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电针对帕金森病模型大鼠脑黑质内Lamp2a、hsc70、α-syn表达的影响

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中华中医药学刊 2018年第4期36卷 859-862,I0009页

作者：马骏余沛豪王述菊王中明王彦春王琪王彬湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心

目的：观察电针对鱼藤酮诱导的帕金森病（Parkinson’s disease,PD）模型大鼠脑黑质内Lamp2a、hsc70、α-syn表达的影响,探讨电针治疗帕金森病的可能作用机制。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针治疗组,每组15只... 详细信息

目的：观察电针对鱼藤酮诱导的帕金森病（Parkinson’s disease,PD）模型大鼠脑黑质内Lamp2a、hsc70、α-syn表达的影响,探讨电针治疗帕金森病的可能作用机制。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针治疗组,每组15只。采取颈背部皮下注射鱼藤酮法制备帕金森病模型,假手术组只注射不含鱼藤酮的等量葵花油乳化液。正常组、假手术组、模型组不进行任何治疗;电针治疗组在造模完成后取穴＂风府＂、＂太冲＂,连续波,频率120次/min,每次治疗20 min,每天1次,疗程为28 d。免疫组化法检测模型大鼠黑质内TH、α-syn的阳性表达,并用Western blot法检测模型大鼠黑质内Lamp2a、hsc70、α-syn的表达。结果：模型组大鼠表现出明显的PD症候群特征,电针干预后模型大鼠行为学评分明显降低（P〈0.01）;免疫组化法及Westernblot检测显示电针治疗通过上调Lamp2A、hsc70水平能抑制错误折叠蛋白α-syn的表达,提高TH的阳性表达。结论：电针可以抑制具有细胞毒性作用的α-syn的集聚,保护多巴胺能神经元,抑制帕金森病的发展,其机制可能与干预分子伴侣介导的自噬有关。

关键词：帕金森病电针分子伴侣介导的自噬 Lamp2A hsc70 α-syn

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孔雀鱼hsc70基因的电子克隆与序列分析

淡水渔业 2011年第6期41卷 3-8页

作者：周向红彭永兴易乐飞淮海工学院海洋学院江苏连云港222005

为了研究热激同源蛋白70(70 kDa heat shock cognate,hsc70)在孔雀鱼(Poecilia reticulata Peters)对环境适应中的作用,采用电子克隆与传统实验克隆相结合的技术,分析了孔雀鱼的一个hsc70基因(命名为Prhsc70)。Prhsc70基因包含一个长194... 详细信息

为了研究热激同源蛋白70(70 kDa heat shock cognate,hsc70)在孔雀鱼(Poecilia reticulata Peters)对环境适应中的作用,采用电子克隆与传统实验克隆相结合的技术,分析了孔雀鱼的一个hsc70基因(命名为Prhsc70)。Prhsc70基因包含一个长1941 bp的完整编码区,含有8个内含子。Prhsc70蛋白具有HSP70蛋白家族的特征序列,且与其他动物hsc70和HSP70都高度相似。在进化树上Prhsc70与所有鱼类hsc70聚为一簇,与它们的氨基酸序列一致性为93.2%～98.9%。

关键词：孔雀鱼(Poecilia reticulata Peters) hsc70 电子克隆生物信息学

南方鲇hsc70 cDNA的克隆及序列分析

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上海水产大学学报 2007年第4期16卷 310-316页

作者：单红周国勤张其中南京市水产科学研究所江苏南京210036 西南大学生命科学学院

采用RT-PCR法和SMARTRACE(rapid amplification of cDNA ends)技术从南方鲇肝脏RNA克隆获得hsc70基因的全长cDNA(schsc70 cDNA)。此cDNA全长2384 bp,其中,5′非编码区194 bp,3′非编码区249bp,编码区域(coding sequence,CDS)长度为1941 bp。根据编码序列推导出相应的646个氨基酸,与其他脊椎动物hsc70序列进行同源性比较,发现南方鲇hsc70与欧洲银鲫(Carassius auratus gibelio)、鲦鱼(Pimephalespromelas)、人(Homo sapien)和鸡(Gallus gallus)的hsc70相似性分别为96.0%、95.5%、94.9%和93.8%,表现出较高的保守性。序列分析发现schsc70 cDNA编码的氨基酸序列中含有2个HSP70家族的特征模体并具有Dnak特征性基序(DLGTT-S-V)。南方鲇hsc70基因的克隆为进一步深入研究南方鲇抗逆机理以及指导南方鲇的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。

