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K88ac+和K88ad+产肠毒素大肠杆菌hlya基因缺失株的构建及相关功能初步分析

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K88ac+和K88ad+产肠毒素大肠杆菌hlyA基因缺失株的构建及相关功能...

作者：姜露扬州大学

学位级别：硕士

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)系一类致人和幼畜(初生羔羊、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻最常见的病原性大肠杆菌,其毒力因子主要包括黏附素菌毛、肠毒素、产志贺氏菌毒素、溶血素等。α-溶血素在ETEC的致病... 详细信息

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)系一类致人和幼畜(初生羔羊、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻最常见的病原性大肠杆菌,其毒力因子主要包括黏附素菌毛、肠毒素、产志贺氏菌毒素、溶血素等。α-溶血素在ETEC的致病机理中很少受到关注,是一种RTX(repeats in toxin)毒素蛋白,对于大部分哺乳动物细胞(如红细胞、粒细胞、单核细胞和内皮细胞)都具有溶细胞活性和细胞毒性,能够整合进宿主细胞膜,影响细胞膜的稳定性,使其内容物渗漏或者裂解,是大肠杆菌肠外感染的一个重要的毒力因子。基于K88ac+/K88ad+ETEC都具有溶血素基因,且两者病原致病机理不尽相同。我们成功构建hlya毒素基因缺失株,为进一步深入研究hlya毒素与机体相互作用的分子机制,溶血素的致病机理及对猪大肠杆菌病的防控策略奠定一定基础。1、利用Red同源重组技术构建hlya基因缺失株根据GenBank中已报道的ETEC hlya基因的序列,首先合成一对引物(引物5’端与hlya基因同源,而3’端与pKD3质粒上氯霉素抗性基因cat同源),经PCR扩增后得到具有氯霉素抗性基因和hly基因同源臂的产物,将PCR扩增产物直接转化入大肠杆菌中,在pKD46表达的重组酶作用下,PCR产物两端的hlya基因同源序列与大肠杆菌染色体上的的同源序列发生同源重组交换,利用抗性筛选得到阳性一次重组菌。利用编码Flp重组酶的质粒pCP20,去除氯霉素抗性基因,最后在染色体上只留下一个FRT位点,得到二次重组菌,通过PCR扩增及测序鉴定缺失株的正确构建。本试验成功构建了大肠杆菌标准株K88ac、K88ad的hlya基因缺失株。同时我们将表达hlya基因的pBR322质粒导入缺失株,构建了互补株。2、溶血素在大肠杆菌致病过程中作用初探在K88ac△hlya、K88ad△hlya成功构建的基础上,比较分析了野生株和缺失株相关生物学特性的变化。体外生长实验和酵解实验表明,同样的培养条件下,缺失株K88ac△hlya、 K88ad△hlya株生长速度及生长周期各个阶段的特性与野生株相比基本没有差异,其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变。同时将6周龄ICR小鼠分为1个对照组和6个攻毒组,经灌胃途径分别对各攻毒组小鼠接种109cfu剂量的大肠杆菌悬液,定期观察接种后小鼠的状态(饮食、饮水、精神状态和死亡情况),对死亡小鼠进行剖检记录病理变化,结果显示：经野生株和回补株攻毒的小鼠有出血死亡的现象,而缺失株没有,说明hlya会影响大肠杆菌对ICR小鼠的致病性,增强大肠杆菌对ICR小鼠的毒力。在小鼠的十二指肠、空肠、回肠分离细菌,分别进行平板计数和PCR检测,结果表明：大肠杆菌在回肠的粘附能力比在十二指肠和空肠要强,且野生株和回补株比缺失株要强。

