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水飞蓟宾通过抑制STAT3和hnRNP U进核改善铅暴露引起的学习记忆障碍

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水飞蓟宾通过抑制STAT3和hnRNP U进核改善铅暴露引起的学习记忆障...

作者：张玮南昌大学

学位级别：硕士

背景:铅是广泛存在的环境污染物,进入人体后会对各组织器官造成损伤,其中神经系统对铅尤为敏感。婴幼儿和儿童的中枢神经系统处于发育期,受到低浓度铅暴露就会表现出学习记忆的损伤。前期本课题组就铅神经毒性机制进行了大量研究,证实... 详细信息

背景:铅是广泛存在的环境污染物,进入人体后会对各组织器官造成损伤,其中神经系统对铅尤为敏感。婴幼儿和儿童的中枢神经系统处于发育期,受到低浓度铅暴露就会表现出学习记忆的损伤。前期本课题组就铅神经毒性机制进行了大量研究,证实铅可通过诱导核不均一核糖核蛋白u（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein u,hn RNP u）进核,进而增加神经元限制性沉默因子（Neuron-restrictive silencer factor,NRSF）表达。那么,铅如何诱导hn RNP u进核的呢?信号转导和转录激活因子-3（Signal transducer and activator of transcription-3,STAT3）是与神经发育相关的转录因子,其磷酸化后形成二聚体转入细胞核发挥转录调节作用。研究表明STAT3能与其他蛋白形成核易位复合体,从而影响相关蛋白的跨核膜转运。此外,研究发现STAT3与hn RNP u发生特异性结合,并且铅能够上调STAT3的表达。铅可否通过STAT3增加hn RNP u进核?水飞蓟宾能与STAT3的SH2结构域直接结合从而抑制其磷酸化和核转位。大量研究指出水飞蓟宾具有较强的神经保护作用。本实验建立动物和细胞模型,研究铅暴露对STAT3、hn RNP u的影响及具体机制,探究水飞蓟宾是否能改善铅暴露诱导的学习记忆损伤及是否通过抑制STAT3和hn RNP u进核发挥神经保护作用,为铅中毒治疗提供理论依据。方法:1、铅暴露对STAT3的影响:建立铅暴露大鼠模型,分为3组:空白对照组（CON）,低浓度铅暴露组（LLG）,高浓度铅暴露组（HLG）。建立铅暴露PC12细胞模型,分为3组:空白对照组（0μM Pb组）,低浓度铅暴露组（10μM Pb组）,高浓度铅暴露组（100μM Pb组）。应用电感耦合等离子体发射光谱技术（Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry,ICP-AES）检测大鼠全血和海马组织中铅含量;采用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,q PCR）检测大鼠海马组织和PC12细胞中STAT3 m RNA水平;应用蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）测定大鼠海马组织和PC12细胞STAT3总蛋白、核蛋白、浆蛋白和p-STAT3蛋白含量;免疫荧光技术检测大鼠海马组织和PC12细胞中STAT3免疫反应性;蛋白质免疫共沉淀技术测定PC12细胞中STAT3与hn RNP u的相互作用。2、铅暴露模型中抑制STAT3进核对hn RNP u的影响:PC12细胞分为3个组:空白对照组（CON）,铅暴露组（Pb组）,铅暴露STAT3抑制剂组（Pb+Stattic组）。采用q PCR检测PC12细胞中hn RNP u、STAT3 m RNA水平,WB测定PC12细胞中hn RNP u、STAT3总蛋白、核蛋白和浆蛋白含量,免疫荧光技术检测PC12细胞中hn RNP u、STAT3免疫反应性。3、水飞蓟宾对学习记忆能力及STAT3、hn RNP u的影响:建立水飞蓟宾治疗模型,大鼠随机分为3个组:空白对照组（CON）,铅暴露组（Pb组）,铅暴露水飞蓟宾治疗组（Pb+SLB组）。建立水飞蓟宾治疗细胞模型,PC12细胞分为3个组,空白对照组（CON）,铅暴露组（Pb组）,铅暴露水飞蓟宾治疗组（Pb+SLB组）。应用水迷宫实验测定大鼠的空间学习记忆能力;采用q PCR检测大鼠海马组织和PC12细胞中hn RNP u、STAT3 m RNA水平;WB测定大鼠海马组织和PC12细胞中hn RNP u、STAT3总蛋白、核蛋白和浆蛋白含量;免疫荧光技术检测大鼠海马组织和PC12细胞中hn RNP u、STAT3免疫反应性。结果:1、铅暴露对STAT3的影响:铅暴露组大鼠全血和海马组织中的铅含量相对对照组明显增加;q PCR结果显示铅暴露组大鼠海马组织和PC12细胞中STAT3m RNA水平相对对照组明显增加;WB结果显示铅暴露组大鼠海马组织和PC12细胞STAT3总蛋白、核蛋白和p-STAT3蛋白含量相对对照组显著增加;从免疫荧光技术结果观察到铅暴露组大鼠海马组织和铅暴露组PC12细胞中细胞核内的STAT3免疫荧光阳性反应明显增强;蛋白质免疫共沉淀结果显示铅暴露PC12细胞中STAT3与hn RNP u相互作用。2、铅暴露模型中抑制STAT3进核对hn RNP u的影响:q PCR结果显示抑制STAT3进核后hn RNP u、STAT3 m RNA水平无明显变化;WB结果显示相对Pb组,Pb+Stattic组中hn RNP u、STAT3核蛋白明显减少但其二者总蛋白无明显变化;免疫荧光技术结果中观察到相对Pb组,Pb+Stattic组中hn RNP u、STAT3在