关键词：南方鲇 hsc70 序列对比基因结构

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泥鳅hsc70 cDNA克隆及表达分析

水产科学 2013年第5期32卷 273-279页

作者：陈建华张俊彬王怀民张晓君阎斌伦淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室江苏连云港222005 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

采用RT-PCR和RACE技术由泥鳅中克隆获得hsc70 cDNA的全长序列。结果表明,该cDNA全长2338bp,包括5′非翻译区(5′-UTR)92bp,3′非翻译区(3′-UTR)293bp,开放阅读框1953bp,编码650个氨基酸。预测的蛋白质分子量为71.24ku,等电点为5.31。... 详细信息

采用RT-PCR和RACE技术由泥鳅中克隆获得hsc70 cDNA的全长序列。结果表明,该cDNA全长2338bp,包括5′非翻译区(5′-UTR)92bp,3′非翻译区(3′-UTR)293bp,开放阅读框1953bp,编码650个氨基酸。预测的蛋白质分子量为71.24ku,等电点为5.31。该蛋白含有Dnak特征基序和2个HSP70家族标签序列,胞质HSP70特征序列及四肽简单重复序列。该序列与草鱼的相似性最高(97.5%),与人、非洲爪蟾、鸡等的相似性为87.2%～95.4%。半定量RT-PCR显示,hsc70mRNA在正常泥鳅大脑、肌肉、肠、脾脏、肝胰脏、头肾、心脏、卵巢、精巢组织中均有不同程度的表达。以福尔马林灭活温和气单胞菌刺激泥鳅后,泥鳅肝胰脏和脾脏组织hsc70mRNA表达水平均在15d内显著上升,并在15d达到峰值;头肾组织hsc70mRNA表达量在7d迅速上升,在15d到达峰值;在所有组织中,头肾组织中hsc70mRNA表达量上升幅度最大,说明头肾在鱼类免疫中发挥重要的作用。

关键词：泥鳅 hsc70 温和气单胞菌基因表达

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人hsc70基因真核表达载体的构建和表达

中国现代医学杂志 2008年第4期18卷 398-401页

作者：苏海霞张景霞王安辉李端闫永平第四军医大学预防医学系流行病学教研室陕西西安710032

目的构建hsc70(hsc)真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达。方法采用RT-RCR方法从正常人肝细胞系QZE中得到hsc70的cDNA序列,然后克隆入pcDNATM3.1/V5-HisA载体,构建重组质粒pcDNA-hsc70;经酶切和测序鉴定后,将pcDNA-hsc70体外转染HepG2细胞系,瞬时表达带有His标签的hsc70融合蛋白;并通过免疫细胞化学方法检测蛋白表达情况。结果RT-PCR扩增到1960bp的hsc70 cDNA片断,经测序分析与GenBank中已知序列一致;重组质粒pcDNA-hsc70转染后的HepG2细胞中,可检测到瞬时表达的hsc70-His融合蛋白。结论成功构建重组质粒pcDNA-hsc70,并可以在真核细胞HepG2中瞬时表达。

关键词： hsc70 肝细胞克隆真核表达

TGEV膜蛋白协同hsc70分子介导病毒入侵宿主细胞

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中国预防兽医学报 2023年第4期45卷 441-441页

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)属于α-冠状病毒,是引起仔猪腹泻脱水的常见病原之一。因其是现有的猪肠道冠状病毒中受体较为明确的成员,所以是研究冠状病毒入侵机制的理想模型。冠状病毒的纤突蛋白(S)... 详细信息