关键词： Red重组系统 hlya基因突变株毒力实验

气单胞菌aerA和hlya两基因在溺死诊断中的应用

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刑事技术 2021年第2期46卷 111-118页

作者：肖成朱晓琳徐曲毅韩雅莉李越余仲昊李欢彭帆刘向东刘超广州市刑事科学技术研究所公安部法医病理学重点实验室广州510442 南方医科大学法医学院广州510515 广东工业大学轻工化工学院广州510006 重庆医科大学基础医学院重庆400016

目的建立溺死尸体脏器气单胞菌气溶素(aerA)和溶血素(hlya)两基因的PCR-CE检测方法,验证该方法的特异性和灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计气单胞菌(Aeromonas)特异性引物aer-A1和hlya-1,构建PCR-CE方法;扩增52种标准株... 详细信息

目的建立溺死尸体脏器气单胞菌气溶素(aerA)和溶血素(hlya)两基因的PCR-CE检测方法,验证该方法的特异性和灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计气单胞菌(Aeromonas)特异性引物aer-A1和hlya-1,构建PCR-CE方法;扩增52种标准株DNA;确定最低DNA检测浓度;检测16只实验猪和40例真实案件尸体组织样本,分别计算两对引物总阳性率。结果引物aerA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和温和气单胞菌,产物片段为180bp,灵敏度分别为0.034、0.92ng;引物hlya-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌,产物片段为150bp,灵敏度分别为0.94、0.034ng。利用aerA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为70.00%、78.38%;利用hlya-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为80.00%、83.78%。结论基于气单胞菌aerA基因和hlya基因建立的PCR-CE检测方法进行溺死诊断,快速灵敏,特异性好,有良好的应用前景。

关键词：法医学溺死诊断聚合酶链式反应-毛细管电泳气单胞菌 aerA基因 hlya基因

PMA-RF-SRCA检测乳中单增李斯特氏菌活菌

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中国乳品工业 2022年第8期50卷 48-52,57页

作者：王新潮张蕴哲杨倩卢鑫徐慧张伟河北农业大学食品科技学院河北保定071001 河北大学公共卫生学院河北保定071002 河北农业大学理工学院河北沧州061100 河北农业大学生命科学学院河北保定071001 河北省人畜共患病原微生物分析与防控重点实验室河北保定071001

本研究建立了一种叠氮溴化丙锭(PMA)与实时荧光跨越式滚环等温扩增(RF-SRCA)相结合的方法,可以高效灵敏检测乳中活的单增李斯特氏菌。以hlya基因为靶点,设计并筛选出特异性引物,通过对PMA的工作浓度、暗孵育时间和光反应时间进行优化,... 详细信息

本研究建立了一种叠氮溴化丙锭(PMA)与实时荧光跨越式滚环等温扩增(RF-SRCA)相结合的方法,可以高效灵敏检测乳中活的单增李斯特氏菌。以hlya基因为靶点,设计并筛选出特异性引物,通过对PMA的工作浓度、暗孵育时间和光反应时间进行优化,确定了最佳的处理条件。此外,对该方法的特异性、灵敏度及检出限进行了分析。结果表明,该方法引物特异性良好,6株单增李斯特氏菌结果均为阳性,12株非单增李斯特氏菌结果均为阴性;当PMA工作浓度为30μmol/L、暗孵育10 min、光反应15 min时,所建立的方法灵敏度为3.9 CFU/mL,人工污染乳制品的检出限为1.56×10 CFU/mL。综上所述,本研究所建立的PMA-RF-SRCA方法特异性强,灵敏度高,为检测食品中活的单增李斯特氏菌提供了新的思路。

关键词：跨越式滚环等温扩增(SRCA) 叠氮溴化丙锭(PMA) 单增李斯特氏菌 hlya基因乳品

可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

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食品科学 2021年第16期42卷 239-245页

作者：苑宁张蕴哲张海娟于泽卢鑫张伟河北农业大学理工学院河北沧州061100 河北农业大学食品科技学院河北保定071000 河北农业大学生命科学学院河北保定071000

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlya基因序列设计引物,进行特异性验证,对... 详细信息

