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作者：谢敏重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分hipsc-cms生物学特性检测目的检测hipscs诱导成为hipsc-cms前后细胞形态和标志物的变化以及线粒体形态的改变。方法hipscs通过专用培养基维持细胞干性,进行细胞扩增;当hipscs长至一定密度,通过在第0天添加含GSK3抑制剂（CHIR99... 详细信息

第一部分hipsc-cms生物学特性检测目的检测hipscs诱导成为hipsc-cms前后细胞形态和标志物的变化以及线粒体形态的改变。方法hipscs通过专用培养基维持细胞干性,进行细胞扩增;当hipscs长至一定密度,通过在第0天添加含GSK3抑制剂（CHIR99021）培养基、第2天换无胰岛素B27培养基、第3天添加含Wnt通路抑制剂（IWP2）培养基、第5天换无胰岛素B27培养基、第7天换含胰岛素B27培养基、第14天含乳酸钠培养基进行纯化、第17天进行重接种,来进行hipsc-cms诱导。并通过免疫荧光对hipscs干性因子和hipsc-cms心肌相关标志物进行检测;RT-q PCR检测hipsc-cms肌钙蛋白TNNI1、TNNI3和肌球蛋白重链MYH6、MYH7的表达;Mito Traker检测hipscs和hipsc-cms细胞内线粒体形状和分布情况;JC-1检测hipscs和hipsc-cms线粒体膜电位;电镜检测hipscs和hipsc-cms细胞线粒体形态。观察hipscs和hipsc-cms细胞形态和不同标志物的表达,以及线粒体形态结构和膜电位的变化。结果hipscs胞体小而呈圆形,细胞核位于中央,细胞间紧密排列形成细胞团块,细胞团边缘光滑,细胞表达干性因子Nanog和SOX2;hipsc-cms在第7天开始跳动,重接种后可观察到单个细胞搏动,免疫荧光和RT-q PCR结果显示hipsc-cms表达心肌相关标志物c Tn T、Cx43、α-actinin以及肌钙蛋白TNNI1、TNNI3,肌球蛋白重链MYH6、MYH7;Mito Traker结果显示hipscs线粒体呈散在点状分布于胞质中,hipsc-cms线粒体由点状变为线状或网络状环绕于核周;JC-1结果显示hipscs经诱导后线粒体膜电位红色荧光增强;电镜结果显示hipscs线粒体体积较小,嵴疏松,hipsc-cms细胞中线粒体体积增大长度变长且嵴变丰富。结论hipscs具有多能性可进行诱导;经诱导后形成的hipsc-cms表现出心肌细胞样特征;诱导过后细胞形态、线粒体结构均发生了很大转变。第二部分齐墩果酸介导丙酮酸激酶同工型转换促进hipsc-cms成熟目的探究齐墩果酸在hipsc-cms成熟过程中的作用。方法CCK8检测hipsc-cms加入齐墩果酸（OA）后的细胞活性,WB检测丙酮酸激酶M1型（PKM1）与丙酮酸激酶M2型（PKM2）的表达以确定药物浓度用于后续实验;将hipsc-cms分为三组:Control组、DMSO组和OA加药组,用最适药物浓度和同等DMSO处理细胞用于后续实验;对三组细胞α-actinin免疫荧光染色进行细胞大小、形态和肌节长度分析;WB对三组细胞PKM1、PKM2、MFN2的表达进行检测;RT-q PCR对心肌相关基因TNNI3、MYH6、MYH7进行检测;Mito Traker对细胞线粒体形态结构进行观察;JC-1对细胞线粒体膜电位进行观察;电镜对三组细胞线粒体超微结构进行观察;EDU检测细胞增殖情况;流式细胞技术检测细胞周期变化。结果细胞活性检测和WB检测PKM1和PKM2蛋白表达确定10umol/L为OA的最适药物浓度;免疫荧光结果显示,加入OA后hipsc-cms细胞面积增大、细胞圆度指数降低、肌节长度增加;WB结果显示,OA加药组PKM1/PKM2比值和MFN2表达增加;RT-q PCR结果显示OA加药组心肌相关基因TNNI3、MYH6、MYH7表达增加;Mito Traker结果显示,对照组线粒体多为线状散在分布,OA加药组线粒体形成更为成熟的的网状结构;JC-1结果显示OA加药组线粒体膜电位有所增强;电镜下可观察到与对照组相比,OA加药组线粒体更为细长且有线粒体融合趋势;EDU结果显示OA加药组细胞增殖降低;细胞周期结果显示OA加药组多核细胞占比上升,而单核细胞的比例下降。结论加入OA后,hipsc-cms细胞形态和肌节结构向更成熟发展,心肌相关蛋白和基因表达也说明加药后细胞更加成熟。而线粒体形态结构的变化也说明OA可促进hipsc-cms线粒体向更成熟方向发展;EDU结果显示OA加药组细胞增殖下降,但细胞周期结果显示OA加药组细胞多核数目细胞增多,说明OA加药组细胞多核化增多。这些结果均表明加入OA后促进了hipsc-cms的成熟。