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)属于α-冠状病毒,是引起仔猪腹泻脱水的常见病原之一。因其是现有的猪肠道冠状病毒中受体较为明确的成员,所以是研究冠状病毒入侵机制的理想模型。冠状病毒的纤突蛋白(S)蛋白属于I类病毒糖蛋白,有识别并结合宿主细胞受体的功能,负责病毒粒子的入侵,即吸附和内化过程。冠状病毒膜蛋白(M)是病毒包膜的主要成分,在病毒生命周期中发挥着重要作用。目前对冠状病毒M功能的研究主要聚焦于病毒粒子的组装和出芽阶段,先前有研究表明针对TGEV M的抗体具有一定的中和效果,并利用电镜观察到M的C-末端位于病毒粒子的包膜外表面,这为M参与病毒的入侵过程提供了可能,那么M能否在病毒的入侵过程中发挥作用?以及具体作用机制是什么?

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 TGEV 猪肠道病毒粒子纤突蛋白冠状病毒宿主细胞 hsc70

近江牡蛎YB-1对hsc70的转录调控及两基因对热激、污染物的响应模式

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近江牡蛎YB-1对Hsc70的转录调控及两基因对热激、污染物的响应模式

作者：刘惠茹暨南大学

学位级别：硕士

70-kDa热休克蛋白是热休克蛋白家族中的重要成员之一,它包括组成型(Heat shock cognate protein 70,hsc70)和诱导型(inducible heat shock protein 70,Hsp70)两类。它们可以发挥“分子伴侣”作用,帮助细胞抵御外界胁迫。通常情况下,组成... 详细信息

70-kDa热休克蛋白是热休克蛋白家族中的重要成员之一,它包括组成型(Heat shock cognate protein 70,hsc70)和诱导型(inducible heat shock protein 70,Hsp70)两类。它们可以发挥“分子伴侣”作用,帮助细胞抵御外界胁迫。通常情况下,组成型hsc70主要发挥看家功能。在某些宿主体内,hsc70同样可以被多种刺激因子诱导表达,而hsc70的表达受到转录因子调控,但是,调控hsc70基因表达的转录因子还不清楚,急需阐明。本研究旨在筛选鉴定参与近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)Chhsc70基因表达调控的转录因子,并研究Chhsc70及其转录因子基因对热激、污染物的表达模式。首先通过DNA亲和纯化技术筛选出能够与Chhsc70启动子区特异性结合的蛋白因子,用质谱技术鉴定出其中一种蛋白为Y-box基元结合蛋白(Ch YB-1)。通过cDNA克隆技术获得了ChYB-1基因的全长cDNA为1257 bp,其中编码区924 bp,5’端和3’端非编码区分别为107 bp和226 bp。分子模拟结果显示ChYB-1具有一个高度保守的冷激结构域,这个结构域由5个反向平行的β-折叠构成,这类蛋白几乎参与包括转录在内的所有与核酸相关的生命活动,因此被称为“核酸伴侣”。细胞过表达实验和RNA干扰实验证明ChYB-1对Chhsc70的表达具有正调控作用。将重组表达载体pcDNA3.1-ChYB-1和pGL3-Chhsc70(启动子区)共转染至HEK293T细胞中,发现过表达的ChYB-1明显促进了Chhsc70调控区下游报告基因的表达;另外,当与ChYB-1基因同源的siRNAs使ChYB-1基因表达的mRNA被敲低后,Chhsc70基因的表达显著下调,以上两种结果都证明了ChYB-1对Chhsc70基因的表达具有正调控作用。实时荧光定量PCR结果显示Chhsc70和ChYB-1对热激和污染物在转录水平上具有类似响应模式,但ChYB-1的达峰时间较Chhsc70更早,暗示ChYB-1对Chhsc70有正调控作用。温度与壬基酚共同作用下,近江牡蛎体内的Chhsc70基因表达水平显著高于在恒温下相同浓度壬基酚处理时的表达水平,说明温度与污染物间存在协同诱导效应。而正转录调控因子ChYB-1对温度变化响应时间很短(小于12 h)且弱,而对污染物的响应时间长(至少8 d),表明ChYB-1是对污染物偏好的正转录因子,是合适的辅助污染预警分子。近江牡蛎体内ChYB-1与Chhsc70的比值(4)能消除温度变化对污染早期预警的干扰。为建立基于ChYB-1与Chhsc70比值(4)的海洋环境污染早期预警技术奠定了基础。本研究首次鉴定了ChYB-1是Chhsc70基因的正转录调控因子,ChYB-1对污染物具有偏好性而对温度变化为弱的瞬时响应,表明ChYB-1是合适的辅助污染预警分子。该研究对于进一步阐明Chhsc70基因的表达调控机制,以及建立实用的海洋环境污染早期预警技术有重要意义。