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlya基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定。通过检测70种实际食品样品对SRCA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果表明:所有单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性结果,非单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果,说明该方法特异性良好。SRCA方法的灵敏度为8.9×10^(0)fg/μL,是传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法的1000倍,检出限为2.8×10^(0)CFU/g,是传统PCR方法的1/1000。在实际样品的检测中,SRCA方法与GB 4789.30—2016《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、97.01%和97.14%。可视化SRCA技术具有操作简便、设备简单、特异性强、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点,适合在基层单位和中小型食品企业中推广应用。

关键词：跨越式滚环等温扩增技术单核细胞增生李斯特氏菌 hlya基因检测可视化

电化学方法在李斯特氏菌毒力基因检测中的应用

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遗传 2010年第5期32卷 512-516页

作者：吴凌伟刘全俊吴中伟陆祖宏东南大学生物电子学国家重点实验室南京210096 南昌大学中德联合研究院南昌330047

单核李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)是食源性李斯特氏病的病源菌,该病可引起败血病、脑膜炎、流产等。李斯特氏菌的毒力因子listeriolysin O(LLO)是引发李斯特氏病的主要原因。文章使用一种特殊的电化学方法从样品中检测编码LLO... 详细信息

单核李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)是食源性李斯特氏病的病源菌,该病可引起败血病、脑膜炎、流产等。李斯特氏菌的毒力因子listeriolysin O(LLO)是引发李斯特氏病的主要原因。文章使用一种特殊的电化学方法从样品中检测编码LLO的hlya基因。该方法以化合物Nhydroxy sulfosucc inimide(NHS)和N-(3-dimethylamion)propyl-N'-ethyl carbodiimidehydroc hloride(EDC)作为激活剂,使单链DNA探针结合到金电极表面组成工作电极,以[Co(phen)3](ClO4)3作为指示剂来检测循环伏安曲线(Cyclic voltammetry,CV),通过CV峰值的变化来估算hlya基因的含量,从而确定LM的污染情况。这种新颖的电化学方法用于免标记的目标DNA的杂交检测,具有快速和方便的特点。

关键词：单核李斯特氏菌电化学 DNA检测 hlya基因

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光RPA检测方法的建立及应用

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现代食品科技 2018年第8期34卷 213-218,98页

作者：王金凤刘立兵耿云云石蕊寒孙晓霞南汇珠姜彦芬王建昌河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心河北石家庄050000 河北省检验检疫科学技术研究院河北石家庄050051 河北师范大学生命科学学院河北石家庄050024

本研究旨在建立一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)的实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time RPA)方法。基于LMhly A基因保守序列,设计合成特异性RPA引物和exo探针,所建立的LM real-time RPA方法能够在37℃... 详细信息

本研究旨在建立一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)的实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time RPA)方法。基于LMhly A基因保守序列,设计合成特异性RPA引物和exo探针,所建立的LM real-time RPA方法能够在37℃等温条件下20 min内完成扩增。该方法仅对LM基因组DNA为阳性扩增,对其它20种致病菌基因组DNA的扩增均为阴性;以LM纯培养菌液的基因组DNA进行10倍列梯度稀释,并以之作为模板,其灵敏性可达到5×10-1 pg,与实验室已建立的real-time PCR方法一致。人工污染实验中,对于LM接菌量为3 CFU/25 g的羊肉和生菜样品,增菌14 h即可通过建立的real-time RPA方法检出,与传统培养方法和real-time PCR检测结果均一致,但是前者所需时间明显少于后者。本文建立的LM real-time RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,反应迅速,并能够摆脱对价格昂贵的荧光PCR仪和专业实验室的需求,可应用于食品突发事件中LM的现场快速检测,对保障我国食品安全具有重要意义。

