检索结果-南通市图书馆

作者：高海霞山东大学

学位级别：硕士

松江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)隶属于鲉形目(Scorpaeniformes),杜父鱼科(Cottidae),松江鲈属(Trachidermus),为国家二级保护动物,中国四大名鱼之一。历史上松江鲈分布区较广,是我国渤海、黄海、东海沿岸及相邻淡水水域的习见... 详细信息

松江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)隶属于鲉形目(Scorpaeniformes),杜父鱼科(Cottidae),松江鲈属(Trachidermus),为国家二级保护动物,中国四大名鱼之一。历史上松江鲈分布区较广,是我国渤海、黄海、东海沿岸及相邻淡水水域的习见鱼类。现在由于水利建设的发展,环境污染的影响以及人为捕捞因素,松江鲈赖以生存和繁衍的生态环境遭到严重的破坏。目前,松江鲈在我国许多水域已绝迹,亟待拯救。对此,我国首家松江鲈自然保护区已在山东省文登市埠口正式成立。原地保护外,对松江鲈进行人工驯养与繁殖也极其重要。因此,开展对松江鲈环境适应性、抗病性、病原及环境胁迫下的免疫学研究,将具有重要的理论和实际应用价值。目前,热应激蛋白以其独特的生物学特性和功能在生命科学领域受到较多关注。同时,热应激蛋白的诱导合成与海洋生物的抗病、耐盐和耐热性的获得以及各种环境胁迫下(高渗透压等)热应激蛋白的变化等也成为海洋生物学研究的大热点。鉴于热应激蛋白在生物体免疫、抗病、环境适应等方面的重要性,本文选取三种热应激蛋白(hsc70、GRP94、HS6B)及一种相关蛋白(HSBP1)对松江鲈进行免疫相关的基础研究。本文采用RACE-SMART技术克隆得到了四种蛋白的cDNA全长,并成功构建了其原核表达载体,获得了重组表达蛋白。主要结果如下：获得HSBP1cDNA序列全长1821bp,其中开放阅读框234bp,编码78个氨基酸。氨基酸同源比对表明,松江鲈与其他已知部分鱼类的同源性为82.28%-98.70%,与两栖类、鸟类以及哺乳类的同源性为75.32%-79.22%。成功构建了HSBP1的pET-30a(+)重组质粒,并转化Rosseta表达菌株,在37℃下,IPTG诱导4h后获得比预期稍大的20KD左右重组蛋白,重组蛋白为可溶蛋白。由High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱进一步纯化。得到hsc70的cDNA序列全长2138bp,开放阅读框1947bp,编码629个氨基酸。序列中发现了HSP70家族的三个标签序列,且C-末端具有细胞质HSP70的基序(EEVD)。氨基酸同源比对显示hsc70在各物种间的同源性非常高,保守性非常好。其中,松江鲈与其他已知部分鱼类的同源性为88.89%-97.09%,与两栖类,爬行类、鸟类以及哺乳类的同源性为85.36%-93.98%。成功构建了hsc70的pET-30a(+)重组质粒,并转化BL21 (DE3)表达菌株,在37℃下,IPTG诱导4h后,获得高表达量的76.4KD目的蛋白。经检测目的蛋白以包涵体形式存在。而25℃过夜诱导后部分目的蛋白为可溶蛋白。重组表达的粗蛋白经High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱得到进一步纯化。获得GRP94的cDNA序列全长2736bp,开放阅读框2418bp,编码806个氨基酸。序列分析发现HSP90家族标签序列的5个氨基酸保守区域,C-末端内质网滞留信号KDEL,在松江鲈中都存在氨基酸变异。前22个氨基酸为信号肽;成熟蛋白包含一个HATPase结构域。同源性比对发现,松江鲈与已知其他部分鱼类的同源性在83.58%-89.95%之间,与两栖类、鸟类和哺乳类的同源性在77.87%-81.09%之间,氨基酸序列在各物种间较保守。进化分析显示鱼类的GRP94在系统发育树上单独成一支。GRP94的原核表达载体(pET-30a(+))被成功构建,在37℃下,IPTG诱导4h后,在BL21(DE3)表达菌株中有较低表达量的98.2KD目的蛋白被表达。改变诱导温度、时间以及IPTG浓度后,其目的蛋白的表达量均未得到提高。获得HS6B的cDNA序列全长1127bp,开放阅读框为522bp,编码174个氨基酸。成熟蛋白包括一个独立的RHOD结构域。氨基酸同源性比对结果显示,HS6B比其他热应激蛋白在各物种间的同源性要低、保守性要差。构建了HS6B的RHOD结构域pET-30a(+)重组质粒,转化BL21 (DE3)表达菌株,在37。C,IPTG诱导4h下目的蛋白表达量较低：而在25℃下过夜诱导,获得高表达量的18.4KD目的蛋白。超声破碎后,经SDS-PAGE电泳检测发现,37℃诱导4h后表达的蛋白为不可溶的包涵体;而25℃过夜诱导后表达的目的蛋白大部分为可溶性蛋白。粗蛋白经High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱纯化得到纯化蛋白。本研究可为高效的松江鲈人工驯养及繁殖提供科学理论依据,为鱼类的疾病防治提供新的思路,也为鱼类热应激蛋白的研究提供基础资料。

