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口腔医学研究 2023年第7期39卷 594-601页

作者：樊紫萱乔里赖扬帆王鹏蒋代仁梁燕叶朝阳罗鹏贵州医科大学公共卫生与健康学院贵州贵阳550025 贵州医科大学附属医院临床医学研究中心贵州贵阳550025 贵州医科大学附属口腔医院牙体牙髓科贵州贵阳550025

目的:初步探讨hit基因对变异链球菌生长和致龋力的影响。方法:通过同源重组构建变异链球菌hit基因缺陷株(Δhit)、hit基因回补株(ΔhitC、ΔhitC-eGFP);观察不同pH下Smu.Δhit、Smu.ΔhitC和ATCC25175模式菌株生长曲线;通过结晶紫染色... 详细信息

目的:初步探讨hit基因对变异链球菌生长和致龋力的影响。方法:通过同源重组构建变异链球菌hit基因缺陷株(Δhit)、hit基因回补株(ΔhitC、ΔhitC-eGFP);观察不同pH下Smu.Δhit、Smu.ΔhitC和ATCC25175模式菌株生长曲线;通过结晶紫染色、蒽酮染色、扫描电镜等实验,比较生长、生物膜形成、粘附、菌体形态差异及耐酸特性;通过人工龋实验,在体外模拟菌株对牙釉产生龋样损坏的差异。结果:成功构建Smu.Δhit、Sum.ΔhitC和Smu.ΔhitC-eGFP菌株;观察发现Smu.Δhit较ATCC25175菌株生长迅速,随着pH值降低,Smu.Δhit生长受到部分抑制,ATCC25175则完全被抑制;Smu.Δhit菌体呈“椭圆球状平铺附着”分散在牙釉面上,胞外生物膜量较少;Smu.Δhit造成的龋样损坏明显强于ATCC25175。结论:hit基因调控变异链球菌生长繁殖,Smu.Δhit缺陷株生长速率显著高于亲本株,更耐受酸性环境,对人牙釉面破坏性更强。

关键词：变异链球菌 ATCC25175 hit基因致龋力 hit-样蛋白

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变异链球菌临床菌株分离鉴定及其hit基因致龋性影响的初步研究

变异链球菌临床菌株分离鉴定及其hit基因致龋性影响的初步研究

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作者：王鹏贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:通过从临床患者口腔中直接分离鉴定的变异链球菌株作为亲本实验株,构建hit基因缺陷菌株,以此来研究NCBI所推定hit基因的细菌周期调控功能,并初步探讨hit基因对变异链球菌相关致龋特性包括产酸、耐酸及生物膜形成等的影响。方法:1.... 详细信息