关键词：单核细胞增生李斯特氏菌 real-time RPA hlya基因食品安全

单增李斯特菌反转录环介导等温扩增检测方法的建立

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现代食品科技 2020年第6期36卷 297-302页

作者：徐匆罗华建黄皓梁卫驱胡珊李艳芳胡楚维罗鸿斌东莞市农业科学研究中心广东东莞523086 东莞理工学院研究生处广东东莞523808

本研究针对单增李斯特菌的快速检测方法进行开发,首先根据单增李斯特菌hly A基因序列保守区设计2对引物,在同一体系中对单增李斯特菌的RNA进行反转录及环介导等温扩增,同时使用羟基萘酚蓝(终浓度200μM)作为反转录环介导等温扩增产物的... 详细信息

本研究针对单增李斯特菌的快速检测方法进行开发,首先根据单增李斯特菌hly A基因序列保守区设计2对引物,在同一体系中对单增李斯特菌的RNA进行反转录及环介导等温扩增,同时使用羟基萘酚蓝(终浓度200μM)作为反转录环介导等温扩增产物的指示剂,在不开盖进行凝胶电泳检测的情况下,可直接根据体系颜色变化判读结果,能够在20 h内(包括增菌时间)检测出样本中是否存在单增李斯特菌的RNA。本研究建立的RT-LAMP-HNB检测方法对单增李斯特菌RNA的检出限为5.8×10^-3μg/m L,起始接种浓度检出限为10 CFU/10 mL,灵敏度是RT-PCR的10倍,且能够检测出是牛奶中否存在的单增李斯特活菌,具有实际应用价值。本研究开发的检测方法具有快速、准确、便捷、灵敏度高等特点,适用于在基层或不便利地区推广使用。

关键词：单增李斯特菌反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP) 羟基萘酚蓝(HNB) hlya基因快速检测

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

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中国水产科学 2007年第5期14卷 749-755页

作者：饶静静李寿崧黄克和江树勋潘群兴南京农业大学动物医学院福建出入境检验检疫局

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlya)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S r... 详细信息

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlya)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlya和aerA,而致病性分离株则至少含有hlya基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。

关键词：嗜水气单胞菌 hlya基因 aerA基因多重PCR

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四重PCR检测致病性嗜水气单胞菌

中国人兽共患病学报 2013年第6期29卷 587-593页

作者：韦信贤杨先乐童桂香吴祥庆谢宗升黄国秋廖永志叶欣宇黎小正广西水产研究所南宁530021 上海海洋大学水产与生命学院国家水生动物病原库上海201306

目的建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的四重PCR方法。方法根据致病性嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶(ahpA)基因、气溶素(aerA)基因和溶血素(hlya)基因的保守序列以及嗜水气单胞菌的16SrRNA基因种属特异性序列分别设计4对特... 详细信息

目的建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的四重PCR方法。方法根据致病性嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶(ahpA)基因、气溶素(aerA)基因和溶血素(hlya)基因的保守序列以及嗜水气单胞菌的16SrRNA基因种属特异性序列分别设计4对特异性引物,通过优化各引物浓度、退火温度和Mg2+浓度,确定了四重PCR的最佳反应条件;然后进行特异性和敏感性试验,并比较其与常规微生物学方法对不同菌株和临床样本的检出率。结果该方法特异性好,能特异性检测并鉴别出嗜水气单胞菌致病性菌株;检测灵敏度高,最低可检测到约100fg的嗜水气单胞菌基因组DNA;对9株嗜水气单胞菌的检测结果与常规微生物学方法一致,对56份送检的水产动物样品的检出率为21.4%,高于常规微生物学方法的16.1%,两者检测结果符合率为94.6%。结论成功建立了能同时检测嗜水气单胞菌16SrRNA、aerA、ahpA和hlya基因的四重PCR方法,能快速、准确地对嗜水气单胞菌进行检测并区分致病性与非致病性菌株。

关键词：嗜水气单胞菌 16S rRNA基因 ahpA基因 aerA基因 hlya基因四重PCR