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基于高通量测序的青叶胆转录组研究

中国现代应用药学 2018年第3期35卷 363-369页

作者：吴昕怡严媛刘小莉云南中医学院中药学院昆明650500

目的探讨青叶胆中獐牙菜苦苷生物合成的遗传基础。方法采用illumina Hiseq 2500高通量测序技术,对青叶胆全草进行转录组测序。结果共获得68 643个unigene,平均长度901 bp,共有42 954条unigene注释到NR,Swiss Prot,COG,KOG,GO,Pfam数据库... 详细信息

目的探讨青叶胆中獐牙菜苦苷生物合成的遗传基础。方法采用illumina Hiseq 2500高通量测序技术,对青叶胆全草进行转录组测序。结果共获得68 643个unigene,平均长度901 bp,共有42 954条unigene注释到NR,Swiss Prot,COG,KOG,GO,Pfam数据库中,獐牙菜苦苷生物合成的3个阶段中,有43条unigene参与中间体的生成,3条unigene参与萜类骨架合成,25条unigene可能参与萜类最后的修饰。结论首次对青叶胆转录组进行测序分析,获得了可能参与獐牙菜苦苷生物合成的候选基因,为后续功能基因的挖掘奠定了基础。

关键词：青叶胆转录组 illumina Hiseq 2500 獐牙菜苦苷

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基于高通量测序的发芽苦荞转录组学研究

生物技术通报 2016年第7期32卷 40-47页

作者：陈春旭李琦郭元新杜传来丁志刚安徽科技学院食品药品学院凤阳233100 深圳市坪山新区环境监测站深圳518118

采用新一代高通量测序技术illumina Solexa Hiseq 2500对发芽荞麦转录组进行测序,结合生物信息学方法开展基因表达谱研究和功能基因预测。通过测序,获得了42 953 962个序列读取片段(reads),包含了5.37 Gb碱基序列信息。对reads进行序列... 详细信息

采用新一代高通量测序技术illumina Solexa Hiseq 2500对发芽荞麦转录组进行测序,结合生物信息学方法开展基因表达谱研究和功能基因预测。通过测序,获得了42 953 962个序列读取片段(reads),包含了5.37 Gb碱基序列信息。对reads进行序列组装,获得45 278个单基因簇(unigenes),平均长度862 bp,序列信息达到了39 Mb。另外,从长度分布、GC含量、表达水平等方面对unigenes进行评估,数据显示测序质量好,可信度高。数据库中的序列同源性比较表明,2 127个unigenes与其他生物的己知基因具有不同程度的同源性。发芽苦荞转录组中的unigenes与细胞进程、细胞和蛋白结合相关。将unigenes与KOG数据库进行比对,根据其功能大致可分为24类。以KEGG数据库作为参考,依据代谢途径可将unigenes定位到328个代谢途径分支,包括核糖体代谢通路、碳水化合物代谢等,并且筛选出38条参与GABA合成的氧化磷酸化代谢的unigenes。SSR位点查找发现,从71 366个unigenes中共找到7 141个SSR位点。SSR不同重复基序类型中,出现频率最高的为A/T,其次是AAG/CTT和AT/AT。

关键词：发芽苦荞 illumina 转录组高通量测序

祛浊通痹方对尿酸代谢异常模型大鼠肠道菌群的调节作用

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中华中医药杂志 2019年第4期34卷 1722-1726页

作者：刘秋萍余怡然李海昌温成平何志兴浙江中医药大学基础医学院杭州310053

目的:观察不同剂量祛浊通痹方对尿酸代谢异常模型大鼠肠道菌群的影响。方法:利用高脂饲料+10%酵母膏+2%氧嗪酸钾诱导尿酸代谢异常大鼠模型,用高、中、低剂量祛浊通痹方治疗。运用illumina MiSeq测序技术分析检测大鼠的肠道菌群结构。结... 详细信息

目的:观察不同剂量祛浊通痹方对尿酸代谢异常模型大鼠肠道菌群的影响。方法:利用高脂饲料+10%酵母膏+2%氧嗪酸钾诱导尿酸代谢异常大鼠模型,用高、中、低剂量祛浊通痹方治疗。运用illumina MiSeq测序技术分析检测大鼠的肠道菌群结构。结果:与正常大鼠比较,尿酸代谢异常的大鼠肠道菌群alpha多样性显著降低(P<0.05)。祛浊通痹方治疗后,综合血液生化和肠道菌群结果,中剂量祛浊通痹方的效果最好,其能增加肠道菌群alpha多样性,上调Collinsella、Proteus属,下调Gemella、Anaerostipes和Desulfovibrio属。结论:尿酸代谢异常模型大鼠的肠道菌群发生紊乱,经18g/kg生药剂量的祛浊通痹方治疗后,肠道菌群状态得到改善,且发生变化的肠道菌群可能与嘌呤代谢、尿酸降解密切相关。

