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人碱性成纤维细胞生长因子（hbfgf）cDNA的克隆和表达

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人碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF）cDNA的克隆和表达

作者：张昱大连医科大学

学位级别：硕士

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是纤维细胞生长因子家族成员之一,是一种广谱的促有丝分裂,血管形成和亲神经性细胞因子。人的碱性成纤维细胞生长因子(hbfgf)在多种生理及病理过程中发挥作用,包括能诱导... 详细信息

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是纤维细胞生长因子家族成员之一,是一种广谱的促有丝分裂,血管形成和亲神经性细胞因子。人的碱性成纤维细胞生长因子(hbfgf)在多种生理及病理过程中发挥作用,包括能诱导多种细胞分化、增殖,促进血管系统形成,损伤修复以及肿瘤生长。近年来,随着对hbfgf功能研究的深入,越来越多的临床科室与美容机构开始使用hbfgf治疗相应疾病和症状,并取得显著疗效。但随之而来的问题是,hbfgf的制剂相对昂贵,不能进行普及使用。同时hbfgf生物活性强,性质不稳定。因此,迫切需要新的工业方法,为大规模、低成本制备稳定的hbfgf提供条件。目前,重组hbfgf蛋白质的生产主要依靠大肠杆菌表达系统,但是,hbfgf的可溶性与稳定性较低,在溶液中很不稳定,静置后极易形成二聚体、三聚体甚至是多聚体,严重时出现明显的絮状沉淀,极大地影响蛋白质的活性;同时,非融合的hbfgf在原核细胞中的表达量低[1]。究其原因,一方面hbfgf的氨基酸序列中34、78、96与101位上存在4个半胱氨酸残基,容易形成分子间的二硫键而形成寡聚体(特别是二聚体),降低hbfgf的生物学活性;另一方面,hbfgf基因中的一些密码子对于大肠杆菌来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低。为了探索高表达hbfgf蛋白质的方法,研究其结构与功能的关系,我们首先要克隆编码hbfgf的cDNA,然后利用大肠杆菌表达hbfgf蛋白质,为进一步进行蛋白质结构改造,提高其稳定性和增强其活性提供条件。本论文的目的是:利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人

关键词：人碱性成纤维细胞生长因子 hbfgf 表达载体

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m-hbfgf在角膜损伤修复中的作用

牡丹江医学院学报 2006年第3期27卷 21-22页

作者：孟楠林媛牡丹江医学院药理实验室 157000

目的:探讨m-hbfgf在促进角膜损伤修复中的作用。方法:通过角膜穿通伤模型,检测用药后角膜伤口承受压力的极限值。结果:m-hbfgf组110.33±8.43和hbfgf组114.67±9.03均大于对照组75.33±13.66(P0.05)。结论:m-hbfgf有明确的促进角膜穿通... 详细信息

目的:探讨m-hbfgf在促进角膜损伤修复中的作用。方法:通过角膜穿通伤模型,检测用药后角膜伤口承受压力的极限值。结果:m-hbfgf组110.33±8.43和hbfgf组114.67±9.03均大于对照组75.33±13.66(Phbfgf组与m-hbfgf组比较无显著性差异(P>0.05)。结论:m-hbfgf有明确的促进角膜穿通伤伤口愈合的作用。在促进角膜穿通伤伤口愈合的作用方面,m-hbfgf和hbfgf无明显差异。

关键词： m—hbfgf hbfgf 角膜穿通伤修复

应用计算机软件辅助重组hbfgf基因的筛选

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现代生物医学进展 2006年第8期6卷 19-21页

作者：黄更生孙奋勇卜丹广东教育学院生物系广州510303 暨南大学生物工程研究所广州510632 广州华侨医院广州510630

目的:尝试通过计算机的辅助筛选基因重组组合,期望能减少人工筛选的工作量并得到高表达的蛋白。方法:从影响表达的两个因素即翻译起始区TIR的二级结构自由能和翻译起始区的密码子偏好性问题研究入手,对部分核苷酸进行了突变,利用RNA二... 详细信息

目的:尝试通过计算机的辅助筛选基因重组组合,期望能减少人工筛选的工作量并得到高表达的蛋白。方法:从影响表达的两个因素即翻译起始区TIR的二级结构自由能和翻译起始区的密码子偏好性问题研究入手,对部分核苷酸进行了突变,利用RNA二级结构预测软件DNASISv2.5对hbfgf的TIR区起始密码子开始前35个核苷酸进行了分析,筛选出预期表达量高的组合并在实验中加以验证。结果:从32种突变方式中筛选出10条自由能绝对值最低的序列做引物,克隆至表达载体上,得到了两株高表达菌株。结论:利用计算机辅助设计可以优化和筛选实验结果,提高工作效率,降低具体实验的工作量。