关键词：松江鲈热应激蛋白 HSBP1 hsc70 GRP94 HS6B

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IMB-DM122抗HCV药效学研究

IMB-DM122抗HCV药效学研究

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作者：姜晨晨北京协和医学院

学位级别：硕士

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染引起的一种重大传染性疾病,呈全球性流行,导致严重的发病率和致死率。鉴于现有的标准治疗方案(聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)与利巴韦林(RBV)联合治疗)的总体疗效有限,并且尚无针对丙... 详细信息

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染引起的一种重大传染性疾病,呈全球性流行,导致严重的发病率和致死率。鉴于现有的标准治疗方案(聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)与利巴韦林(RBV)联合治疗)的总体疗效有限,并且尚无针对丙型肝炎的预防疫苗,因此研发新型的抗HCV药物迫在眉睫。近年来,随着直接作用于病毒蛋白的抗病毒药物(direct-acting antiviral agents, DAAs)逐渐在临床上的应用,为治愈丙型肝炎带来了希望,但是DAAs长期使用易诱发产生病毒耐药。为克服这一问题,科学家们将研发重点转向联合用药,和开发以宿主细胞蛋白为靶点的抗病毒药物。我们研究团队实验研究发现化合物IMB-DM122是一个以宿主细胞蛋白为靶点的新型的抗HCV候选化合物,毒性低。其抗HCV的作用是通过作用于hsc70 mRNA的3'UTR反应元件降低其稳定性,下调胞内hsc70蛋白的表达,从而减少病毒包装至病毒颗粒内hsc70蛋白水平,降低子代病毒的感染力,最终起到抗HCV复制的作用。但IMB-DM122作用效果和作用特点仍有待深入分析,这也是本论文的研究内容。本论文第一部分优化了蛋白免疫印迹(Western Blot, WB)半定量分析方法,在此基础上,论文第二部分进一步探讨了MB-DM122抗HCV的药效学作用及其优点。本论文首先提取了HCV感染的Huh7.5细胞内总蛋白,经定量后,以HCV编码的核心蛋白(Core)为目的蛋白,以管家基因编码的蛋白Tubulin或Gapdh为内参对照,分析蛋白上样量、抗体浓度及孵育时间、发光液浓度等可变因素对WB半定量分析结果的影响。结果显示,WB半定量结果中目的蛋白相对强度与蛋白总上样量之间只在一定上样量范围内有线性关系,超出线性范围会导致相对蛋白强度变化幅度减少,甚至无变化;上样体积、内参的选择不影响实验结果;在条带质量较好的前提下,一抗浓度及其孵育时间和发光液浓度也不改变实验结果;但是半定量有一定的缺陷,实验结果存在一定的误差,应在15%以内。因此,影响WB半定量结果的主要因素仍为目的蛋白的上样量;在能获得条带质量较好的前提下,改变上样体积和抗体孵育时间、适当稀释抗体和发光液浓度有利于实验进展而不影响实验结果。在分析了WB半定量结果影响因素之后,本论文进一步探讨了IMB-DM122在细胞培养内抗HCV作用效果及其特点。结果显示,IMB-DM122不仅在急性感染的细胞培养内具有抗HCV活性,在长期感染的Huh7.5细胞培养内也具有抗HCV活性,且存在一定的剂量依赖性以及时效性;随后,通过联合给药的实验探究发现,IMB-DM122联合IFN或VX-950能增强抗HCV的活性,相比于单独给药组,联合给药处理的细胞,具有更为显著的抗HCV的效果。紧接着,本论文分析了IMB-DM122对耐药HCV的杭病毒活性。诵讨阳性药物Simenervir和Sofoshuvir处理HCV感染的Huh7.5细胞,使其产生耐药,获得耐药病毒株,分析IMB-DM122对耐药株的抗病毒活性。结果显示,IMB-DM122对耐药病毒株也显示了同样的抗病毒活性。最后,本论文探究了IMB-DM122对其作用靶点家族的特异性。实验结果显示,IMB-DM122的抗HCV作用主要是通过降低hsc70这一特异性靶点发挥作用的,而对HSP70家族中的其它成员HSP70、GRP75和GRP78作用不明显,对其它热休克蛋白如HSP90、HSP60的作用也不明显,说明IMB-DM122的作用靶点具有特异性。本论文结论及其意义：IMB-DM122不仅在急性感染的细胞培养内具有抗HCV活性,在长期感染的Huh7.5细胞培养内也同样具有抗HCV的活性,并可与IFN或VX-950联合用药以增强抗HCV的活性,对DAAs耐药病毒株也显示了同样的抗病毒活性,其抗病毒作用具有靶点特异性,对其它热休克家族成员的抑制作用不明显。论文结果为寻找宿主细胞内的抗病毒靶点提供了科学依据,也为发现新的抗病毒药物提供了重要模式。

关键词：丙型肝炎病毒蛋白免疫印迹 IMB-DM122 联合用药耐药 hsc70

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Hsa-miR-365a对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用及其机制