关键词：铅暴露 STAT3 hnRNP U 水飞蓟宾学习记忆

hnRNP U对慢性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

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hnRNP U对慢性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

作者：牟科重庆医科大学

学位级别：硕士

目的BCR-ABL融合基因编码产生BCR-ABL蛋白,其酪氨酸激酶活性持续异常活化下游信号通路,导致CML的发生。尽管酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)伊马替尼(Imatinib,IM)等药物的使用延长了患者的生存期,但仍有约25%的病... 详细信息

目的BCR-ABL融合基因编码产生BCR-ABL蛋白,其酪氨酸激酶活性持续异常活化下游信号通路,导致CML的发生。尽管酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)伊马替尼(Imatinib,IM)等药物的使用延长了患者的生存期,但仍有约25%的病人产生耐药,临床急需新的治疗手段。核不均一核糖核蛋白(Heterogeneous ribonucleoprotein,hnrnp)是一类RNA结合蛋白,参与细胞内mRNA的剪切、成熟、转运、稳定及翻译调控等过程。近年来,hnrnp家族多个成员被证实在慢性髓细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)中发挥重要作用。其中hnRNP U自1992年被发现以来,已证实它与多种实体肿瘤发生发展相关,但在CML中的研究尚未见报道。为了使本研究对CML具有普适性,我们考虑了IM敏感和IM耐药两种临床现状。故本课题拟采用IM敏感细胞株K562及IM耐药细胞株K562/G01细胞为模型,探究hnRNP U在CML中的作用及可能的机制,为探寻CML的发病机制和治疗新思路提供实验基础。方法1.采用RT-qPCR和Western blot分别检测正常对照(NC)及CML患者骨髓标本,BCR-ABL阴性细胞株TK6、THP1,BCR-ABL阳性细胞株K562、KCL22、K562/G01中hnRNP U的表达;再用不同浓度伊马替尼处理K562及K562/G01细胞48 h后,Western blot检测BCR-ABL磷酸化水平及hnRNP U蛋白水平的变化。2.采用sh-hnRNP U慢病毒感染K562及K562/G01细胞72-96 h,RT-qPCR检测hnRNP U mRNA敲低效果,经嘌呤霉素筛选4天后Western blot检测hnRNP U蛋白敲低效果。选取敲低效果较好的sh RNA-1、sh RNA-2慢病毒感染K562及K562/G01 96 h,采用CCK8和克隆形成实验检测细胞的增殖能力;sh RNA-1、sh RNA-2慢病毒感染K562及K562/G01细胞96 h经嘌呤霉素筛选并继续培养4-5天后,用流式细胞术检测细胞的凋亡。3.利用生物信息学技术筛选hnRNP U的潜在靶基因;RT-qPCR及Western blot检测hnRNP U敲低后相应靶基因mRNA、蛋白表达水平及mRNA半衰期;RIP实验检测hnRNP U与靶基因mRNA的结合。结果1.与正常人骨髓标本和BCR-ABL阴性细胞株相比,hnRNP U在CML患者骨髓标本(PhnRNP U表达水平不受BCR-ABL磷酸化水平的影响。2.病毒感染细胞72-96 h,hnRNP U mRNA敲低至50%以下,经嘌呤霉素筛选后hnRNP U蛋白显著降低。CCK8结果显示48 h时,sh-hnRNP U组细胞增殖速率明显变缓(PhnRNP U组克隆数量减少约50%且克隆形态明显变小,表明hnRNP U敲低,CML细胞增殖能力明显受抑(PhnRNP U正相关、且与hnRNP U有可能结合的mRNA有c-Myc和BCL-2;hnRNP U敲低后c-Myc和BCL-2的mRNA表达水平及mRNA稳定性均降低,c-Myc和BCL-2蛋白表达水平也降低;RIP实验发现hnRNP U可以结合c-Myc和BCL-2的mRNA。结论本研究发现hnRNP U在CML病人骨髓标本和CML细胞系K562、KCL22、K562/G01中表达增高,高表达的hnRNP U可促进CML细胞增殖并抑制其凋亡,其可能的机制是通过hnRNP U与c-Myc和BCL-2的mRNA结合并增强其mRNA稳定性,促进c-Myc及BCL-2蛋白表达来实现的。研究表明hnRNP U对于IM敏感及耐药的CML细胞株的存活同样重要,为深入阐明hnRNP U在CML发病中的作用奠定了实验基础。