关键词：计算机 DNAsia2.5 hbfgf 自由能

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转基因大豆毛状根hbfgf的检测

解剖学研究 2009年第3期31卷 208-211页

作者：马冬雪王文娟惠金玲中国人民解放军空军总医院药学部北京100142 中国人民解放军空军466医院药剂科北京100089

目的通过检测转基因大豆毛状根的hbfgf,为利用毛状根生产药物实现工业化提供实验基础。方法采用PCR、RT-PCR、SDS-PAGE电泳、Westem blot印迹、质谱检测等方法,利用植物基因组DNA提取试剂盒,兔抗人bFGF单克隆抗体进行对转基因大豆毛状根... 详细信息

目的通过检测转基因大豆毛状根的hbfgf,为利用毛状根生产药物实现工业化提供实验基础。方法采用PCR、RT-PCR、SDS-PAGE电泳、Westem blot印迹、质谱检测等方法,利用植物基因组DNA提取试剂盒,兔抗人bFGF单克隆抗体进行对转基因大豆毛状根hbfgf检测。结果用PCR检测转基因大豆毛状根,并在60条Hyg抗性大豆毛状根中鉴定出19条大豆毛状根整合了hbfgf,阳性率为32%。半定量RT-PCR检测总RNA,表明RNA完整性好,降解较少。SDS-PAGE大致确定重组蛋白的分子量和浓度,分子量约18KDa,hbfgf含量可达110mg/L。兔抗人bFGF单克隆抗体检测表明,hbfgf在转基因大豆毛状根中稳定表达。结论表明转基因大豆毛状根能够稳定表达hbfgf基因,在工业生产中具有广阔的前景。

关键词：转基因大豆 hbfgf

pcDNA_3-hbfgf转染角朊细胞对真皮成纤维细胞增殖的生物学效应

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第四军医大学学报 1999年第5期20卷 395-398页

作者：胡大海陈璧汤朝武徐明达贾赤宇第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科

目的：观察含外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因的角朊细胞（ｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ＨＫ），对真皮成纤维细胞（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＨＤＦｉｂ）增殖的影响；探讨转ｈｂＦＧ... 详细信息

目的：观察含外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因的角朊细胞（ｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ＨＫ），对真皮成纤维细胞（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＨＤＦｉｂ）增殖的影响；探讨转ｈｂＦＧＦ基因ＨＫ对创面愈合的生物学效应及作用机理，为这种转基因ＨＫ细胞用于创面基因治疗的可行性提供实验依据．方法：收集含真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ的ＨＫ细胞培养上清，加入培养的ＨＤＦｉｂ细胞内；ＭＴＴ法测定细胞的增殖率、３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定细胞ＤＮＡ合成率、流式细胞仪分析细胞增殖周期．结果：加入转基因ＨＫ细胞培养上清的ＨＤＦｉｂ细胞，培养７２ｈ后，较正常对照组、加正常ＨＫ培养上清组、加转染空载体ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ的ＨＫ培养上清组，其细胞增殖分别增加１．０，１．５，３．０倍（Ｐ＜０．０１）；细胞ＤＮＡ合成率分别提高１．６，２．３，３．４倍（Ｐ＜０．０１）；ＨＤＦｉｂ细胞周期分析显示加入转基因ＨＫ细胞培养上清２４ｈ时细胞处于Ｓ期的比例较其余对照组增加明显，至７２ｈ时无差别．结论：转染ｈｂＦＧＦ基因真核表达质粒的ＨＫ细胞可以分泌活性物质促进ＨＤＦｉｂ细胞ＤＮＡ合成及增殖；机理为刺激ＨＤＦｉｂ进?

关键词： hbfgf 角朊细胞成纤维细胞增殖

外源性hbfgf cDNA 导入人角朊细胞及其表达

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第四军医大学学报 1999年第5期20卷 404-408页

作者：胡大海陈璧汤朝武苏映军王剑波金明贾赤宇徐明达第四军医大学

目的：观察外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因导入正常角朊细胞后，能否表达及分泌ｈｂＦＧＦ，并探讨其机理；为开展临床创面基因治疗提供实验依据和奠定物质基础．方法：采用脂质体包埋ｈｂＦＧＦｃＤＮＡ的真核表达... 详细信息

