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hprna的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

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hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

作者：李云山东农业大学

学位级别：硕士

RNA介导的病毒抗性是RNAi在植物抗病毒侵染中的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在PTGS所导致的RNA降解过程中,RNA降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因RNA一起降解。新的研究... 详细信息

RNA介导的病毒抗性是RNAi在植物抗病毒侵染中的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在PTGS所导致的RNA降解过程中,RNA降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因RNA一起降解。新的研究证明发生于不同物种上的RNA沉默的直接引发因子都是双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),在不同生物中dsRNA有多种形成方式。对于转基因(正义和反义)来说,dsRNA最有效的形成途径是体外构建具有反向重复结构(Inverted Repeat, IR)的cDNA引入转基因植株,这种IR结构在体内转录后形成发夹RNA(hairpin RNA, hprna)。hprna中的dsRNA部分决定了反应的特异性,是诱发基因沉默的关键部位,它的长度和来源均影响所诱导的RNA沉默的效率。hprna间隔区段的长度可影响转基因转录后hprna的形成和稳定性,进而影响基因沉默的效率。一般认为短的间隔序列有利于hprna的形成,保持其高度稳定性,获得较高的沉默效率;但研究中也发现间隔序列过短往往影响IR序列在细菌内的稳定性,影响具反向重复结构基因的克隆。适宜的茎环比例,可能是获得高基因克隆效率和高基因沉默效率的关键。本研究选用了PVYNCP基因3’端50bp序列作为hprna的茎,以克隆载体pUC19不同长度的序列为环,构建了具有不同茎环比例的hprna结构的植物表达载体,转化烟草,研究了茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响。研究结果将为高效hprna的设计提供依据。具体结果如下:1.分别克隆PVYNCP 3’端704-754之间50bp的片断作为hprna结构的茎,以pUC19序列上的部分片段为hprna的环,构建植物双元表达载体pROK-4﹕1、pROK-2﹕1、pROK-1﹕1、pROK-1﹕2、pROK-1﹕4和pROK-1:8。2.将所构建的重组植物表达载体pROK-4﹕1、pROK-2﹕1、pROK-1﹕1、pROK-1﹕2、pROK-1﹕4和pROK-1﹕8及空pROKⅡ利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入农杆菌菌株。3.叶盘法转化烟草NC89。用卡那霉素对再生植株再次抗性筛选、PCR检测,共获得转pROKⅡ的烟草40株,转pROK-4:1的烟草143株,转pROK-2﹕1的烟草152株,转pROK-1﹕1烟草130株,转pROK-1﹕2的烟草135株;转pROK-﹕4的烟草132株;转pROK-1﹕8的烟草126株。4.转基因植株的抗病性分析,以PVYN的病汁液为接种物,汁液摩擦接种转基因烟草。症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVYN的抗性存在差异。从抗病性测试结果来看,在143株转pROK-4﹕1的T0代烟草中,有84株表现高度抗病,抗性植株比例为57.34%;152株转pROK-2﹕1的T0代烟草中,有94株表现高度抗病,抗性植株比例为61.84%;130株转pROK-1﹕1的T0代烟草中,有78株表现高度抗病,抗性植株比例为60.00%;135株转pROK-1﹕2的T0代烟草中,有69株表现高度抗病,抗性植株比例为51.11%;132株转pROK-1﹕4的T0代烟草中有72株表现高度抗病,抗性植株比例为44.69%;126株转pROK-1﹕8的T0代烟草中有12株表现高度抗病,抗性植株比例为9.52%。从发病的情况可以看出转基因植株中抗性植株的比例与茎环比例呈一定相关性。5.分别选取抗病性表现不同(抗病和感病)的部分转基因植株提取总DNA进行Southern blot分析,分析转基因的拷贝数与抗病性间的关系。结果表明转基因的拷贝数与抗病性无明显的相关性。6.转基因植株的Northern blot分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病性与转基因转录产物的积累量二者呈负相关,即这种抗病性为RNA介导的抗病性,是RNA沉默的结果。

关键词：马铃薯Y病毒 RNA介导的病毒抗性 hprna 茎环比例

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植物hprna干扰载体构建的研究进展

生物技术通报 2013年第9期29卷 7-12页

作者：言普沈文涛黎小瑛周鹏中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101

RNAi技术在基因功能鉴定和功能基因表达调控中发挥着重要作用。hprna干扰载体被广泛用于植物的RNAi研究。对植物hprna干扰载体的构建方法进行综述,并分析其优缺点,为植物hprna干扰载体构建方法的选择提供参考。