关键词：近江牡蛎 hsc70 转录因子 YB-1 正调控作用

牙鲆HSP70与hsc70基因的克隆、表达及其SNPs与耐热性状的相关性分析

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牙鲆HSP70与HSC70基因的克隆、表达及其SNPs与耐热性状的相关性分...

作者：刘旭东中国海洋大学

学位级别：硕士

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是重要的海水养殖鱼类,其肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,深受消费者喜爱。我国的牙鲆增产养殖业从20世纪80年代开始得到了迅猛发展。然而,牙鲆养殖业的发展也带来了诸多不容忽视的问题,随着工厂化养殖规模的... 详细信息

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是重要的海水养殖鱼类,其肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,深受消费者喜爱。我国的牙鲆增产养殖业从20世纪80年代开始得到了迅猛发展。然而,牙鲆养殖业的发展也带来了诸多不容忽视的问题,随着工厂化养殖规模的扩大、养殖环境不断恶化、以及牙鲆的高繁殖能力使得国内大部分养殖基地亲本繁育群体过小和更换率过低,导致牙鲆养殖群体遗传多样性的降低,使得现在养殖的牙鲆出现疾病爆发频繁、死亡严重、养殖效益大幅下降的情况。因此急需培育生长速度快,抗病能力高、抗逆性强的牙鲆新品种来满足当前养殖业的迫切需要,为此我们做了以下工作: 1.牙鲆的选育效果评估为了评估牙鲆(Paralichthys olivaceus)人工选育的育种效果,以2007年经过家系选育的具有优良生长性状的第一代个体为亲本,依据巢式交配设计,构建了第二代10个半同胞家系和20个全同胞家系。在养殖4个月后进行生长性状的测定,对比测试结果表明,经过选育的群体的平均体质量比未经选育的对照组提高了2.91克,遗传增益为11.25%,显著高于未经选育的群体(p70与hsc70基因的克隆及表达分析 Hsp70是热休克反应(heat shock reaction,HSR)中生成最为显著、最主要的一种应激蛋白。它能通过分子伴侣作用与蛋白分子结合,保护新合成蛋白分子的正确构型并参与蛋白分子在细胞内的转运和组装;当蛋白受损变性时,能促使其恢复,或加速其降解与清除;能重新激活某些酶,以维护细胞的功能和生存。研究表明,hsc70属于结构型蛋白主要存在于正常细胞,而Hsp70仅出现在应激细胞,且在细胞受到应激时增加明显。本研究克隆获得了牙鲆热休克蛋白Hsp70及其同源蛋白hsc70的基因cDNA和DNA全长,并对二者在热激条件下的表达情况进行了分析。 Hsp70的cDNA总长为2006bp,包括5’UTR 109bp,3’UTR 160bp以及编码区1923bp,可编码640个氨基酸。DNA总长2646bp,其中编码区内无内含子,位于编码区5端外侧含有一个符合GT-AG规则的长454bp的内含子。 hsc70的cDNA总长为2068bp,包括5’UTR 60bp,3’UTR31bp以及编码区1953bp,其ORF编码650个氨基酸。hsc70基因DNA全长3046bp,序列包括8个外显子,7个内含子。方差分析表明,在牙鲆的心肌细胞中,正常条件下(0h),Hsp70几乎不表达,当瞬时的热激处理后,hsp70开始大量表达,并随着热胁迫时间的增加表达量逐渐降低,到达8小时的时候几乎不表达。在未经热处理的对照组中(0h),hsc70大量表达。在热休克开始之后,其表达很快受到抑制,表达量几乎为0,在此后的8个小时内几乎都没有表达的情况发生。同时发现2个具有耐热表现型差异的家系之间Hsp70的表达情况没有差异(p>0.05),Hsp70的表达情况与家系之间也没有交互作用发生(p>0.05)。3 .HSP70的SNP位点与牙鲆耐热性状的关联分析我们扩增并测序了60条筛选出来的具有耐热性状差异的牙鲆群体Hsp70基因(相对耐热与不耐热牙鲆各30尾),测序和筛查结果共发现了24个SNP位点,其中的12个位于非翻译区,12个位于翻译区。在这24个位点中,同义突变有23个,占总数的96%,而非同义突变只有1个,且为同类型氨基酸。经过检验分析,我们最终将ID为1、2、5、8、15号的SNP作为下一步验证与耐热相关性的待选类型。