Hsa-miR-365a对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用及其机制

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作者：唐琳南昌大学

学位级别：硕士

立项依据： MicroRNA (miRNA)通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’UTR)特异性结合诱导靶基因mRNA的降解或阻遏其翻译。c-Myc作为一种重要的癌症相关转录因子在调节细胞生长、分化、恶性转化和凋亡等过程中起重要作用。近期的研究表明,c-... 详细信息

立项依据： MicroRNA (miRNA)通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’UTR)特异性结合诱导靶基因mRNA的降解或阻遏其翻译。c-Myc作为一种重要的癌症相关转录因子在调节细胞生长、分化、恶性转化和凋亡等过程中起重要作用。近期的研究表明,c-Myc也可通过调节miRNA的表达而参与肿瘤的发生发展过程。我们利用生物信息学方法从已知的实验数据中,预测到大量niRNA受c-Myc调控,其中受c-Myc直接调控的110个miRNA位于基因的内含子和107个miRNA位于基因之间。根据我们设定的筛选条件如niRNA表达水平较高(reads数大于4)、具有c-Myc的结合位点(motif>0)、TSS即E-box与niRNA结合位点距离较近(5kb以内)以及FDR值即转录因子对基因的调控强度较大(小于0.05)等,共选出5个位于基因内的miRNA和16个位于基因间的miRNA。最后经过Q-PCR验证以及miRNA的可能作用靶点分析,确定has-miR-365a作为实验对象,并系统探讨其对乳腺癌细胞MCF-7生长的作用及其分子机制。实验结果： 1. c-Myc特异性siRNA可明显抑制乳腺癌细胞MCF-7的c-Myc表达,其抑制mRNA表达的强度达80%以上,对蛋白也有明显的抑制作用。血清依赖性细胞生长实验和饱和密度实验结果都表明,c-Myc特异性siRNA介导的c-Myc表达抑制可使MCF-7]增殖明显减缓。同时,实验结果还显示,抑制MCF-7的c-Myc表达可显著升高细胞内has-miR-365a水平。 2.我们在血清依赖性细胞生长和饱和密度实验,以及活细胞检测等观测到,Has-miR-365a模拟物(mimic)可明显抑制MCF-7的恶性增殖,而其抑制剂(inhibitor)则可几乎完全取消has-miR-365a的作用。 3. Has-miR-365a模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)可分别显著抑制和取消has-mir-365a的靶基因HSPA8(编码蛋白是hsc70)的表达,luciferase报告基因实验也证明,has-mir-365a(模拟物)可特异性地作用于HSPA8的3’UTR区域,进而抑制靶基因的翻译。讨论与结论： c-Myc通过miRNA调节途径而参与肿瘤的发生发展过程已引起人们的高度关注。HSPA8是热休克蛋白70(HSP70)家族一员,编码73kDa的热休克同源蛋白hsc70,后者在促进蛋白折叠及维持其正常的结构和功能中都扮演着重要的角色。以往的工作表明,hsc70无论是正常状态或是应激状态下对维持蛋白的动态平衡——如转运、组装、降解等过程中起关键作用。我们的实验结果表明,c-Myc调控的has-mir-365a对乳腺癌细胞MCF-7的生长具有重要的调节作用。同时我们的结果还证明,has-mir-365a对MCF-7细胞的抑制作用是通过调节其靶基因HSPA8(hsc70)而实现的。因此,我们得出结论:c-Myc调控的has-mir-365a-hsc70途径在乳腺癌的发生发展过程中起重要作用。

关键词： c-Myc miR-365a-3p MCF-7 hsc70

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甲基转移酶METTL21C调控鸡骨骼肌生长发育机制研究

甲基转移酶METTL21C调控鸡骨骼肌生长发育机制研究

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作者：李蕊清陕西理工大学

学位级别：硕士

甲基转移酶样21(Methyltransferase like 21,METTL21)是甲基转移酶超家族的一类远亲成员,包括METTL21A、METTL21B、METTL21C和METTL21D四个成员。其中METTL21C在动物机体各个组织中均表达,尤其是骨骼肌组织中特异性高表达。研究发现,MET... 详细信息

