipa1-2d这两个位点对应的基因都在穗原基及幼穗表达,且qPL6的表达量受到ipa1-2d的调控,推测两者为上下游的关系,由此明确了两个位点的分子互作模式。（4）为了解释ipa1-2d和qPL6的下游调控网络,我们对四个近等基因系的穗原基组织进行了 RNA-seq,寻找响应两个位点的下游差异表达基因。通过筛选获得9个下游差异表达基因（bZIP.01、bZIP.02、bZIP.03、GA.01、GA.02、bHLH.01、bHLH.02、MAdS.01、MAdS 02）,组织表达模式分析证实所筛选基因都在穗部有所表达。（5）为了验证下游基因功能,我们对相关基因进行了敲除及过表达载体构建,敲除载体选择同一类型基因进行组合构建,分别为bZIP基因组合、GA基因组合以及bHLH基因组合,而 bZIP.01、GA.02、bHLH.02、MAdS.01、MAdS.02则是进行超表达载体的构建,分别转化四个近等基因系背景获得转基因阳性单株。（6）进一步,利用测序和CAPS标记鉴定敲除株系的突变类型,利用基因特异标记和qRT-PCR鉴定超表达株系。对T1代转基因阳性植株进行了穗部及叶部表型测量,最终在不同背景下获得了与对照相比表型明显变化的植株,敲除株系中不同突变单株对应的性状有变小的趋势,而不同超表达株系表型既有变大也有变小类型,说明部分基因的敲除或超表达构建有效应。（7）ipa1-2d与ipa1-1d为两个水稻粗杆大穗等位基因,为了了解两者是否对穗部性状调控有差异,我们以嘉优中科4号和嘉优中科6号为亲本进行自交分离系材料构建,并设计高效引物进行基因型的鉴定。结合基因型及表型分析的结果证实这两个等位对水稻的穗部表型都有影响但效果不同,姊妹系平行比较显示ipa1-2d株系的穗一级分枝数与结实率显著多于ipa1-1d株系。

关键词：水稻穗部性状 qPL6 ipa1-2d 基因编辑遗传效应分析

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