关键词： RNAi hprna 干扰载体载体构建 Golden Gate克隆

PRSV-CP基因小hprna植物表达载体的构建

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热带作物学报 2009年第2期30卷 176-180页

作者：王树昌言普沈文涛周鹏中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101

将获自海南(prsv-cp hno1～4)、云南(prsv-cp yunnan)和广西(prsv-cp guangxi)的番木瓜环斑病毒株系外壳蛋白(PRSV-CP)基因序列与DQ340771、X97251(来自中国台湾的PRSV株系)以及AY162218、AY231130、DQ374153、S46722、X97251(分别来自泰国、墨西哥、巴西、美国的PRSV株系)等外壳蛋白(CP)基因序列进行比对,在CP基因高保守区设计靶向目标序列进行亚克隆,获得长度为50bp的DNA片段,并通过一步套叠PCR把50bp正向片段和反向片段与拟南芥内含子拼接,成功构建了小hprna结构的植物表达载体,为进一步培育安全性好、抗谱广的番木瓜转基因新种质奠定了基础。

关键词： PRSV CP基因 hprna 植物表达载体

利用RNase Ⅲ缺陷型菌株发酵hprna防治烟草花叶病毒

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利用RNase Ⅲ缺陷型菌株发酵hpRNA防治烟草花叶病毒

作者：张国胜河南农业大学

学位级别：硕士

本研究依据RNAi机制,以TMV外壳蛋白基因序列为模板,构建含反向重复片段的表达载体,进而转化RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌（DY330）中,得到可以表达hprna的工程菌,发酵工程菌提取hprna后喷洒烟叶以抵抗TMV。试验主要内容包括: 1、构建表达hp... 详细信息

本研究依据RNAi机制,以TMV外壳蛋白基因序列为模板,构建含反向重复片段的表达载体,进而转化RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌（DY330）中,得到可以表达hprna的工程菌,发酵工程菌提取hprna后喷洒烟叶以抵抗TMV。试验主要内容包括: 1、构建表达hprna的工程菌DY-hp 根据TMV外壳蛋白基因序列设计引物,提取烟叶总RNA、反转录、PCR获得cDNA,测序比对结果显示相似性为98.33%。以cDNA为模板,扩增大、小两片段,将与T载体相连,得到含反向重复片段的克隆载体,测序比对结果显示一致性为99.73%。将反向重复结构与表达载体pET-21a相连后转化RNaseⅢ缺陷型菌株（DY330）得到表达hprna的工程菌DY-hp。 2、菌株DY-hp发酵hprna的条件优化测定了DY-hp的生长曲线,发现IPTG诱导4小时后hprna产量最高,又对IPTG诱导浓度和诱导菌浓进行了优化,结果是当OD600值为0.4、IPTG为0.4mM时hprna产量最大,此时每毫升发酵液得到约23μg hprna。 3、喷洒hprna处理烟叶实验一共六个处理:接种TMV三天前喷洒hprna、接种TMV三天后喷洒hprna、接种TMV并喷洒含空载体菌株DY-control发酵提取物、只接种TMV、只喷洒hprna、空白对照,实验重复三次,hprna预防TMV的处理抗病率达到65%,治疗TMV的处理抗病率为40%。本研究创新性采用一步单酶切、一步酶连高效、便捷的得到了同源于TMV外壳蛋白基因序列的反向重复结构,最终成功得到了高效表达hprna的工程菌DY-hp,并对DY-hp发酵进行了简单优化,最后通过hprna喷洒烟苗处理证实hprna达到65%抗TMV的预防效果。

关键词： RNaseⅢ hprna 烟草花叶病毒发酵外壳蛋白

hprna和pac1基因介导抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究

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hpRNA和pac1基因介导抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究

hprna的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

中国植物保护学会2006学术年会

作者：燕飞张文蔚肖红李世访成卓敏中国农业科学院植物保护研究所、植物病虫害生物学国家重点实验室中国农业科学院植物保护研究所、植物病虫害生物学国家重点实验室中国农业科学院植物保护研究所、植物病虫害生物学国家重点实验室中国农业科学院植物保护研究所、植物病虫害生物学国家重点实验室中国农业科学院植物保护研究所、植物病虫害生物学国家重点实验室

＜正＞在以往的抗BYDV转基因小麦研究中,已经使用的策略有CP基因介导的病毒抗性、复制酶基因介导的病毒抗性、运动蛋白基因介导的抗性,虽然这些抗性手段对BYDV具有延迟发病的抗性作用,但一直没有获得能够达到高度抗性水平的抗BYDV转基... 详细信息