关键词： hipscs hipsc-cms 线粒体齐墩果酸丙酮酸激酶

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PTEN-induced putative kinase 1 regulates mitochondrial quality control and is essential for the maturation of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

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Genes & Diseases 2023年第5期10卷 2151-2166页

作者： Huiwen Liu Yanting Sun Hao Xu Bin Tan Qin Yi Jie Tian Jing Zhu Department of Pediatric Research Institute Children's Hospital of Chongqing Medical UniversityChongqing 400014China Chongqing Key Laboratory of Pediatrics Chongqing 400014China Department of Clinical Laboratory Children's Hospital of Chongqing Medical UniversityChongqing 400014China Department of Cardiovascular(Internal Medicine) Children's Hospital of Chongqing Medical UniversityChongqing 400014China

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes(hipsc-cms)have attracted attention in the field of regenerative medicine due to their potential ability to repair damaged ***,the immature phenotype of these cells limits their clinical *** maturation is accompanied by changes in mitochondrial ***-induced putative kinase 1(PINK1)has been linked to mitochondrial quality ***,whether the changes in mitochondrial quality in hipsc-cms are associated with PINK1,and the impact of PINK1 on hipsc-cms development are not *** this study,we found that knockdown of PINK1 in hipsc-cms resulted in mitochondrial fragmentation and impaired mitochondrial functions such as mitophagy and mitochondrial ***1 deletion also inhibited the maturation of hipsc-cms,reverting them to a naive structural and functional *** found that restoring the mitochondrial structure did not completely rescue the mitochondrial dysfunction caused by PINK1 deletion,while activation of PINK1 kinase activity using kinetin promoted mitochondrial fusion,increased the mitochondrial membrane potential and ATP production,and maintained the development and maturation of *** conclusion,PINK1 regulates the mitochondrial structure and function of hipsc-cms,and is essential for the maturation of hipsc-cms.

关键词： hipsc-cms hipscs Maturation Mitochondrial quality PINK1

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Magnesium lithospermate B enhances the potential of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair

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Chinese Medical Journal 2024年第15期137卷 1857-1869页

作者： Chengming Fan Kele Qin Chukwuemeka Daniel Iroegbu Kun Xiang Yibo Gong Qing Guan Wenxiang Wang Jun Peng Jianjun Guo Xun Wu Jinfu Yang Department of Cardiovascular Surgery The Second Xiangya HospitalCentral South UniversityChangshaHunan 410011China Department of Pharmacology Xiangya School of Pharmaceutical SciencesCentral South UniversityChangshaHunan 410078China Hunan Fangsheng Pharmaceutical Co. Ltd.ChangshaHunan 410000China Department of Thoracic Surgery The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of MedicineCentral South UniversityChangshaHunan 41000China