关键词： hnRNP U 慢性髓细胞白血病增殖凋亡 mRNA稳定性

hnRNP U单倍剂量不足影响小鼠的组织发育、代谢稳态和精子发生

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hnRNP U单倍剂量不足影响小鼠的组织发育、代谢稳态和精子发生

作者：孙敏上海交通大学

学位级别：硕士

核异质核糖核蛋白被认为对细胞内活动有重要的调节作用。在此,我们首次建立了核异质核糖核蛋白家族中重要的成员核异质核糖核蛋白u(hnRNP U)全身性敲除的小鼠模型。hnRNP U全身性敲除纯合子小鼠(hnrnpu)死于胚胎期7.5天前。通过分析Hnr... 详细信息

核异质核糖核蛋白被认为对细胞内活动有重要的调节作用。在此,我们首次建立了核异质核糖核蛋白家族中重要的成员核异质核糖核蛋白u(hnRNP U)全身性敲除的小鼠模型。hnRNP U全身性敲除纯合子小鼠(hnrnpu)死于胚胎期7.5天前。通过分析hnrnpu小鼠的表型,我们发现其表现出发育迟缓、组织发育缺陷、骨密度降低、瘦肉含量减少以及代谢活动稳态的失衡。其在行为学方面没有明显的异常。这些工作证实了hnRNP U在小鼠发育的调节和维持代谢稳态中发挥了重要的作用。hnRNP U在小鼠发育和维持代谢稳态等方面起着重要的作用,但是其在精子发生过程中的作用却不是很清楚。在此,我们证实hnRNP U在调节小鼠精子发生和维持雄鼠生殖中起着重要作用。hnRNP U单倍剂量不足造成小鼠睾丸中精原细胞的增殖的减少和凋亡的增加从而导致空腔化的曲细精管以及增加的未成熟精子的数量。我们进一步证明,hnRNP U单倍剂量不足影响了精原细胞分化过程中重要基因和支持细胞中重要基因的表达。我们的工作为证实hnRNP U在小鼠精子发生中对维持精原细胞分化的作用提供了体内的证据。

关键词： hnRNP U 单倍剂量不足发育迟缓代谢稳态精子发生

H19通过干扰hnRNP U-actin复合物抑制RNA聚合酶Ⅱ介导的转录

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H19通过干扰hnRNP U-actin复合物抑制RNA聚合酶Ⅱ介导的转录

Nuclear to cytoplasmic translocation of hnRNP U enhances TLR-induced proinflammatory cytokines production by stabilizing mRNAs in macrophages

第十二次全国医学遗传学学术会议

作者：毕海珊袁继行杨富王芳孙树汉第二军医大学医学遗传学教研室

Background & Aims:H19 is one of the earliest identified and studied long noncoding RNAs.It is presumed that H19 is essential for regulating development and disease conditions,and is associated with ca

关键词： CTD phosphorylation Eu incorporation H19 hnRNP U transcription repression

来源： cnki会议评论

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Nuclear to cytoplasmic translocation of hnRNP U enhances TLR...

H19通过干扰hnrnpu-actin复合物抑制RNA聚合酶介导的转录

“细胞活动生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代...

作者： Wei Zhao,Lijuan Wang,Meng Zhang,Jianni Qi,Chengjiang Gao Department of Immunology,Shandong university Medical School,Jinan,Shandong 250012,China

TLR signaling is associated with the transcription of various proinflammatory cytokines including TNF-α, IL-6 and IL-1β.After transcription,the mRNA of these proinflammatory cytokines needs to be tightly controlled at the post-transcriptional level to achieve an optimal expression.But,the precise mechanism of post-transcriptional regulation is not fully understood.In the present study,we found the expression of hnRNP U,also termed scaffold attachment factor A(SAF-A),was greatly induced by TLR stimulation in macrophages.Knock-down of hnRNP U expression greatly attenuated TLR-induced expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β,but not IL-12,while hnRNP U overexpression greatly increased TLR-induced expression of TNF-α,IL-6 and IL-1β.Furthermore,hnRNP U knock-down accelerated the turnover and decreased the half-life of TNF-在,IL-6,and IL-1βmRNA.RNA immunoprecipitation(RIP) demonstrated that hnRNP U bound to the mRNA of these proinflammatory cytokines through the RGG motif.Importantly,we showed that TLR stimulation provided a stimulus for hnRNP U nuclear to cytoplasmic translocation.Therefore,we propose that hnRNP U induced by TLR signaling binds to the mRNA of a subset of proinflammatory cytokines and positively regulates the expression of these cytokines by stabilizing mRNA.