甲基转移酶样21(Methyltransferase like 21,METTL21)是甲基转移酶超家族的一类远亲成员,包括METTL21A、METTL21B、METTL21C和METTL21D四个成员。其中METTL21C在动物机体各个组织中均表达,尤其是骨骼肌组织中特异性高表达。研究发现,METTL21C能够促进小鼠C2C12细胞的成肌分化,抑制肌肉萎缩,但其在家禽骨骼肌中的功能研究相对较少。因此,本论文旨在探究METTL21C影响禽类骨骼肌生长发育机制,为改善家禽肌肉品质、提高生产性能提供参考价值,也为运动科学、肌肉疾病及代谢稳态等医学问题奠定理论基础。本研究以略阳乌鸡为研究对象,采用酶消化法分离鸡原代骨骼肌卫星细胞,并以此为细胞模型,探究METTL21C对成肌分化的影响;通过液相色谱质谱检测和免疫共沉淀技术鉴定METTL21C的互作蛋白,验证METTL21C与hsc70结合在成肌分化过程中的作用,最终系统阐述METTL21C影响家禽骨骼肌生长发育的分子机理。本研究主要获得实验结果如下:1.分析略阳乌鸡腿肌组织转录组测序数据,结合文献查阅,发现甲基转移酶METTL21C基因可能影响禽类骨骼肌的生长发育;进一步检测METTL21C基因表达规律,结果显示METTL21C在略阳乌鸡各个组织中均表达,其中心肌中表达量最高,其次是骨骼肌;随着动物日龄增长,METTL21C在骨骼肌组织中的表达呈升高趋势。2.采用酶消化法分离鸡原代骨骼肌卫星细胞,检测肌卫星细胞标志基因Pax7和MyoG的表达水平,最终确认分离获得鸡原代骨骼肌卫星细胞,为后续实验提供细胞模型。3.成功构建METTL21C超表达载体,将其转染至鸡骨骼肌卫星细胞中,结果发现肌肉发育相关基因的表达水平随之升高,表明METTL21C具有促进家禽骨骼肌生长发育的作用。4.基于LC-MS/MS质谱检测技术鉴定METTL21C的互作蛋白,筛选hsc70为研究对象,采用Co-IP技术验证METTL21C和hsc70存在互作效应。进一步探究METTL21C和hsc70互作对肌肉发育的影响,发现单独超表达hsc70,肌肉发育相关基因表达降低,表明其具有抑制成肌分化的能力,但METTL21C和hsc70结合减弱了hsc70抑制成肌分化的作用。5.构建hsc70基因的K561位点突变载体,通过Co-IP技术验证突变后METTL21C与hsc70之间的互作关系。结果显示K561位点突变后,METTL21C与hsc70没有结合,说明K561为METTL21C与hsc70的结合位点,由此表明,METTL21C通过与hsc70的K561位点结合参与调控家禽骨骼肌生长发育过程。

关键词： METTL21C基因骨骼肌发育肌肉分化蛋白互作 hsc70

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Hsp90抑制剂17-DMAG通过自噬-溶酶体途径诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的机制研究

Hsp90抑制剂17-DMAG通过自噬-溶酶体途径诱导急性淋巴细胞白血病...

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作者：马秀娟中国医科大学

学位级别：硕士

目的:急性B淋巴细胞白血病(B acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)是儿童最常见的血液恶性肿瘤。目前的治疗方式以传统化疗为主,但由于化疗药物具有严重的毒副反应以及化疗耐药的出现,靶向治疗现已经成为B-ALL治疗的研究热点。在我们对... 详细信息

目的:急性B淋巴细胞白血病(B acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)是儿童最常见的血液恶性肿瘤。目前的治疗方式以传统化疗为主,但由于化疗药物具有严重的毒副反应以及化疗耐药的出现,靶向治疗现已经成为B-ALL治疗的研究热点。在我们对B-ALL患儿差异蛋白组学的前期研究中,发现高危组患儿中热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)的表达明显高于低危组,有研究报道Hsp90在急性白血病中的高度表达与病情进展及预后密切相关。Hsp90抑制剂因其对肿瘤细胞具有高度的选择特异性而成为肿瘤治疗的研究热点。17-DMAG(Alvespimycin)为一种亲溶酶体的Hsp90抑制剂,在成人晚期实体瘤、淋巴瘤、急性髓细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病中已经进入临床I期试验,但在B-ALL的治疗研究中少有报道,其作用机理也尚不明确,故而我们选用17-DMAG作为B-ALL治疗的候选药物进行研究。随着对白血病发病机制的深入研究,调节自噬-溶酶体降解途径的进程成为当前白血病治疗研究的一个突破点。在本论文的研究中,我们选用Hsp90抑制剂17-DMAG,探讨其对B-ALL细胞增殖与凋亡的影响,并初步探讨17-DMAG通过调节自噬-溶酶体降解系统诱导细胞凋亡的潜在机制。研究方法:1、细胞增殖检测(MTS):B-ALL体外细胞株Nalm6和Reh在不同浓度的17-DMAG(0.01,0.1,1,10,100μM)处理24h、48h、72h后,采用MTS法检测细胞的增殖情况。2、细胞凋亡检测:不同浓度的17-DMAG(1μM、10μM)处理白血病细胞后,应用流式细胞术分析细胞的凋亡情况(Annexin V-FITC/PI双染法)。3、自噬水平检测:B-ALL细胞株Nalm6和Reh经17-DMAG(1μM)处理后,检测细胞巨自噬水平及分子伴侣介导的自噬(CMA)水平。蛋白免疫印迹法检测巨自噬标志物LC3B II及P62的表达量变化,同时检测分子伴侣介导自噬的伴侣分子hsc70与受体Lamp2a的表达水平。活细胞自噬体染色检测细胞自噬体的数量。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析hsc70及Lamp2a的mRNA表达水平。4、溶酶体数量及功能检测:17-DMAG(1μM)处理B-ALL Nalm6和Reh细胞(2h、12h、24h)后进行溶酶体染色(Lyso-Brite),荧光显微镜下观察17-DMAG对细胞溶酶体数量的影响。蛋白免疫印迹法检测17-DMAG处理细胞后溶酶体内酸性水解酶cathepsin D的蛋白表达水平。5、细胞转染:在Nalm6与Reh细胞中,通过对siRNA敲减hsc70表达,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及共聚焦显微镜显像分析hsc70与溶酶体酸性水解酶cathepsin D基因和蛋白的表达量变化。蛋白免疫印迹法检测泛素-蛋白酶体降解进程阻断后,17-DMAG对细胞溶酶体酸性水解酶cathepsin D蛋白表达的影响。结果:1、17-DMAG抑制白血病细胞增殖:17-DMAG以时间剂量依赖性的方式抑制B-ALL细胞株Nalm6和Reh细胞的增殖。2、17-DMAG诱导白血病细胞凋亡:17-DMAG诱导Nalm6和Reh细胞凋亡,凋亡率与药物剂量呈正相关(Phsc70基因和蛋白表达上调并随处理时间的延长逐步增加,24h时达到表达高峰(Phsc70高表达,下调cathepsin D表达:在mRNA表达水平上,17-DMAG诱导的hsc70高表达同时下调了Nalm6细胞cathepsin D的表达(Phsc70敲减后及敲减后给予17-DMAG处理不改变cathepsin D表达;蛋白水平上,17-DMAG诱导hsc70高表达同时下调Nalm6(P<0.01)和Reh细胞(P<0.05)cathepsin D表达。应用蛋白免疫印迹法,我们检测到