Background:We previously reported that activation of the cell cycle in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes(hipsc-cms)enhances their remuscularization capacity after human cardiac muscle patch transplantation in infarcted mouse ***,we sought to identify the effect of magnesium lithospermate B(MLB)on hipsc-cms during myocardial repair using a myocardial infarction(MI)mouse ***:In C57BL/6 mice,MI was surgically induced by ligating the left anterior descending coronary *** mice were randomly divided into five groups(n=10 per group);a MI group(treated with phosphate-buffered saline only),a hipsc-cms group,a MLB group,a hipsc-cms+MLB group,and a Sham operation *** function and MLB therapeutic efficacy were evaluated by echocardiography and histochemical staining 4 weeks after *** identify the associated mechanism,nuclear factor(NF)-κB p65 and intercellular cell adhesion molecule-1(ICAM1)signals,cell adhesion ability,generation of reactive oxygen species,and rates of apoptosis were detected in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)and ***:After 4 weeks of transplantation,the number of cells that engrafted in the hipsc-cms+MLB group was about five times higher than those in the hipsc-cms ***,MLB treatment significantly reduced tohoku hospital pediatrics-1(THP-1)cell adhesion,ICAM1 expression,NF-κB nuclear translocation,reactive oxygen species production,NF-κB p65 phosphorylation,and cell apoptosis in HUVECs cultured under ***,treatment with MLB significantly inhibited the apoptosis of hipsc-cms via enhancing signal transducer and activator of transcription 3(STAT3)phosphorylation and B-cell lymphoma-2(BCL2)expression,promoting STAT3 nuclear translocation,and downregulating BCL2-Associated X,dual specificity phosphatase 2(DUSP2),and cleaved-caspase-3 expression under ***,MLB significantly suppressed the production of malondialdehyde and lactat

关键词： Myocardial infarction Cell therapy Induced pluripotent stem cells Magnesium lithospermate B Cardiomyocyte Disease modeling hipsc-cms

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转录因子Tbx18诱导人源性心肌细胞向窦房结样起搏细胞转化的研究

转录因子Tbx18诱导人源性心肌细胞向窦房结样起搏细胞转化的研究

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作者：张伟武汉大学

学位级别：硕士

目的:将人转录因子Tbx18腺病毒转染至人诱导多能干细胞来源心肌细胞(hipsc-cms),探究转录因子Tbx18能否诱导人源性心肌细胞(hipsc-cms)向窦房结样起搏细胞(SANLPCs)转化。方法:首先阶段性调控WNT/β-catenin信号通路诱导人诱导多能干细... 详细信息

目的:将人转录因子Tbx18腺病毒转染至人诱导多能干细胞来源心肌细胞(hipsc-cms),探究转录因子Tbx18能否诱导人源性心肌细胞(hipsc-cms)向窦房结样起搏细胞(SANLPCs)转化。方法:首先阶段性调控WNT/β-catenin信号通路诱导人诱导多能干细胞(hipscs)向心肌细胞定向分化,随后通过乳酸代谢法对心肌细胞进行纯化;利用RT-qPCR检测hipscs向心肌细胞分化过程中各阶段(干细胞阶段、中胚层、心脏中胚层、心脏祖细胞、心肌细胞阶段)特异性标记基因的表达情况;在分化第14天通过细胞免疫荧光染色或RT-qPCR检测心肌细胞标记物表达、流式细胞术检测心肌细胞分化效率,然后将纯化的hipsc-cms随机分为hipsc-cms组、GFP-cms组以及Tbx18-cms组,hipsc-cms组不转染腺病毒,GFP-cms组和Tbx18-cms组分别转染GFP腺病毒和转染Tbx18腺病毒,每天观察各组细胞形态及搏动频率变化,转染病毒5-7天后通过RT-qPCR、蛋白免疫印迹和流式细胞术检测各组工作心肌细胞和窦房结起搏细胞(SANPCs)特异性基因或蛋白表达情况;利用免疫荧光技术检测GFP-cms组和Tbx18-cms组HCN4、NKX2.5、cTNT表达;最后通过膜片钳技术记录细胞电生理特征。结果:hipscs向心肌细胞分化的第7-9天开始出现微弱的搏动,在第12-14天表现为明显且稳定的搏动,搏动频率在60-140次/分;RT-qPCR检测结果表示hipscs向心肌细胞分化过程中规律性表达各阶段的特征性标记基因;免疫荧光技术和流式细胞术结果表明hipsc-cms表达cTNT,流式细胞术检测结果表明,hipsc-cms纯化后cTNT阳性率(即分化效率)约为90%;纯化的hipsc-cms经转染病毒5-7天后,Tbx18-cms组Tbx18的表达明显高于其余两组(Pcms组细胞搏动频率也显著高于hipsc-cms组和GFP-cms组;与hipsc-cms组和 GFP-cms 组相比,Tbx18-cms 组 Tbx3、Hcn1、Hcn4、Cx30.2、Cx45 的表达水平明显上调(P0.05);全细胞膜片钳技术检测显示,Tbx18-cms组中能记录到类似起搏细胞的动作电位以及受伊伐布雷定抑制的If起搏电流。结论:(1)阶段性调控经典WNT/β-catenin信号通路能高效诱导hipscs向心肌细胞定向分化;(2)转录因子Tbx18能将hipsc-cms重编程为窦房结样起搏细胞,这为利用hipsc-cms构建生物起搏器提供了一种新的可能。