目的:通过从临床患者口腔中直接分离鉴定的变异链球菌株作为亲本实验株,构建hit基因缺陷菌株,以此来研究NCBI所推定hit基因的细菌周期调控功能,并初步探讨hit基因对变异链球菌相关致龋特性包括产酸、耐酸及生物膜形成等的影响。方法:1.在临床上采集患者龈上菌斑,采用MSA(含杆菌肽和1%亚帝酸钾)选择性培养基厌氧培养筛选,通过菌落形态观察、革兰氏染色、细菌生化反应及以分子生物学为基础的变异链球菌hit基因片段PCR扩增测序,对临床分离的变异链球菌进行鉴定,为下一步研究提供实验菌株。2.通过本课题组前期构建的重组质粒p FW5:hit-UP-p FW5-Down,将其线性化处理后转入由感受刺激肽CSP刺激形成的变异链球菌临床分离株感受态后进行同源重组,然后通过1.0 mg/m L高浓度的壮观霉素抗性筛选,并结合PCR产物电泳和Sanger法测序,鉴定筛选变异链球菌临床菌株hit基因缺陷株。3.在p H 7.0±0.3的BHI培养基中,比较变异链球菌临床分离株及其hit基因缺陷株的生长能力,并以课题组前期构建的模式菌株变异链球菌ATCC25175及其hit基因缺陷株作为对照,每组菌株菌液过夜培养,用新鲜BHI培养基(p H7.0±0.3)调至0.5麦氏比浊度(约1.0～2.0 x 10CFU/m L),按1:9(v/v)分别加入至p H 7.0±0.3 BHI培养基中,37℃厌氧培养至少48h,期间每隔1h或2h取出测OD值,根据测出数值绘制生长曲线。4.耐酸试验:以变异链球菌临床分离株hit基因缺陷株为实验组,其亲本临床分离菌株为对照组,两组菌株菌种液过夜培养,用新鲜BHI培养基(p H 7.0±0.3)调至0.5麦氏比浊度,按1:9(v/v)分别加入至p H 4.8 BHI培养基中,37℃厌氧培养至少48h,期间每隔1h或2h取出测OD值,根据测出数值绘制生长曲线。5.产酸试验:两菌株菌液过夜培养,用新鲜BHI培养基(p H 7.0±0.3)调至0.5麦氏比浊度,按1:100(v/v)比例加入到含3%(w/v)蔗糖BHI培养基内,37℃厌氧条件培养,12h和24h后取出离心,测上清液p H值。6.细菌生物膜结晶紫染色定量观察:采用细胞培养96孔板,6行(12孔/行)加入含3%蔗糖BHI液体培养基,按1:9(v/v)比例加入两菌株菌液(用BHI稀释到0.5麦氏浓度),37℃厌氧培养24h后取出,弃菌液,PBS缓冲液漂洗3次,干燥,每孔加入0.1%(w/v)结晶紫溶液100μL,染色20min,吸出染色液,PBS漂洗3次,干燥,每孔加入200μL 95%乙醇溶解结晶颗粒,轻微振荡30min后酶标仪上测OD值。结果:1.随机从MSA板上挑取5个菌斑,经过菌体形态观察、革兰氏染色、细菌生化试验及分子生物学鉴定为变异链球菌,Sanger测序结果为:UA159型变异链球菌株。2.变异链球菌临床分离菌株(UA159)通过转入线性化重组质粒p FW5:hit-UP-p FW5-Down转入进行同源重组,多次1.0 mg/m L高浓度壮观霉素抗性筛选,经hit基因PCR扩增产物电泳和Sanger测序,筛选鉴定出变异链球菌hit基因缺陷株。3.在p H7.0±0.3的BHI培养基中,变异链球菌临床分离株及其hit基因缺陷株在经历近7h迟缓期后几乎同时进入对数期,其亲本菌株约4h后进入稳定期,而hit基因缺陷株持续增长约10h进入稳定期。作为对照的模式菌株ATCC25175迟缓期较长,其hit基因缺陷株则早于亲本菌株进入对数生长期。最后,变异链球菌临床分离株和模式参考菌株ATCC25175两者对应的hit基因缺陷株OD值在20h后逐渐趋于相同。4.在酸性环境p H 4.8的BHI培养基中,变异链球菌临床分离菌hit基因缺陷株仍在约7h迟缓期后进入对数期生长,总体OD值均有所减少,生长速度也受酸性环境影响有所抑制,亲本菌株生长则完全被抑制。5.12h培养后,变异链球菌临床分离株的hit基因缺陷株菌液p H值约为6.30,比临床株较高(p H约4.39,Phit基因缺陷株菌液p H值约为5.02,仍比临床株较高(p H约4.26,Phit基因缺陷株在24h后形成的生物膜量明显低于临床株(P基因同源重组方法成功构建hit基因缺陷型菌株。***基因编码的hit蛋白可抑制细菌快速生长繁殖。***基因缺失后可导致变异链球菌的耐酸性增加,但其糖酵解产酸能力及生物膜形成能力均降低。

关键词：变异链球菌 hit基因同源重组产酸耐酸生物膜

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hit基因对变异链球菌致龋能力的影响及调控机制研究

hit基因对变异链球菌致龋能力的影响及调控机制研究

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中国毒理学会第十次全国毒理学大会

作者：樊紫萱胡婷叶朝阳罗鹏贵州医科大学公共卫生与健康学院贵州医科大学附属医院

目的 hit基因在变异链球菌中的功能尚未明确,本研究旨在初步探讨hit基因对变异链球菌致龋能力的影响及其基因调控的分子机制。方法 1.通过同源重组构建变异链球菌hit基因缺陷株(Δhit)、hit基因回补株(ΔhitC);2.观察48 h不同pH下Δhit... 详细信息