关键词：急性B淋巴细胞白血病 17-DMAG 自噬-溶酶体途径 hsc70 cathepsin D

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菲啶类抗PEDV与SARS-CoV-2的活性化合物设计与作用机制研究

菲啶类抗PEDV与SARS-CoV-2的活性化合物设计与作用机制研究

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作者：王宜挺云南大学

学位级别：硕士

冠状病毒是一类含有巨大基因组的单股正链RNA病毒,容易发生变异,进化出了多种干扰素拮抗蛋白产生免疫逃逸,目前对冠状病毒的治疗手段有限。本课题组前期发现若干菲啶型分子能通过下调宿主hsc70的表达起到抗多种病毒的作用,这类分子是否... 详细信息

冠状病毒是一类含有巨大基因组的单股正链RNA病毒,容易发生变异,进化出了多种干扰素拮抗蛋白产生免疫逃逸,目前对冠状病毒的治疗手段有限。本课题组前期发现若干菲啶型分子能通过下调宿主hsc70的表达起到抗多种病毒的作用,这类分子是否也能作用于难以治疗的冠状病毒引发了研究兴趣。因此我们最初以一种典型的冠状病毒猪流行性腹泻病毒(PEDV)作为研究对象,探讨了这类分子的抗病毒作用,并展开了活性分子的结构修饰研究,以获得抗病毒活性更好的分子;课题进行时恰逢新型冠状病毒(SARS-CoV-2)爆发,基于对冠状病毒和菲啶类分子的研究基础,我们以SARS-CoV-2核衣壳蛋白(N蛋白)和主蛋白酶(Mpro)为靶点,利用计算机辅助药物设计手段展开了抗SARS-CoV-2的先导化合物发现研究。论文第一章阐述了基于调控宿主hsc70的作用机制,设计、合成PEDV抑制剂的研究,揭示了宿主hsc70作为抗病毒治疗的潜在价值,合成各种类型衍生物69个。从中发现了以化合物58为代表的一类4号位烷氧取代,8,和9号位连接杂环药效片段的菲啶酮分子,这类分子抗PEDV活性优良,同时也保留了下调宿主hsc70的新颖抗病毒机制。研究结果为抗PEDV的药物提供了新型活性先导化合物,基于该类化合物作用于宿主的特点,暗示了其有可能对更多冠状病毒进行防治。基于对菲啶类化合物和冠状病毒的研究基础,论文第二章阐述了基于靶蛋白,设计、合成SARS-CoV-2抑制剂的研究,以文献报道的冠状病毒N蛋白抑制剂PJ34作为模板,设计并合成了19个衍生物。接着测试了其与SARS-CoV-2 N蛋白的亲和力,其中化合物70的平衡解离常数K=7.8μM,相较于PJ34与SARS-CoV-2 N蛋白的解离常数K=696μM,活性提升了90倍;利用“药物重定位”思想,以Mpro作为靶点,对疫情爆发时已合成分子1-69进行了基于结构的虚拟筛选工作,获得对Mpro抑制活性良好的化合物41和67,其在10μM浓度下,抑制率分别达到85.6%和71.6%,研究结果为抗SARS-CoV-2药物发现提供了一些线索。论文第三章对目前发现的PEDV小分子抑制剂进行了总结,包括其结构特点和作用靶标,同时对PEDV抑制剂的研发进行了讨论与展望。

关键词：菲啶冠状病毒核衣壳 hsc70 主蛋白酶

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半滑舌鳎高温应答基因筛选及其对性别决定和分化的调控研究

半滑舌鳎高温应答基因筛选及其对性别决定和分化的调控研究

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作者：刘倩上海海洋大学

学位级别：硕士

鱼类性别决定分为遗传性别决定(Genetic Sex Determination,GSD)和环境性别决定(Environment Sex Determination,ESD),并且多种鱼类的遗传性别可被环境所影响,其中温度是最主要的环境因素之一。鱼类在环境温度变化时,可依赖温度敏感的... 详细信息