关键词： hipsc-cms Tbx18 重编程窦房结样起搏细胞生物起搏

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hipscs心肌分化过程中线粒体代谢与调控研究

hiPSCs心肌分化过程中线粒体代谢与调控研究

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作者：周琴重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分hipscs分化为心肌细胞后线粒体代谢及蛋白表达变化目的:观察hipscs分化为hipsc-cms后线粒体代谢变化与PGC-1α及其下游氧化代谢相关蛋白表达的相关性。方法:（1）应用PGM1人多潜能干细胞培养基复苏培养hipscs,并每天更换培养基... 详细信息

第一部分hipscs分化为心肌细胞后线粒体代谢及蛋白表达变化目的:观察hipscs分化为hipsc-cms后线粒体代谢变化与PGC-1α及其下游氧化代谢相关蛋白表达的相关性。方法:（1）应用PGM1人多潜能干细胞培养基复苏培养hipscs,并每天更换培养基;使用免疫荧光染色和流式细胞仪检测hipscs的多能标志物表达情况。（2）用时序性短暂激活/抑制Wnt信号通路的方法诱导hipscs分化为心肌细胞;倒置显微镜下观察细胞生长状态;使用qRT-PCR、免疫荧光染色和流式细胞仪检测hipsc-cms心肌特异性标志物表达情况。（3）实验分为两组:hipscs组与hipsc-cms组,采用线粒体压力测试试剂盒检测耗氧率（OCR）;使用ATP检测试剂盒和JC-1探针分别检测细胞内ATP含量与线粒体膜电位;使用透射电镜和Mitotracker Red染色观察线粒体形态;使用Western blot检测PGC-1α及其下游氧化代谢相关蛋白表达水平。结果:（1）hipscs呈集落生长,集落边缘光滑,细胞排列紧密,增殖速度较快。免疫荧光学染色检测结果显示hipscs表达多能性标志物OCT4、SOX2、SSEA-4和TRA-1-60,流式细胞仪检测OCT4阳性表达量为95%。（2）诱导培养的第8-10天观察到hipsc-cms的开始跳动,第12天可观察到剧烈的自发搏动。qRT-PCR结果显示hipsccms表达心肌特异性标志物TNNT2与MYH6;免疫荧光染色结果显示hipsc-cms心肌结构标志物cTnT、α-actinin和Cx43表达呈阳性;流式分析结果显示hipsc-cms的cTnT阳性表达率达98.6%。（3）与hipscs相比,hipsc-cms的基础呼吸、最大呼吸、ATP关联呼吸以及非线粒体呼吸的OCR值增高,ATP含量与线粒体膜电位增高;线粒体形态发生改变,hipscs中线粒体主要为颗粒状,hipsc-cms中为杆状;PGC-1α及其下游转录因子NRF1、ERRα和涉及三羧酸循环、氧化磷酸化、脂肪酸氧化和线粒体丙酮酸转运等代谢途径的线粒体蛋白表达均显著增高。结论:（1）我们成功诱导未分化的hipscs特异性分化为表达心肌特异性标志物的cms。（2）hipscs分化为hipsc-cms后线粒体呼吸功能的增强与PGC-1α及其下游氧化代谢相关蛋白表达呈正相关。