关键词： TLR hnRNP U RNA stability proinflammatory cytokine

来源： cnki会议评论

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H19通过干扰hnRNPU-actin复合物抑制RNA聚合酶介导的转录

作者：毕海珊第二军医大学

学位级别：硕士

H19作为最早被发现和研究的少数几个长链非编码RNA分子之一,大量的研究提示H19与肿瘤的发生密切相关。然而H19的具体生物学功能及调控机制,尤其是对转录过程是否存在调节作用尚不清楚。因此探讨H19可能的生物学功能及其具体作用的分子... 详细信息

H19作为最早被发现和研究的少数几个长链非编码RNA分子之一,大量的研究提示H19与肿瘤的发生密切相关。然而H19的具体生物学功能及调控机制,尤其是对转录过程是否存在调节作用尚不清楚。因此探讨H19可能的生物学功能及其具体作用的分子机制可以为H19在生理及病理环境中的重要作用提供线索,带着这些问题我们展开了本课题的研究。首先,我们进行了RNA pulldown实验,将H19全长及其反义链构建到pSPTl9载体上,体外转录获得H19正义链和反义链RNA后,检测浓度符合要求后冷冻保存。另外,收集肝癌细胞Hep3B和Huh-7的全蛋白待用。利用准备好的上述样品进行最终的RNA pulldown实验,对比正义链和反义链的差异蛋白条带做质谱鉴定后,结果显示H19的相互作用蛋白为核不均一核糖核蛋白(heterogeneous ribonucleopro-tein) hnRNP U。对质谱鉴定的结果通过Western blotting、RIP验证。在两者的结合确定后,为了进一步探明H19的哪个区域与hnRNP U结合,我们H19构建了H19不同区域截短体,通过截短体实验证明与hnRNP U结合的区域位于H19的5’端882nt。在确定与H19相互作用的蛋白为hnRNP U后,接下来我们便从hnRNP U这个RNA/DNA结合蛋白切入,探索H19的生理、病理学功能及其作用机制。在查阅相关文献后发现,hnRNP U能与不同的转录因子结合发挥不同的功能。而更加值得关注的是hnrnpu在RNA聚合酶Ⅱ介导的转录中也发挥重要的功能。研究报道,hnRNP U和actin结合通过促进RNA聚合酶Ⅱ CTD的磷酸化进而促进RNA聚合酶Ⅱ的转录。基于以上的研究结果的提示,我们首先想证实H19对RNA聚合酶Ⅱ介导的转录是否有调控作用。在Hep3B和Huh-7细胞中进行了Eu掺入实验,实验结果表明相对于对照组过表达H19组Eu掺入减少,以上结果提示H19抑制了RNA聚合酶Ⅱ介导的转录。在得出以上实验结果后新的问题需要我们去证实：H19通过怎样的机制抑制RNA聚合酶Ⅱ介导的转录,H19是否会对hnRNP U-actin复合物有影响。我们利用IP实验对以上假设进行检验,在Hep3B和Huh-7细胞中过表达H19,随着H19浓度的升高hnRNP U和actin勺结合呈下降趋势。以上结果说明H19干扰了hnRNP U-actin复合物。那么H19对RNA聚合酶Ⅱ CTD的磷酸化过程是否有调控作用,因此我们分别用RNA聚合酶Ⅱ CTD2位、5位丝氨酸磷酸化及RNA聚合酶Ⅱ总CTD的抗体,相对于对照检测过表达H19对这几种形式蛋白的影响,Western blotting的结果显示H19抑制RNA聚合酶Ⅱ CTD的5位丝氨酸的磷酸化。而在过表达hnrnpu的基础上同时过表达H19时,以上的生物学效应明显减弱,这说明H19的以上生物学功能是依赖hnrnpu实现的。综上所述，本课题研究对H19在肝癌细胞的生物学功能进行了检测,探讨了H19与hnRNP U的结合及其在肝癌细胞中的抑制RNA聚合酶Ⅱ转录的作用,进一步完善了H19在肝癌细胞中的功能及其作用的机制研究,可能为H19的进一步研究提供线索和依据。

关键词： CTD磷酸化 Eu掺入 H19 hnRNP U 转录抑制

Long noncoding RNA H19 inhibits the proliferation of fetal liver cells and the Wnt signaling pathway

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Long noncoding RNA H19 inhibits the proliferation of fetal l...