鱼类性别决定分为遗传性别决定(Genetic Sex Determination,GSD)和环境性别决定(Environment Sex Determination,ESD),并且多种鱼类的遗传性别可被环境所影响,其中温度是最主要的环境因素之一。鱼类在环境温度变化时,可依赖温度敏感的应答基因或蛋白将信号传递至体内,如热休克蛋白及其同源蛋白、真核翻译延伸因子等。但这些温度敏感的应答基因或蛋白响应外界高温并影响体内性别决定与分化的机制目前尚不明确。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国重要的名贵海水养殖鱼类,广泛分布于我国黄、渤海地区。半滑舌鳎是典型的雌性偏好型性别二态性物种,雌性个体的生长发育速度比雄性个体快2-4倍,且成熟雌鱼全长及体重也可达成熟雄鱼的数倍。半滑舌鳎的性染色体类型为ZW/ZZ型,是由GSD和ESD共同决定性别的鱼类,即它的原始性别可以被环境因素所重塑。在自然状态下,半滑舌鳎群体中约有14%的雌鱼会性逆转为ZW基因型的表型雄鱼,即伪雄鱼。若在半滑舌鳎性别决定的关键时期进行高温(28°C)处理,ZW基因型的伪雄鱼比例可上升到73%,并且这些伪雄鱼是可育的,它们的后代即使在自然条件下,也会有绝大多数发生性逆转现象。因此,半滑舌鳎是探究鱼类响应高温作用机制的理想模型。本研究主要以不同性别的半滑舌鳎为研究对象,分析短期高温热激处理对其的影响。开展了高温热激(HS,28°C)短期时序性(1 h,2 h,3 h,5 h)处理和正常温度(CT,22°C)处理下半滑舌鳎精巢和卵巢的转录组测序分析。共获得217 Gb Clean data,并有超过87.71%的Clean Reads能够很好的比对到半滑舌鳎的参考基因组上。主成分分析表明半滑舌鳎雌雄性腺之间存在显著差异,并且高温处理不同时间之间也有差异,在不同处理组之间分析得到大量的差异表达基因(DEG)。在同一种处理方式不同性别处理组之间,常温处理组、热激1 h、2h、3 h处理组在雌雄性腺之间均富集到的DEGs数量均超过了10000个,并且下调DEGs数量多于上调DEGs数量;热激处理5 h组较为特别,雌雄性腺之间仅有134个DEGs,其中104个DEGs上调,30个DEGs下调。在同一性别不同处理组之间,雌鱼中共有6531个DEGs,其中各处理组之间共有的DEGs为151个;雄鱼中共有6743个DEGs,其中各处理组之间共有的DEGs为488个。选取对同一性别不同处理组之间以及同一处理组中不同性别之间比较的差异基因进行功能分析,上调基因主要富集到了代谢途径、RNA转运、细胞凋亡、神经活性配体-受体相互作用、钙离子信号通路、细胞因子受体相互作用等。下调表达的基因主要富集到了神经活性配体-受体相互作用、MAPK信号通路、钙离子信号通路等。此外,还发现性腺中的热休克蛋白基因家族,翻译延伸因子相关基因等参与了响应高温热激的过程,并表现出性别特异性表达的特征。上述研究结果为我们提供了高温应答候选基因,为揭示鱼类响应外界温度变化进而影响自身性别决定与分化奠定了基础。本研究克隆获得了hsc70、hsc70-like和eef1a1三个基因的全长序列,并对它们的表达模式进行了分析。结果表明,hsc70在半滑舌鳎成鱼精巢中的表达量远高于在卵巢中的表达量,并且在除肌肉外的其他组织中广泛分布;hsc70-like仅在成鱼性腺中表达较高,并且在精巢中的表达量远远高于在卵巢中的表达量;eef1a1在成鱼性腺中也具有较高表达,在卵巢中的表达量远高于在精巢中的表达量,同时在肝中也具有较高的表达,而在其他组织中的表达水平较低。在半滑舌鳎性腺发育不同阶段,hsc70在1 mpf和12 mpf中表现出精巢显著高于卵巢的表达模式,在6 mpf表现出卵巢更高表达的模式;hsc70-like从6 mpf开始在精巢中的表达量显著高于卵巢;而eef1a1从6 mpf开始则表现出卵巢表达量显著高于精巢的表达模式。进一步在半滑舌鳎温度敏感的性别决定期进行长期高温处理和在性别决定期结束时进行短期热应激处理,hsc70、hsc70-like和eef1a1基因在半滑舌鳎雌雄性腺中的表达水平表现出不同趋势。此外,双荧光素酶报告实验也证明了以上基因可在1 h内快速响应高温。在半滑舌鳎精巢细胞中进行基因过表达实验,热激处理后性别相关基因sox9a和cyp19a1a发生显著的表达变化。这些结果均表明,hsc70、hsc70-like和eef1a1基因可快速响应外界高温并与性腺分化相关,是链接外界高温信号与体内性别决定的关键元件。研究结果为解析高温影响鱼类性别决定与分化的分子机制提供了理论基础。