第二部分PGC-1α调控hi PSC-cms线粒体代谢的作用及其可能机制目的:探讨PGC-1α调控hi PSC-cms线粒体代谢作用及其可能机制。方法:（1）使用PGC-1α-siRNA转染hi PSC-cms,q RT-PCR和Western blot检测PGC-1α的表达情况,并使用线粒体压力测试试剂盒检测耗氧率（OCR）。（2）以不同浓度ZLN005处理hi PSC-cms,q RTPCR和Western blot检测PGC-1α表达情况,CCK8实验检测细胞活性,筛选出最佳工作浓度并用于后续实验。将实验分为两组:对照组和ZLN005组,使用最佳工作浓度的ZLN005处理hi PSC-cms,应用线粒体压力测试试剂盒检测耗氧率（OCR）,使用JC-1检测线粒体膜电位,倒置显微镜下观察并记录hi PSC-cms搏动频率,使用Mitotracker Red染色观察线粒体形态并分析荧光强度以反映线粒体数量,q RT-PCR和Western blot检测代谢相关基因表达情况。（3）q RT-PCR和Western blot检测PGC-1α-siRNA对ERRα表达的影响;Co-IP检测PGC-1α与ERRα的蛋白相互作用;实验分为三组:对照组,ZLN005组和ZLN005+XCT790组,在ZLN005激活PGC-1α的同时使用XCT790抑制ERRα蛋白表达,通过线粒体压力测试和Western blot分别检测线粒体呼吸功能与蛋白表达情况。结果:（1）使用PGC-1α-siRNA有效敲低hi PSC-cms的PGC-1α表达并抑制基础呼吸、ATP关联呼吸以及非线粒体呼吸的耗氧率。（2）8μmol/L为ZLN005的最佳工作浓度,能有效激活PGC-1α表达且无细胞毒性;与对照组相比,ZLN005组的基础呼吸、最大呼吸、ATP关联呼吸和非线粒体呼吸的耗氧率、线粒体膜电位、搏动频率和线粒体数量增高,线粒体形态变为网络状散在分布于胞质中。q RT-PCR和Western blot结果显示ZLN005促进线粒体融合基因表达,抑制线粒体分裂基因表达;ZLN005促进PGC-1α下游转录因子NRF1、ERRα和CPT-1α/β、CS、COXⅣ、COX5B、Cyt C和MPC1等线粒体关键蛋白的表达。（3）在hi PSC-cms中,PGC-1α-siRNA诱导ERRα表达降低,另外PGC-1α能

关键词： hipscs hipsc-cms 心肌分化线粒体代谢 PGC-1α hi PSC-cms 代谢成熟线粒体 ERRα

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DPP6在不同动物种属心脏中的表达

DPP6在不同动物种属心脏中的表达

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作者：王婵娟河北医科大学

学位级别：硕士

瞬时外向钾电流(I)是心肌细胞动作电位复极1期的主要成分,能影响动作电位形态和动作电位时程。瞬时外向钾通道由孔区亚单位Kv4(Kv4.3或Kv4.2)形成的同源四聚体和辅助亚单位共同构成,目前比较公认的辅助亚单位是钾通道相互作用蛋白2(KChI... 详细信息