关键词：牙鲆选择育种遗传力温度耐受性 hsc70 Hsp70 基因克隆 Real-time PCR SNP

敌百虫诱导近江牡蛎（Crassostrea hongkongensis）hsc70基因表达的定量研究

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敌百虫诱导近江牡蛎（Crassostrea hongkongensis）HSC70基因表达...

作者：李春勇暨南大学

学位级别：硕士

海洋环境污染日益严重，分子水平的生物标志物，对污染物的反应快速灵敏，能指示分子生物标志物所在生物体所处环境的污染状态及其潜在危害，为严重毒性伤害提供早期预警，可以作为评估海洋环境健康状况的早期预警指标。热休克蛋白，是... 详细信息

海洋环境污染日益严重，分子水平的生物标志物，对污染物的反应快速灵敏，能指示分子生物标志物所在生物体所处环境的污染状态及其潜在危害，为严重毒性伤害提供早期预警，可以作为评估海洋环境健康状况的早期预警指标。热休克蛋白，是高度保守的蛋白质家族，广泛存在于所有生物细胞(包括原核细胞及真核细胞)内。其中，海洋双壳类HSP70家族成员对环境污染物有广泛的反应性，且反应灵敏，是一类理想的海洋环境污染的潜在预警分子。近江牡蛎广泛分布在近岸海域，是重要的海洋环境监测生物。我们以近江牡蛎为对象，采用荧光定量PCR技术研究了有机磷农药敌百虫诱导近江牡蛎潜在污染预警分子hsc70分子的表达情况。为了建立研究hsc70基因表达的荧光定量PCR技术，首先研究了β-actin、18S rRNA、GAPDH三种看家基因在近江牡蛎不同组织中的表达情况，以确定合适的内参基因，结果表明：β-actin在鳃、外套膜、消化腺、闭壳肌四种组织中均表达稳定，是一种理想的内参基因，而18S rRNA、GAPDH两种看家基因的表达则具有组织特异性，不适合作为内参基因使用。用不同浓度的敌百虫(0.5，0.2，0.05，0.01，0.001，0.0001 mg／l)处理近江牡蛎，分别于处理后3小时、7天、20天取样，研究闭壳肌、鳃、外套膜、消化腺等四种组织中hsc70的表达情况。荧光定量PCR技术研究表明，近江牡蛎在敌百虫处理后，其hsc70的表达具有组织特异性;本次试验中，0.5 mg／l的敌百虫不能诱导鳃、外套膜、消化腺中hsc70显著表达，但能够诱导闭壳肌中hsc70的显著低表达;外套膜中诱导hsc70显著表达的敌百虫临界浓度在0.001-0.0001 mg／l之间，消化腺和闭壳肌中在0.01-0.001 mg／l之间。极低浓度的敌百虫(0.0001 mg／l)仍然能够诱导鳃中hsc70显著高表达，表明hsc70对敌百虫的的刺激反应非常灵敏，也表明在本次研究的四种组织中，鳃对敌百虫反应最敏感，在生物监测时，是一种比较合适的组织材料。研究结果显示hsc70作为有机磷农药敌百虫的污染预警分子反应灵敏。

关键词：近江牡蛎 β-actin 18S rRNA GAPDH hsc70 Real-time PCR 基因表达