关键词：半滑舌鳎高温性别决定与分化 hsc70 hsc70-like eef1a1

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缺氧环境下BaP对CMA的影响与HSP90相互关系的研究

缺氧环境下BaP对CMA的影响与HSP90相互关系的研究

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作者：林楠内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究拟在缺氧环境下,采用不同浓度的BaP处理A549细胞,探讨BaP对分子伴侣介导自噬(CMA)的作用是否与HSP90有关。方法:(1)采用CoCl构建细胞缺氧环境,qPCR法检测HIF-1α的mRNA表达,确定缺氧环境是否构建成功;(2)采用qPCR和Western b... 详细信息

目的:本研究拟在缺氧环境下,采用不同浓度的BaP处理A549细胞,探讨BaP对分子伴侣介导自噬(CMA)的作用是否与HSP90有关。方法:(1)采用CoCl构建细胞缺氧环境,qPCR法检测HIF-1α的mRNA表达,确定缺氧环境是否构建成功;(2)采用qPCR和Western bolt法检测缺氧环境对A549细胞中HIF-1α、HSP90、hsc70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达影响;(3)采用qPCR和Western bolt法检测不同浓度BaP对缺氧环境下A549细胞中HIF-1α、HSP90、hsc70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达影响;(4)采用qPCR和Western bolt法检测BaP对缺氧环境下给予HSP90抑制剂Geldanamycin(GA)和沉默HSP90α的A549细胞中HIF-1α、HSP90、hsc70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达情况;(5)采用碱性彗星实验、免疫荧光检测γ-H2AX焦点实验、qPCR和Western bolt法检测不同浓度BaP对A549细胞中DNA损伤与细胞内HSP90、hsc70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达的影响,进一步探讨DNA损伤与CMA的关系。结果:(1)与常氧组比较,A549细胞在不同时间缺氧后,HIF-1α的mRNA表达量均有一定程度的增加,以缺氧24h后HIF-1α的mRNA表达量最高,差异具有统计学意义(Phsc70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达量与常氧组相比均明显增加,差异具有统计学意义(Phsc70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达量均显著降低,与空白组比较差异具有统计学意义(Phsc70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达量的抑制作用,与BaP组相比差异具有统计学意义(Phsc70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达量均随着BaP浓度的增加而增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.缺氧可以促进A549细胞的CMA;2.在缺氧环境下,BaP对CMA有抑制作用;3.在缺氧环境下,HSP90抑制剂和沉默HSP90α的A549细胞可以增强BaP对CMA的抑制作用;4.在常氧环境下,BaP可以导致DNA损伤和CMA相关。

关键词： BaP HIF-1α HSP90 hsc70 LAMP-2A

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分子伴侣介导的自噬通过降解PARP1改善H2O2诱导的心肌细胞凋亡

分子伴侣介导的自噬通过降解PARP1改善H2O2诱导的心肌细胞凋亡

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作者：张丹丹南昌大学

学位级别：硕士

研究背景:磷酸腺苷核糖聚合酶1[Poly(ADP-Ribose)Polymerase 1,PARP1]是PRRP酶家族的典型代表,主要与DNA修复、基因的转录调控、炎症反应及氧化应激有关。研究发现,PARP1参与了多种心血管疾病的病理生理过程,如缺血再灌注损伤、心脏重... 详细信息