关键词：尿酸代谢异常模型祛浊通痹方肠道菌群 illumina MiSeq测序

猪肌内脂肪沉积相关基因可变剪接的挖掘与分子机制的研究

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猪肌内脂肪沉积相关基因可变剪接的挖掘与分子机制的研究

作者：疏泽中国农业科学院

学位级别：硕士

可变剪接是基因表达转录后调控的关键步骤。通过可变剪接,基因可以产生多种剪接异构体,丰富转录和蛋白水平的产物。肌内脂肪是影响肉品质的重要因素,其沉积可以受到可变剪接的调控,但相关分子机制尚不明确。本研究基于纳米孔和illumina... 详细信息

可变剪接是基因表达转录后调控的关键步骤。通过可变剪接,基因可以产生多种剪接异构体,丰富转录和蛋白水平的产物。肌内脂肪是影响肉品质的重要因素,其沉积可以受到可变剪接的调控,但相关分子机制尚不明确。本研究基于纳米孔和illumina测序联合分析,对团队前期构建的大白与民猪F2代猪的背最长肌组织进行可变剪接的检测,分析肌内脂肪高、低组猪间可变剪接的潜在差异,探究剪接异构体生物学功能。主要研究内容如下:1.基于纳米孔测序对猪背最长肌的可变剪接分析利用纳米孔技术对51个背最长肌进行测序,鉴定到16641个基因,新基因5265个;鉴定到50575个转录本,新转录本43869个,49.24%基因有多个转录本亚型,对78.20%的新转录本进行功能注释。18.03%的基因通过可变剪接产生13553个剪接异构体,鉴定到18651个可变剪接事件。外显子跳跃和可变5'端剪接位点是发生最多的可变剪接事件。TNNT3、TNNT1、YBX3、MYBPC2和NEB鉴定到的剪接异构体最多。高、低组特异剪接异构体与脂肪、肌肉纤维和可变剪接调控相关。高组差异剪接异构体与肌肉纤维、脂肪酸和糖原代谢相关;低组差异剪接异构体主要与肌肉结构相关,且内含子保留占比较多。2.联合纳米孔和illumina测序的可变剪接分析利用illumina测序对纳米孔数据进行补充,共鉴定到98个差异表达剪接异构体。其中SERBP1、MYL1、TNNT3和TNNT1基因中可鉴定到多个促进或延缓脂肪沉积过程的差异表达剪接异构体。IFI6和GADD45G基因的剪接异构体表达可能引起基因表达差异。ART1和RAB2A基因的剪接异构体表达引起其他转录本表达变化,并影响基因功能发挥。共表达和蛋白互作分析结果显示,编码与肌内脂肪相关的候选剪接异构体的基因MRPL27、AAR2、PYGM、PSMD4、SCNM1和HNRNPDL与肌肉功能、糖原沉积和可变剪接调控相关。***和ONT.3228.1过表达研究构建脂肪酸合成所必须的基因OXSM以及其剪接异构体ONT.3228.1载体,转染3T3-L1细胞后,进行油红O染色、检测甘油三酯和游离脂肪酸的含量,以及对脂肪和脂肪酸相关基因进行qRT-PCR。结果显示,过表达OXSM和ONT.3228.1可以促进脂肪、甘油三酯和脂肪酸的合成,与脂肪和脂肪酸相关的基因表达上调。过表达ONT.3228.1的细胞甘油三酯和脂肪酸含量稍高于过表达OXSM的细胞,ACC和LPL的表达显著高于过表达OXSM。本研究对猪背最长肌中可变剪接进行系统性的鉴定和分析,可变剪接可能以多种形式影响肌内脂肪沉积。对剪接异构体生物学功能进行研究,为可变剪接调节肌内脂肪沉积的分子机制提供新的见解。鉴定到多个与肌内脂肪沉积相关的候选剪接异构体.这些结果在经过进一步验证后可作为分子标记用于猪肌内脂肪含量的培育和改良。