目的 hit基因在变异链球菌中的功能尚未明确,本研究旨在初步探讨hit基因对变异链球菌致龋能力的影响及其基因调控的分子机制。方法 1.通过同源重组构建变异链球菌hit基因缺陷株(Δhit)、hit基因回补株(ΔhitC);2.观察48 h不同pH下Δhit、ΔhitC和ATCC25175野生菌株生长曲线;3.通过生物膜结晶紫染色试验、蒽硫染色试验、扫描电镜等实验手段,比较Δhit、ΔhitC和ATCC25175的生物膜量、形态结构和粘附力差异;4.通过人工龋试验,在体外模拟对牙产生的龋样损坏的差异;5.通过荧光定量PCR技术,比较Δhit和ATCC25175生物膜相关基因转录水平表达差异。结果 1.成功构建Δhit和ΔhitC;2.观察48 h生长曲线可发现Δhit较ATCC25175相比,生长迅速,随着pH值降低,Δhit受到部分抑制,仍可继续生长,ATCC25175则受到明显抑制,在pH5.6培养基中无法生存;3.Δhit生物膜结构呈均匀疏松状,粘附力降低,生物膜形成量减少;4.Δhit造成的龋样损坏明显强于ATCC25175;5. hit基因缺失后,生物膜形成基因gtfB、gtfC、gtfD等表达降低,下游目标基因表达水平上升。结论 hit基因影响变异链球菌生长速率,改变生物膜状态及生物膜形成量,对酸性耐受度显著改变,且相关基因表达改变,从而影响变异链球菌的致龋能力。

关键词：变异链球菌 ATCC25175 龋病 hit基因

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变异链球菌hit基因缺陷菌株的构建

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口腔疾病防治 2021年第12期29卷 801-808页

作者：赖扬帆王鹏乔里刘中静叶朝阳梁燕贵州医科大学附属口腔医院牙体牙髓科贵州贵阳550004 贵州医科大学附属医院临床医学研究中心贵州贵阳550004

目的构建hit基因缺陷型变异链球菌株并验证其细胞周期调控的功能。方法从变异链球菌株ATCC25175中提取基因组DNA,采用PCR扩增技术,将hit基因上下游片段克隆到pFW5质粒(壮观霉素抗性)上以构建重组质粒;利用该菌株天然遗传转化机制,将线... 详细信息

目的构建hit基因缺陷型变异链球菌株并验证其细胞周期调控的功能。方法从变异链球菌株ATCC25175中提取基因组DNA,采用PCR扩增技术,将hit基因上下游片段克隆到pFW5质粒(壮观霉素抗性)上以构建重组质粒;利用该菌株天然遗传转化机制,将线性化重组质粒转入由其感受刺激多肽(competence stimulating peptide,CSP)刺激产生变异链球菌感受态中,进行同源重组;再通过壮观霉素抗性筛选,结合PCR产物电泳和Sanger法测序,筛选鉴定hit基因缺陷型变异链球菌株;最后在BHI培养基中培养,检测其生长速率。结果从ATCC25175变异链球菌基因组DNA中,克隆hit基因上游约856 bp、下游约519 bp片段到pFW5质粒的两个多克隆位点区间(MCS⁃I和MCS⁃II),经双酶切和PCR测序鉴定,得到重组质粒pFW5_hit_Up_Down。线性化该重组质粒,转入由CSP刺激产生变链感受态中进行同源重组;再通过壮观霉素BHI培养基多次抗性筛选,hit基因片段的PCR产物电泳和Sanger测序筛选出hit基因缺陷变异链球菌株,该缺陷菌株较其亲本菌株生长更快速(Phit基因缺陷变异链球菌株,hit基因产物调控变异链球菌生长周期。

关键词：变异链球菌 hit基因 pFW5质粒天然遗传转化同源重组 hit基因缺陷突变菌株细菌生长周期调控

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