研究背景:磷酸腺苷核糖聚合酶1[Poly(ADP-Ribose)Polymerase 1,PARP1]是PRRP酶家族的典型代表,主要与DNA修复、基因的转录调控、炎症反应及氧化应激有关。研究发现,PARP1参与了多种心血管疾病的病理生理过程,如缺血再灌注损伤、心脏重构以及血管炎症等。但迄今为止,仅发现PARP1经泛素依赖性蛋白酶体途径降解,是否存在其他的降解途径尚不明确。近年来,研究人员发现分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)参与了包括心血管疾病在内的多种疾病的分子调控。分子伴侣hsc70(Heat shock protein 70)特异性识别带有“KFERQ”序列的底物蛋白,促进底物去折叠并与溶酶体相关膜蛋白2A(Lysosome-associated membrane protein 2A,LAMP2A)结合,继而进入溶酶体腔被降解。因此,CMA的抑制或过度激活都将引起细胞功能异常,最终导致疾病的发生。根据底物蛋白的特殊性,本团队首次发现PARP1具有“KFERQ”五肽序列。然而在心肌细胞中PARP1能否与hsc70相结合,以及与CMA之间是否存在调控关系尚不明确。研究目的:本研究试图揭示CMA是否可以调控PARP1的蛋白表达,并进一步阐明在HO诱导的心肌细胞损伤中CMA调控PARP1表达的具体分子机制。研究方法:本研究采用原代乳鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs)用于实验研究。1、明确CMA对PARP1表达的调控作用:(1)利用自噬激活剂平衡盐溶液(EBSS)自噬阻断剂氯喹(CQ)以及蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理NRCMs,使用Western Blot实验检测PARP1及其上下游蛋白的表达情况,明确PARP1是否经溶酶体降解。(2)通过Co-IP和免疫荧光共聚焦验证PARP1和hsc70是否存在相互作用。2、明确CMA调控PARP1的具体机制:(1)通过构建LAMP2A基因过表达和干扰腺病毒载体来激活或抑制CMA,通过Western Blot检测PARP1及其上下游蛋白PAR和AIF的蛋白表达。(2)Western Blot检测激活或抑制CMA后,再利用自噬激活剂EBSS和自噬阻断剂CQ进一步验证PARP1是否经CMA途径降解。3、探究氧化应激损伤状态下,CMA对PARP1的调控作用:(1)利用HO构建细胞氧化应激损伤模型,通过TUNEL实验检测细胞凋亡情况。(2)利用Western Blot检测细胞应激损伤程度与蛋白表达量之间的关系。(3)利用免疫荧光共聚焦实验探究HO刺激后PARP1和hsc70共定位的变化情况。研究结果:***1经溶酶体途径降解。NRCMs经使用自噬激活剂EBSS后,Western Blot结果显示PARP1蛋白表达水平逐渐降低,而经EBSS与自噬阻断剂CQ同时处理后,PARP1蛋白下降程度明显缓解。此外,NRCMs经线菌酮CHX抑制蛋白合成后,PARP1蛋白表达水平下降,而与CQ同时处理后,CQ也可显著缓解CHX导致的PARP1蛋白表达下降。***1与hsc70存在相互作用。采用免疫共沉淀与免疫荧光共聚焦验证PARP1与hsc70存在相互作用。PARP1基因的氨基酸序列符合“KFERQ”五肽基序特征,氨基酸序列位于353-357和670-674。***1在心肌细胞中经CMA途径降解。NRCMs经EBSS处理激活自噬后,Western Blot结果显示PARP1的上游蛋白PAR及下游蛋白AIF也呈下降趋势;利用巨自噬抑制剂3-MA和EBSS同时处理后,结果显示3-MA对PARP表达的影响不明显。此外,抑制CMA会导致PARP1及其上下游蛋白表达上升,且该趋势可以被自噬激活剂EBSS所逆转。反之,激活CMA导致PARP1及其上下游蛋白表达下降,并且该下降趋势可被自噬阻断剂CQ逆转。***可以通过抑制PARP1(cleaved)的蛋白表达来保护心肌细胞免受氧化应激所致的凋亡。4.1激活CMA可以抑制氧化应激导致的细胞凋亡TUNEL实验结果显示,HO刺激可导致细胞凋亡且呈浓度依赖性;激活CMA可有效抑制细胞凋亡。反之,抑制CMA则促进细胞凋亡。4.2激活CMA影响PARP1(cleaved)的蛋白表达Western Blot结果显示低浓度的HO可激活CMA,LAMP2A蛋白表达升高,PARP1(cleaved)的表达下降;而高浓度HO(>400?M)使CMA功能严重受损,导致细胞内的LAMP2A表达下降,而PARP1(cleaved)表达显著升高。此外,Western Blot结果显示激活CMA可以降低PARP1(full length)及PARP1(cleaved)的蛋白表达,并

关键词： PARP1 分子伴侣介导的自噬 hsc70 氧化应激

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类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞分子伴侣介导自噬增强与病情的相关性

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中华临床免疫和变态反应杂志 2022年第1期16卷 3-8页

作者：邵鑫蒋先虹王瑞刘福乐山市人民医院药学部四川乐山614000 乐山市人民医院胃肠外科四川乐山614000 乐山市人民医院风湿免疫科四川乐山614000 川北医学院附属医院药剂科四川南充637000

目的检测类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS)分子伴侣介导自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)水平,探究其与RA病情发生发展的关系。方法从手术室中收取8例RA患者膝关节滑膜组织,培养原代滑膜细胞;同期收取8例骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者膝关节滑膜组织,培养骨关节炎滑膜成纤维细胞(osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes,OA-FLS)作为对照。采用RT-qPCR检测RA-FLS与OA-FLS中CMA标志性因子hsc70、LAMP2A mRNA水平;Western blot法检测两组细胞中hsc70、LAMP2A蛋白水平。采用免疫荧光细胞化学染色检测RA-FLS中hsc70、LAMP2A蛋白及共定位表达。采用Pearson法分析hsc70、LAMP2A蛋白与RA患者临床指标DAS28、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)的相关性。结果RA-FLS组hsc70与LAMP2A mRNA(1.05±0.15和1.01±0.06)和蛋白水平(1.02±0.08和1.07±0.03)均明显高于OA-FLS(分别为0.51±0.10和0.63±0.08、0.78±0.06和0.61±0.08)对照组(Phsc70蛋白的红色荧光和代表LAMP2A蛋白的绿色荧光明显更强,红绿荧光融合后的黄色荧光斑点也显著高于对照组。Pearson相关性分析结果显示,hsc70蛋白水平与RA患者DAS28得分呈正相关(r=0.7756),LAMP2A蛋白水平与RA患者DAS28得分、ESR呈正相关(分别r=0.7507、r=0.7790)。结论RA患者hsc70、LAMP2A表达上调,CMA途径被激活,且与RA患者的病情活动度呈正相关。

关键词：类风湿关节炎分子伴侣介导自噬 hsc70 LAMP2A

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