关键词：可变剪接猪肌内脂肪纳米孔测序 illumina

发酵饲料对南美白对虾消化酶活性与肠道菌群的影响

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饲料工业 2018年第24期39卷 24-28页

作者：袁春营孟阳毕建才崔青曼天津市海洋环境保护与修复技术工程中心天津市海洋资源与化学重点实验室天津科技大学海洋与环境学院天津300457

产朊假丝酵母、植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌与对虾饲料混合均匀,密封发酵24 h制成发酵饲料。投喂南美白对虾,6周后,测定对虾体长和体质量,计算特定生长率;测定对虾胃、肝胰腺和肠道组织的胃蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性;基于Illumi... 详细信息

产朊假丝酵母、植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌与对虾饲料混合均匀,密封发酵24 h制成发酵饲料。投喂南美白对虾,6周后,测定对虾体长和体质量,计算特定生长率;测定对虾胃、肝胰腺和肠道组织的胃蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性;基于illumina HiSeq250测序平台,分析南美白对虾的肠道菌群。结果表明:发酵饲料能够提高对虾的特定生长率,但未达显著水平(P>0.05);发酵饲料能够不同程度地提高南美白对虾胃、肝胰腺和肠道中的4种消化酶活性;发酵饲料组对虾肠道中的软壁菌门(Tenericutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacte-ria)相对丰度明显增多,变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和疣微菌门(Verrucomicro-bia)相对丰度明显减少,芽孢杆菌纲相对丰度增加,植物乳杆菌由0.001%增加到0.01%。发酵饲料能够明显提高南美白对虾肠道菌群的香浓-威纳指数、辛普森指数、chao1指数、ACE指数、测序深度指数及谱系多样性指数。综上,发酵饲料能够提高南美白对虾肠道菌群的多样性指数,提高植物乳杆菌的相对丰度,从而改善南美白对虾的肠道菌群组成。

关键词：发酵饲料南美白对虾消化酶活性 illumina HiSeq测序菌群组成

基于高通量测序技术的转基因玉米GM11019分子特征研究

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基于高通量测序技术的转基因玉米GM11019分子特征研究

作者：张冠天津商业大学

学位级别：硕士

转基因农作物的分子特征研究主要包括外源DNA(T-DNA)整合位点、侧翼序列分析、嵌入序列完整性、拷贝数以及载体骨架序列是否残留等内容。准确的分子特征信息在转基因农作物安全评价、监管、追溯和标识等方面发挥着十分重要的作用。本研... 详细信息

转基因农作物的分子特征研究主要包括外源DNA(T-DNA)整合位点、侧翼序列分析、嵌入序列完整性、拷贝数以及载体骨架序列是否残留等内容。准确的分子特征信息在转基因农作物安全评价、监管、追溯和标识等方面发挥着十分重要的作用。本研究以转基因玉米GM11019为材料,利用illumina二代测序与Pac Bio三代测序平台分别进行基因组重测序,基于自搭建的转基因农作物分子特征生物信息学数据分析流程,获得了该转化体材料完整详细的分子特征信息,并通过了试验验证。主要研究内容与结果如下:1、获得了转基因玉米GM11019的分子特征信息。提取转基因玉米GM11019基因组DNA,分别构建illumina与Pac Bio文库并进行全基因组重测序,结合载体序列、玉米基因组、以及转基因外源片段数据库等信息,利用自搭建的生物信息学数据分析流程成功鉴定了该转化体的分子特征信息。结果显示,外源DNA片段与受体基因组整合的过程中,正向插入受体基因组2号染色体162,402,905 bp～162,402,952 bp处,插入拷贝数为单拷贝,该转化事件造成了玉米基因组49 bp的缺失,预期整合序列的LB端缺失了719 bp,RB端缺失了79 bp,同时发现了5,281 bp的非预期插入片段,后证实为载体骨架序列残留。2、建立了基于高通量测序技术与试验验证结合的转基因农作物分子特征鉴定技术体系。以GM11019转化事件为例,搭建了适用于illumina二代测序与Pac Bio三代测序数据的生物信息学数据分析流程,Sanger测序验证了该转化体材料的插入位点与侧翼序列,Long-PCR目的产物进行illumina测序验证了外源插入全长序列的完整性及其序列变异情况。该技术体系为解析外源插入序列背景信息不全面、大片段的缺失或插入的复杂转化体的分子特征提供了全新、可靠的鉴定方法。3、对比分析了二代与三代测序技术在转基因农作物分子特征鉴定过程中的优缺点。illumina二代测序读长较短、覆盖度不均一、数据分析流程复杂,很难获得全部的分子特征信息。Pac Bio三代测序技术虽然碱基错误率较高,但凭借其Reads读长长、通量高、覆盖度均一、数据分析简单的优势,在载体骨架序列未知的情况下可一步精准鉴定出外源插入序列的整合位点,说明Pac Bio测序技术在解析大片段缺失和插入,尤其是复杂的T-DNA插入情况时具备技术优势。综上所述,本论文的研究结果表明,与传统转基因农作物分子特征的鉴定方法相比,高通量测序技术的应用可实现快速、精准、高效地鉴定全部外源DNA片段插入位点与拷贝数信息,为转基因分子特征鉴定提供了全新的技术手段,同时为我国农业转基因技术的良性健康发展提供了技术支撑。