瞬时外向钾电流(I)是心肌细胞动作电位复极1期的主要成分,能影响动作电位形态和动作电位时程。瞬时外向钾通道由孔区亚单位Kv4(Kv4.3或Kv4.2)形成的同源四聚体和辅助亚单位共同构成,目前比较公认的辅助亚单位是钾通道相互作用蛋白2(KChIP2)和二肽基肽酶样蛋白亚型6(DPP6)。KChIP2在心脏表达分布以及在I通道中的功能已有较深入的了解,DPP6为单次跨膜蛋白,最初发现于中枢神经,能够加速Kv4电流的衰减和通道的复活。近年有报道,DPP6基因突变可引发家族特发性室颤(idiopathic ventricular fibrillation),我们前期的实验发现,DPP6中介通道调节剂NS5806对不同种属动物I不同的药理反应,提示DPP6辅助亚单位在心脏I通道的重要作用。然而目前DPP6在动物心脏的表达分布情况了解甚少。已知DPP6存在多种剪接异构体,其中最常见的是DPP6-L(长)和DPP6-S(短)两种剪接体。本课题检测DPP6-L和DPP6-S在不同动物种属心脏、心脏不同区域的表达情况,预期为揭示DPP6的生理功能提供实验依据。方法:1.首先利用qRT-PCR方法,检测DPP6-L和DPP6-S在小鼠左心室中的mRNA表达。因为先期发现DPP6的mRNA在脑组织中有显著表达,因此本实验以小鼠的脑组织作为阳性对照。PCR引物基于N端胞内域不同的序列设计。2.利用Western blot方法,观察DPP6-L和DPP6-S在小鼠、大鼠、兔、犬心脏(不同部位)以及人诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞(hipsc-cms)中蛋白的表达。本实验所用的抗体是兔抗人DPP6的31666氨基酸残基的多克隆抗体,可同时检测DPP6-L和DPP6-S。3.观察I调节剂NS5806对离体心脏QTc(心率矫正后的QT)间期的影响,进一步在功能上验证DPP6对于I通道的调节作用。成年SD大鼠,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,迅速开胸取出心脏,置Langendorff灌流装置灌流,记录心电图(相当于体表心电图的Ⅱ导)。稳定后观察10μM NS5806对心电图的影响,测量QT、RR间期,计算连续10个QRS波群的平均值,得出QTc(心率矫正后的QT)间期的变化。结果:***6在小鼠左心室的mRNA表达小鼠脑组织中DPP6-S的mRNA表达量较高,DPP6-L有一定的mRNA表达,这和之前的文献报道相一致。然而,DPP6-L和DPP6-S在小鼠的左心室中mRNA表达量都较低,几乎检测不到。***6在不同种属动物心脏的蛋白表达由于缺乏DPP6-L和DPP6-S两种亚型的特异性抗体,我们基于以往报道脑组织中有DPP6-L和DPP6-S两种亚型表达,以DPP6-S为主,以小鼠的脑组织作为阳性对照,在脑组织中的条带中低表达且分子量稍大的条带为DPP6-L,分子量约为115 KDa;高表达且分子量稍小的条带为DPP6-S,分子量约为105 KDa。结果表明,在小鼠脑组织中以DPP6-S表达为主,DPP6-L的表达较少,这和之前的文献报道相一致。在小鼠左心室中以DPP6-L表达为主,DPP6-S几乎不表达;在hipsc-cms中以DPP6-L的表达为主,DPP6-S表达较少;在犬的左心室中以DPP6-S的表达为主,很少的DPP6-L表达。已知心脏的I电流密度存在显著的区域差别,我们进一步检测了DPP6在心脏的不同部位的表达。结果表明,大鼠心脏(左室内膜下、中层和外膜下组织以及右心室、室间隔、心房),小鼠心脏(左室内膜下和外膜下组织以及右心室、室间隔、心房)以及兔心脏(左心室、右心室、左心房、右心房)等不同部位均以DPP6-L的表达为主,且其蛋白表达量在心脏不同部位并无显著性差异。***5806对Langendorff离体灌流大鼠心脏心电图的影响10μM NS5806显著延长大鼠离体ECG的QTc间期,从给药前的139ms延长到给药后的265 ms。给药前后采用配对t检验,求出均数和标准差,P<0.01,认为差别有统计学意义。结论:DPP6在动物心脏有显著的蛋白表达,但存在种属差异。大鼠、小鼠及兔心脏表达DPP6-L,人源心肌细胞同时表达DPP6-L和DPP6-S,但以前者为主;相反犬心室肌主要表达DPP6-S。大鼠、小鼠以及兔心脏不同部位的DPP6-L的表达无明显差别。

关键词： DPP6 动物种属 hipsc-cms NS5806 Ito

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