目的：观察外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因导入正常角朊细胞后，能否表达及分泌ｈｂＦＧＦ，并探讨其机理；为开展临床创面基因治疗提供实验依据和奠定物质基础．方法：采用脂质体包埋ｈｂＦＧＦｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ转染培养的人角朊细胞，经Ｇ４１８筛选、克隆、扩大及传代培养含转基因的角朊细胞．用特异性ｎｅｏ探针原位杂交显示转基因角朊细胞内含有拟转入的ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ质粒载体；抗ｈｂＦＧＦ抗体免疫细胞化学法观察转基因角朊细胞内ｈｂＦＧＦ的翻译表达；选择人真皮成纤维细胞为效应细胞，应用抗体中和法分析转基因角朊细胞分泌ｈｂＦＧＦ活性物质所引起的成纤维细胞增殖效应，了解ｈｂＦＧＦ向胞外分泌情况．结果：ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ可经脂质体介导有效地转入靶细胞角朊细胞内；用Ｇ４１８筛选纯化转基因后的角朊细胞内含转入的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ，胞浆内有阳性ｈｂＦＧＦ表达，并向胞外分泌ｈｂＦＧＦ活性物质，刺激真皮成纤维细胞增殖．结论：含外源性ｈｂＦＧＦ基因的角朊细胞可于体外纯化及扩大培养。

关键词：基因转染 hbfgf cDNA导入角朊细胞

人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的融合表达

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华东理工大学学报（自然科学版） 1997年第6期23卷 692-696页

作者：周宇荀魏东芝沈林南王二力华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

将人碱性成纤维细胞生长因子ｈｂＦＧＦ基因克隆于质粒ｐＧＥＸ，构建了融合蛋白ＧＳＴ－ＦＧＦ的表达质粒ｐＧＥＸ－ＦＧＦ，将ｐＧＥＸ－ＦＧＦ转化大肠杆菌ＤＨ５α，诱导培养后测得融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的２２％，每升发酵... 详细信息

将人碱性成纤维细胞生长因子ｈｂＦＧＦ基因克隆于质粒ｐＧＥＸ，构建了融合蛋白ＧＳＴ－ＦＧＦ的表达质粒ｐＧＥＸ－ＦＧＦ，将ｐＧＥＸ－ＦＧＦ转化大肠杆菌ＤＨ５α，诱导培养后测得融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的２２％，每升发酵液中可产生１８８ｍｇＧＳＴ－ＦＧＦ。纯化后的ＧＳＴ－ＦＧＦ用ＥＬＩＳＡ方法检测，证明它有ＦＧＦ的抗原性，以鼠ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３测得它具有ｂＦＧＦ的促细胞分裂活性。

关键词：融合蛋白 hbfgf FGF 大肠杆菌碱性蛋白质

大肠杆菌分泌型载体表达重组人碱性成纤维细胞生长因子

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华西药学杂志 1999年第5期14卷 319-322页

作者：袁涛张雪梅黄林李春阳王静王济源徐柳蒋丽明王艳王智杰徐秀珍成都生物制品研究所成都610063

设计构建了带有大肠杆菌外膜蛋白（ＯｍｐＡ）信号肽序列的重组分泌型表达载体ｐＳＥ－ｈｂＦＧＦ，在大肠杆菌ＤＨ５α中分泌表达了重组人碱性成纤维细胞生长因子（ｒｈｂＦＧＦ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹及生物活性测定均表明... 详细信息

设计构建了带有大肠杆菌外膜蛋白（ＯｍｐＡ）信号肽序列的重组分泌型表达载体ｐＳＥ－ｈｂＦＧＦ，在大肠杆菌ＤＨ５α中分泌表达了重组人碱性成纤维细胞生长因子（ｒｈｂＦＧＦ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹及生物活性测定均表明表达产物分泌到细菌细胞周质和培养基中。分泌到周质中的ｒｈｂＦＧＦ可占周质总蛋白的１５％。

关键词： hbfgf 大肠杆菌分泌表达载体表达

人碱性成纤维细胞生长因子基因克隆、cDNA5'端修饰及在大肠杆菌中的表达

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微生物学免疫学进展 2000年第2期28卷 42-45页

作者：张雪梅袁涛李春阳李清朗王智杰徐秀珍成都生物制品研究所成都610063

采用cDNA PCR技术 ,从人胎盘cDNA文库DNA中克隆了人碱性成纤维细胞生长因子 (hbfgf)基因。用PCR突变法对其 5 端序列进行修饰 ,将天然和修饰后的hbfgf基因分别克隆至表达载体 pBV2 2 1,免疫印迹和SDS PAGE结果证明 ,经修饰后的基因在... 详细信息

采用cDNA PCR技术 ,从人胎盘cDNA文库DNA中克隆了人碱性成纤维细胞生长因子 (hbfgf)基因。用PCR突变法对其 5 端序列进行修饰 ,将天然和修饰后的hbfgf基因分别克隆至表达载体 pBV2 2 1,免疫印迹和SDS PAGE结果证明 ,经修饰后的基因在大肠杆菌DH5α中获得了表达 ,表达量占菌体总蛋白的 9%。

关键词： hbfgf 基因克隆修饰基因表达细胞生长因子