＜正＞在以往的抗BYDV转基因小麦研究中,已经使用的策略有CP基因介导的病毒抗性、复制酶基因介导的病毒抗性、运动蛋白基因介导的抗性,虽然这些抗性手段对BYDV具有延迟发病的抗性作用,但一直没有获得能够达到高度抗性水平的抗BYDV转基因小麦植株。同时,这些抗性手段都具有专一性,只对基因来源病毒表现抗性,对其他病毒没有作用,即不具有广谱性。本文从进一步提高对BYDV的特异抗性和病毒广谱抗性两个方

关键词：抗大麦黄矮病毒小麦转基因 hprna RNA干扰 pac1基因农杆菌介导法基因枪法花粉管通道法

来源： cnki会议评论

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hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

应用套叠PCR技术构建番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的hprna植物表达载体

中国植物病理学会2008年学术年会

作者：李云宋云枝朱常香温孚江山东农业大学作物生物学国家重点实验室

以马铃薯 Y 病毒(Potato Virus Y,PVY)的外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因3′端50bp 片段为 hprna 的茎,以 pUC19不同长度的序列为 hprna 的环,构建了茎环比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2、 1:4和1:8的植物表达载体。利用农杆菌介导法转化... 详细信息

以马铃薯 Y 病毒(Potato Virus Y,PVY)的外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因3′端50bp 片段为 hprna 的茎,以 pUC19不同长度的序列为 hprna 的环,构建了茎环比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2、 1:4和1:8的植物表达载体。利用农杆菌介导法转化烟草品种 NC89,获得了多种转基因植株。室内抗病性检测发现:不同茎环比例的 hprna 介导的病毒抗性的效率不同;茎环比例为4:1、2:1和1:1时效率较高,抗性植株的比例达60%;随着环长度的增加,抗性植株的比例逐渐降低;当茎环比例为 1:8时,抗性植株的比例仅为9.52%。Southern blot 分析结果表明:外源基因已整合于烟草的基因组中, 且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性:Northern blot 分析结果表明:目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是 RNA 介导的。

关键词：马铃薯 Y 病毒 RNA 介导的病毒抗性 hprna 茎环比例

来源： cnki会议评论

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生命科学研究 2010年第5期14卷 393-397页

作者：吴金燕言普沈文涛黎小瑛周鹏中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室中国海南海口571101 海南大学中国海南海口570228

植物真核翻译起始因子4E(eIF4E)在蛋白质合成的起始中发挥重要作用,参与植物-病毒互作,影响病毒的侵染过程.为了研究eIF4E在植物病毒侵染中的功能,建立了一种快速的套叠PCR新方法,成功构建了番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的hprna结构,并将... 详细信息

植物真核翻译起始因子4E(eIF4E)在蛋白质合成的起始中发挥重要作用,参与植物-病毒互作,影响病毒的侵染过程.为了研究eIF4E在植物病毒侵染中的功能,建立了一种快速的套叠PCR新方法,成功构建了番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的hprna结构,并将其连接到改造的植物表达载体pBI121上,为利用RNA干扰技术研究番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因在病毒侵染中的作用奠定了基础.

关键词： hprna 植物表达载体套叠PCR eIF4E基因 eIFiso4E基因

sbeIIb基因hprna结构植物转化载体的构建

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中国计量学院学报 2006年第4期17卷 337-340页

作者：张明洲方结红陈宗伦刘军胡华军孙传兴 Christer Jansson 中国计量学院生命科学学院浙江杭州310018 瑞典农业大学植物学系瑞典乌普萨拉SE-75007

hprna介导基因沉默技术是一种下调某个内源目的基因表达的有效技术.本研究将淀粉分支酶基因sbeIIb启动子控制下的sbeIIb基因的hprna结构构建于植物双元表达载体pCAMBIA1305.1中,并将该重组载体导入农杆菌超毒力菌株AGL1中,构建了一种适... 详细信息

hprna介导基因沉默技术是一种下调某个内源目的基因表达的有效技术.本研究将淀粉分支酶基因sbeIIb启动子控制下的sbeIIb基因的hprna结构构建于植物双元表达载体pCAMBIA1305.1中,并将该重组载体导入农杆菌超毒力菌株AGL1中,构建了一种适于禾本科的植物转化载体.

关键词： sbeIIb基因载体 hprna

番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因嵌合hprna载体一步快速构建及沉默效果的研究

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番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因嵌合hpRNA载体一步快速构建及沉默效果...