关键词：高通量测序技术转基因玉米分子特征 illumina PacBio

青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)基因的克隆及其在鳗弧菌胁迫下的表达分析

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内蒙古大学学报（自然科学版） 2017年第5期48卷 526-530页

作者：王玉梅潘宝平丁丹侯梓园姚玥彤石雅峰闫春财天津师范大学生命科学学院天津市动植物抗性重点实验室天津300387

采用illumina MiSeq二代测序方法筛选得到青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/p38)基因相似序列,进一步克隆得到全长cDNA.利用荧光定量PCR技术检测该基因在青蛤各组织中以及在鳗弧菌胁迫下的组织表达特征.结果显示,该基因全长共1781bp,开放阅... 详细信息

采用illumina MiSeq二代测序方法筛选得到青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/p38)基因相似序列,进一步克隆得到全长cDNA.利用荧光定量PCR技术检测该基因在青蛤各组织中以及在鳗弧菌胁迫下的组织表达特征.结果显示,该基因全长共1781bp,开放阅读框长度为1104bp,编码367个氨基酸.在正常条件下该基因在青蛤体各组织中都表达,其中血淋巴中表达量最高,肝脏次之,鳃中最少.经菌液侵染后12h青蛤血淋巴中表达量即达到峰值,随后表达量逐渐降为正常水平.

关键词：青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/p38) illumina MiSeq测序荧光定量PCR

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德州驴盲肠菌群测序分析

动物医学进展 2019年第4期40卷 64-68页

作者：刘宇江波涛史同瑞尹珺伊陈楠楠王岩秦平伟徐伟生杨文忠黑龙江省兽医科学研究所黑龙江齐齐哈尔161006 黑龙江省三头驴农业科技有限公司黑龙江齐齐哈尔161006

旨在研究健康德州驴盲肠菌群分布及代谢功能。以健康德州驴盲肠内容物为检测样品,提取细菌总DNA,通过illumina MiSeq高通量测序分析德州驴盲肠中菌群分布特点,结合PICRUSt基因预测方法分析菌群代谢功能。测序分析结果表明,在3份检测样... 详细信息

旨在研究健康德州驴盲肠菌群分布及代谢功能。以健康德州驴盲肠内容物为检测样品,提取细菌总DNA,通过illumina MiSeq高通量测序分析德州驴盲肠中菌群分布特点,结合PICRUSt基因预测方法分析菌群代谢功能。测序分析结果表明,在3份检测样品中共得到176 869条有效序列和39 566个OTU。Alpha多样性指数分析结果表明,3份样品的Shannon指数均大于7,样品中菌群多样性水平较高。菌群分类学组成分析结果表明,在门分类水平上相对丰度排名前10的细菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门、螺旋体门、纤维杆菌门、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门、TM7菌门、柔膜菌门、蓝藻菌门。此外,在相对丰度排名前20的菌属中与纤维分解与代谢相关的菌属所占比例达到了35%。菌群代谢功能分析结果表明,盲肠菌群参与机体多种代谢活动,其中参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢的菌群丰度相对较高。研究结果为探索德州驴肠道菌群分布与消化特点之间关系提供了理论依据。

关键词： illumina MiSeq高通量测序德州驴盲肠菌群多样性

大黄鱼（Larimichthys crocea）肠道菌群结构及其与宿主经济性状间的关系

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大黄鱼（Larimichthys crocea）肠道菌群结构及其与宿主经济性状...

作者：魏娜集美大学

学位级别：硕士

大黄鱼主要分布在东亚沿海地区,是中国的一种重要的肉食性海水鱼类,拥有最大的海水网箱养殖量。近年来,随着大黄鱼海水养殖产业的迅速发展,产生了一系列的问题,这些问题与大黄鱼生物学性状相关,例如,生长速度放缓、性早熟、疾病爆发和... 详细信息

大黄鱼主要分布在东亚沿海地区,是中国的一种重要的肉食性海水鱼类,拥有最大的海水网箱养殖量。近年来,随着大黄鱼海水养殖产业的迅速发展,产生了一系列的问题,这些问题与大黄鱼生物学性状相关,例如,生长速度放缓、性早熟、疾病爆发和肉质下降等,这给养殖户造成了重大的经济损失。肠道微生物被认为是宿主“遗忘的器官”,这些微生物与宿主的生长、发育、生理和病理相关。许多研究报道了各种鱼类肠道微生物,但是,有关大黄鱼肠道微生物的报道很少,并且这些肠道微生物与大黄鱼经济性状间的关系也还不清楚,先前有的一些报道也只是利用了传统分离培养和基于16S rRNA基因的分子生物学研究。开展对形态、性别存在差异的宿主肠道菌群的研究,有助于了解这些差异跟肠道菌群之间的关系,在大黄鱼种质改良、开发益生微生态制剂及促进大黄鱼养殖产业健康发展方面具有重要意义。本研究利用PCR-DGGE和illumina高通量测序技术研究大黄鱼肠道菌群结构及其与宿主经济性状间的关系,研究结果如下:1.不同体重、不同性别的大黄鱼肠道菌群PCR-DGGE和illumina测序分析(1)在不同体重、性别的大黄鱼肠道中均检测到变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和软壁菌门。另外,利用illumina方法还检测到放线菌门、浮霉菌门和硝化螺旋菌门。(2)大黄鱼肠道菌群结构与宿主体重、性别相关。在门的水平上,变形菌门是大黄鱼肠道共生优势菌门,浮霉菌门和硝化螺旋菌门仅存在于大的雄鱼中。在属的水平上,大、中、小鱼肠道菌群在属的水平差异较大,同体重规格的雌、雄间肠道菌群也存在差异。大的雌性鱼肠道群落结构与其他组差异较大,中的雄性鱼肠道群落结构与其他组也表现了较大差异,小的雌雄间差异不大。DGGE的结果表明:水栖菌属和一些鞘脂单胞菌属和未培养的细菌克隆子是大鱼肠道的优势菌群,而小鱼的是一种未培养的细菌,中鱼优势菌属则包括支原体菌属、不动杆菌属和某些未培养的细菌等。不同性别鱼间也有差别,其中,铜绿假单胞菌和未培养的细菌是大的雌鱼的优势菌属,在小的雄鱼中也有检测到很多铜绿假单胞菌,短黄杆菌和香味菌属是小的雌鱼的优势菌属,在大的雄鱼中也有检测到很多。而用illumina测序方法得到的结果有所不同:寡养单胞菌属和贪铜菌属是大的雌性鱼中的优势菌属,未分类的丛单胞菌科细菌细菌是大的雄鱼和小鱼共有的优势细菌属。2.健康和患病的大黄鱼肠道菌群的PCR-DGGE和illumina测序分析(1)变形菌门、梭菌门和厚壁菌门是健康和患病大黄鱼肠道优势菌门,拟杆菌门在健康鱼组中明显减少,另外利用illumina方法还检测到了浮霉菌门和软壁菌门。DGGE结果表明某些未知菌属的未培养细菌、鲸杆菌属、乳酸乳球菌属细菌是健康和患病大黄鱼肠道共有的优势菌群。(2)DGGE和illumina两种方法得到的健康大黄鱼肠道菌群多样性均大于患病鱼组,但差异均未达显著水平。DGGE结果表明:一些潜在益生菌,如乳酸乳球菌属和鲸杆菌属,在健康大黄鱼肠道中较丰富,而在患病鱼肠道中较少;相反,一些潜在致病菌,如木糖氧化无色杆菌和罗尔斯通菌等在发病鱼肠道中特异存在,在健康鱼中未检测到。另外,健康大黄鱼肠道中也检测到一些条件致病菌,如发光杆菌、弧菌等。illumina结果中,弧菌属是健康鱼最优势菌属,而在患病鱼中则明显减少。Limnobacter(伯克氏菌科的一种属)是患病鱼的最优势菌属,而健康鱼中明显减少。乳酸菌科、弧菌属和莫拉克斯氏菌属是两组鱼肠道的差异显著的细菌类群。

关键词：大黄鱼肠道微生物 PCR-DGGE illumina 体重性别健康患病